CN103463168A - 抗骨质疏松的山茱萸有效部位群及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
抗骨质疏松的山茱萸有效部位群及其制备方法,本发明涉及抗骨质疏松的药物及其制备方法。本发明是为解决现有治疗骨质疏松的药物以西药为主,而西药对人体副作用大,且治疗效果也不佳的问题,本发明的制备得到总环烯醚萜苷的质量分数为85%~95%的有效部位群,其中莫诺苷的质量分数为40%~65%,马钱苷的质量分数15%~30%。方法:一、称取山茱萸药材煎煮后进行浓缩,得到浓缩药液;二、进行水提醇沉,得到水提醇沉浓缩液;三、预处理大孔吸附树脂,得到树脂柱;四、使水提醇沉浓缩液通过树脂柱,然后用乙醇洗脱,得到洗脱液;五、减压蒸馏回收步骤四得到的洗脱液中的乙醇,然后浓缩,最后减压干燥,得到山茱萸有效部位集物。
Description
技术领域
本发明涉及抗骨质疏松的药物及其制备方法。
背景技术
骨质疏松是中年以上患者最普遍的疾病之一并代表了最普遍的公共健康问题,超过50%的绝经期妇女和超过20%年龄大于50岁的男性患有此病。在全世界范围内,有超过2亿人患有骨质疏松,其中在欧洲、日本和美国就有7500万。每年有超过150万人因骨质疏松而引起的髋部、脊椎和腕部骨折。骨质疏松性骨折可导致高死亡率、高致残率,降低人的灵活性和生活质量。超过50%患有髋部骨折的妇女需要辅助设备进行日常生活活动,其中有20%的人会在一年内死去,还有相当一部分人需要长期照顾。由于人口老龄化在今后相当长的时期内必然将加大骨质疏松和骨折所带来的负担。鉴于问题的严重性,预防和治疗骨质疏松将是所有国家健康机构的主要任务之一。因此,研发防治骨质疏松的现代中药,将有重大的社会效益和经济效益。
针对骨质疏松症对中老年人健康和人类社会构成严重威胁,以及目前尚缺乏疗效确切且毒副作用小治疗药物的事实,以具有补肾作用的中药经典方剂六味地黄丸为切入点。六味地黄丸是传统的补肾药,主治小儿“五迟五软”,通过补肾作用研究,以及肾主骨的理论和六味地黄丸治疗骨质疏松的临床实践,山茱萸是其主要药物,将主治症定位于防治骨质疏松。以山茱萸防治骨质疏松为切入点,迅速、准确的锁定潜在药效物质基础,结合药效学验证及体外定向分离富集制备有效部位,进行治疗骨质疏松的中药新药研究。
在骨质疏松症的治疗方面目前尚缺乏有效的措施使骨质疏松症患者的骨量恢复正常,药物应用也十分有限,而且存在许多争议。例如国外一般列为首选的雌激素替代疗法虽然对绝经后骨质疏松症有一定的改善作用,但需长年服药(二年以上),其存在诱发生殖系统恶性肿瘤等严重副作用也已被证实。其它如钙剂、维生素D、氟化物等的治疗效果均受到质疑。因此研究实用、方便、科学有效的药物,仍然是广大学者探索的目标。中国传统医药在拥有大量临床实践和丰富诊疗经验的基础上,对骨质疏松症的防治作出了很多的贡献。中医理论认为肾藏精生髓主骨。肾肾精亏损,精不生髓,骨失所养,其本在肾。精充实则骨健化生有源,骨得其养则坚固有力;若肾精亏损则骨髓化生乏源,骨失其养就会出现骨骼脆弱,腰膝酸软等症状。故其治疗应以补肾为本。
发明内容
本发明是为解决现有治疗骨质疏松的药物以西药为主,而西药对人体副作用大,且治疗效果也不佳的问题,而提供抗骨质疏松的山茱萸有效部位群及其制备方法。
本发明的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群是以山茱萸为原料,利用大孔吸附树脂技术制备得到总环烯醚萜苷的质量分数为85%~95%的有效部位群,其中所述的总环烯醚萜苷中莫诺苷的质量分数为40%~65%,马钱苷的质量分数15%~30%。
本发明的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法按以下步骤进行:
一、称取山茱萸药材,然后加入质量为山茱萸药材质量5~7倍的水进行煎煮,煎煮1~3次,每次煎煮1.5h~2.5h,每次煎煮后分离煎煮液和药渣,收集煎煮液,然后对所得药渣进行下一次煎煮,合并各次煎煮液静置20h~24h后,于常压下用纱布过滤,得到滤液,将得到的滤液在温度为60~80℃的条件下,减压浓缩至相对密度为1.10~1.30,得到浓缩药液;
二、向步骤一得到的浓缩药液中加入体积浓度为70%~85%的乙醇,使浓缩液醇沉至浓缩药液中乙醇的体积浓度为0.5%~1.5%,静止10h~14h,抽滤,收集滤液,减压蒸馏回收滤液中的乙醇,使滤液浓缩至浓度为(1.20~1.50)g生药/mL,得到水提醇沉浓缩液;
三、用体积浓度为93%~97%的乙醇浸泡大孔吸附树脂20h~24h,漂去上层漂浮的杂质及细小颗粒,待大孔吸附树脂充分溶胀后用抽滤瓶抽干乙醇大孔树脂内、外部含有的乙醇,完成预处理,然后将预处理后的大孔吸附树脂采用湿法装柱,装柱后用20%~30%乙醇洗脱至流出液加水不变浑浊为止,再用体积为4~6个树脂柱体积的水洗脱至无醇味,得到树脂柱;
四、将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.0BV/h~1.5BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱,然后用体积为13~17个树脂柱体积的水以洗脱速度为2BV/h~2.5BV/h洗脱树脂柱,弃去水洗液,再用体积为8~12个树脂柱体积、体积浓度为8%~12%的乙醇以洗脱速度为1.0BV/h~2.0BV/h洗脱树脂柱,得到第一次洗脱液,重复洗脱操作8~10次,收集各次洗脱液,得到乙醇洗脱液;其中步骤二得到的水提醇沉浓缩液中生药质量与步骤三中预处理前的大孔吸附树脂的质量比为1:(4~5);
五、减压蒸馏回收步骤四得到的乙醇洗脱液中的乙醇,然后浓缩至相对密度为1.1~1.5,最后进行减压干燥,得到抗骨质疏松的山茱萸有效部位群。
本发明的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群是以山茱萸为原料,利用大孔吸附树脂技术成功制备出了主要成分莫诺苷含量高于52%、马钱苷含量高于16%、总环烯醚萜苷含量高于95%的有效部位群。本发明确定了可行性强、重现性高,并可工业化生产的提取富集工艺。将山茱萸莫诺苷等成分群作为六味地黄丸治疗骨质疏松的有效组分进行深入研究,药理研究表明,通过促进成骨细胞的分化、抑制成骨细胞的凋亡、上调OPG/RANKL的比率、增加骨形成和减少骨吸收从而明显回调地塞米松和去卵巢诱导的大鼠骨质疏松模型的各项指标的具有良好抗骨质疏松作用的有效部位群。该新组方具有疗效确切、针对性强的特点,可应用与医药领域。
附图说明
图1为试验一的高压液相色谱图;其中a为供试品即实施例得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群,b为混合对照品,1代表莫诺苷,2代表马钱苷;
图2为试验三中2.1-Ⅰ血清碱性磷酸酶含量对比柱形图;
图3为试验三中2.1-Ⅱ血清抗酒石酸酸性磷酸酶含量对比柱形图;
图4为试验三中2.1-Ⅲ、血清钙含量对比柱形图;
图5为试验三中2.1-Ⅳ、血清磷含量对比柱形图;
图6为试验三中2.2的LV1-4的制备及骨密度的检测对比柱形图;
图7为试验三中2.3的L5的制备及凹入试验最大载荷的检测对比柱形图;
图8为试验三中2.4的第0周、第6周和第12周的大鼠体重对比柱形图;其中a为第0周,b为第6周,c为第12周;
图9为试验四中2.1-Ⅰ血清碱性磷酸酶含量对比柱形图;
图10为试验四中2.1-Ⅱ血清抗酒石酸酸性磷酸酶含量对比柱形图;
图11为试验四中2.1-Ⅲ、血清钙含量对比柱形图;
图12为试验四中2.1-Ⅳ、血清磷含量对比柱形图;
图13为试验四中2.2的LV1-4的制备及骨密度的检测对比柱形图;
图14为试验四中2.3的L5的制备及凹入试验最大载荷的检测对比柱形图;
图15为试验四中2.4的第0周和第12周的大鼠体重对比柱形图;其中a为第0周,b为第12周。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群是以山茱萸为原料,利用大孔吸附树脂技术制备得到总环烯醚萜苷的质量分数为85%~95%的有效部位群,其中所述的总环烯醚萜苷中莫诺苷的质量分数为40%~65%,马钱苷的质量分数15%~30%。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:其中所述的总环烯醚萜苷中莫诺苷的质量分数为55%~65%,马钱苷的质量分数16%~30%。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法按以下步骤进行:
一、称取山茱萸药材,然后加入质量为山茱萸药材质量5~7倍的水进行煎煮,煎煮1~3次,每次煎煮1.5h~2.5h,每次煎煮后分离煎煮液和药渣,收集煎煮液,然后对所得药渣进行下一次煎煮,合并各次煎煮液静置20h~24h后,于常压下用纱布过滤,得到滤液,将得到的滤液在温度为60~80℃的条件下,减压浓缩至相对密度为1.10~1.30,得到浓缩药液;
二、向步骤一得到的浓缩药液中加入体积浓度为70%~85%的乙醇,使浓缩液醇沉至浓缩药液中乙醇的体积浓度为0.5%~1.5%,静止10h~14h,抽滤,收集滤液,减压蒸馏回收滤液中的乙醇,使滤液浓缩至浓度为(1.20~1.50)g生药/mL,得到水提醇沉浓缩液。
三、用体积浓度为93%~97%的乙醇浸泡大孔吸附树脂20h~24h,漂去上层漂浮的杂质及细小颗粒,待大孔吸附树脂充分溶胀后用抽滤瓶抽干乙醇大孔树脂内、外部含有的乙醇,完成预处理,然后将预处理后的大孔吸附树脂采用湿法装柱,装柱后用20%~30%乙醇洗脱至流出液加水不变浑浊为止,再用体积为4~6个树脂柱体积的水洗脱至无醇味,得到树脂柱;
四、将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.0BV/h~1.5BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱,然后用体积为13~17个树脂柱体积的水以洗脱速度为2BV/h~2.5BV/h洗脱树脂柱,弃去水洗液,再用体积为8~12个树脂柱体积、体积浓度为8%~12%的乙醇以洗脱速度为1.0BV/h~2.0BV/h洗脱树脂柱,得到第一次洗脱液,重复洗脱操作8~10次,收集各次洗脱液,得到乙醇洗脱液;其中步骤二得到的水提醇沉浓缩液中生药质量与步骤三中预处理前的大孔吸附树脂的质量比为1:(4~5);
五、减压蒸馏回收步骤四得到的乙醇洗脱液中的乙醇,然后浓缩至相对密度为1.1~1.5,最后进行减压干燥,得到抗骨质疏松的山茱萸有效部位群。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式三不同的是:步骤一中加入质量为山茱萸药材质量6倍的水进行煎煮,煎煮2次,每次煎煮2h。其他步骤及参数与具体实施方式三相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式三或四不同的是:步骤一中减压浓缩至相对密度为1.2。其他步骤及参数与具体实施方式三或四相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式三至五之一不同的是:步骤二中使滤液浓缩至浓度为1.40g生药/mL。其他步骤及参数与具体实施方式三至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式三至六之一不同的是:步骤三中再用体积为5个树脂柱体积的水洗脱至无醇味。其他步骤及参数与具体实施方式三至六之一相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式三至七之一不同的是:步骤四中将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.1BV/h~1.4BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱。其他步骤及参数与具体实施方式三至七之一相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式三至八之一不同的是:步骤四中将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.2BV/h~1.3BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱。其他步骤及参数与具体实施方式三至八之一相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式三至九之一不同的是:步骤四中然后用体积为15个树脂柱体积的水以洗脱速度为2.1BV/h~2.4BV/h洗脱树脂柱,弃去水洗液,再用体积为10个树脂柱体积、体积浓度为10%的乙醇以洗脱速度为1.5BV/h洗脱树脂柱。其他步骤及参数与具体实施方式三至九之一相同。
具体实施方式十一:本实施方式与具体实施方式三至十之一不同的是:步骤四中然后用体积为15个树脂柱体积的水以洗脱速度为2.2BV/h洗脱树脂柱。其他步骤及参数与具体实施方式三至十之一相同。
具体实施方式十二:本实施方式与具体实施方式三至十一之一不同的是:步骤五中然后浓缩至相对密度为1.2~1.4。其他步骤及参数与具体实施方式三至十一之一相同。
具体实施方式十三:本实施方式与具体实施方式三至十二之一不同的是:步骤五中然后浓缩至相对密度为1.3。其他步骤及参数与具体实施方式三至十一之二相同。
用以下试验验证本发明的有益效果
实施例1、本实施例的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法按以下步骤进行:
一、称取24Kg山茱萸药材,然后加入质量为山茱萸药材质量6倍的水进行煎煮,煎煮2次,每次煎煮2h,第一次煎煮后分离煎煮液和药渣,收集煎煮液,然后对所得药渣进行第二次煎煮,合并2次煎煮固液混合物静置4h后,于常压下用四层纱布过滤,得到滤液,将得到的滤液在温度为70℃的条件下,减压浓缩至相对密度为1.20,得到浓缩药液;
二、向步骤一得到的浓缩药液中加入体积浓度为80%的乙醇,使浓缩液醇沉至浓缩药液中乙醇的体积浓度为1.0%,静止12h,抽滤,收集滤液,减压蒸馏回收滤液中的乙醇,使滤液浓缩至浓度为1.40g生药/mL,得到水提醇沉浓缩液;
三、用体积浓度为95%的乙醇浸泡大孔吸附树脂24h,漂去上层漂浮的杂质及细小颗粒,待大孔吸附树脂充分溶胀后用抽滤瓶抽干乙醇,完成预处理,然后将预处理后的大孔吸附树脂采用湿法装柱,装柱后用乙醇洗脱至流出液加水不变浑浊,再用体积为5个树脂柱体积的水洗脱,此时洗脱液已无醇味,得到树脂柱;
四、将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.3BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱,然后用体积为15个树脂柱体积的水以洗脱速度为2BV/h洗脱树脂柱,弃去水洗液,再用体积为10个树脂柱体积、体积浓度为10%的乙醇以洗脱速度为1.50BV/h洗脱树脂柱,得到第一次洗脱液,重复洗脱操作9次,收集各次洗脱液,得到乙醇洗脱液;其中步骤二得到的水提醇沉浓缩液中生药质量与步骤三中预处理前的大孔吸附树脂的质量比为1:4;
五、减压蒸馏回收步骤四得到的乙醇洗脱液中的乙醇,然后浓缩至相对密度为1.3,最后进行减压干燥,得到抗骨质疏松的山茱萸有效部位群。
试验一、用安捷伦1200高效液相色谱仪,对实施例1的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群进行高压液相色谱检测:
检测条件:
色谱柱:Diamonsil(钻石)C18(200×4.6mm,5μ),迪马科技;保护柱:EasyGuard IIC18Kit保护柱,迪马科技;洗脱条件:甲醇:水(体积比为28:72)等度洗脱20min;流速:1.0mL/min;检测波长:242nm;柱温:30℃。混合对照品溶液的制备:
过程:
混合对照品溶液的制备:
取莫诺苷对照品7mg,精密称定,置25mL容量瓶中。加适量蒸馏水,充分溶解后加入蒸馏水定容至25mL;其中所述的莫诺苷对照品纯度大于98%。
取马钱苷对照品约9mg,精密称定,置25mL容量瓶中。加适量蒸馏水,充分溶解后加蒸馏水定容至25mL;其中所述的马钱苷对照品购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。
分别精密量取莫诺苷对照品储备液2mL,马钱苷对照品储备液2mL,置于25mL容量瓶中蒸馏水加至刻度混匀,即得混合对照品溶液;其中莫诺苷、马钱苷的浓度分别为23.6μg/mL、30.7μg/mL。
供试品溶液的制备:
取实施例1得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群10mg,精密称定,置50mL容量瓶中,加蒸馏水充分溶解,室温放置,加蒸馏水至刻度,然后用0.45μm微孔滤膜滤过,取20mL滤液作为供试品溶液;其中所述的供试品溶液中实施例1得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的浓度为60μg/mL。
标准曲线的绘制
取5mL混合对照品溶液于0.45μm微孔滤膜滤过,自动进样2μL、6μL、10μL、14μL、20μL、30μL,HPLC检测,以峰面积(Y)对质量(X)进行线性回归,得回归方程,结果见表1-1。
表1线性关系结果表
结果:得到如图1所示的高压液相谱图,其中a为供试品即实施例得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群,b为混合对照品;1代表莫诺苷,2代表马钱苷,通过高效液相法对部分已知成分进行的探索性研究显示各已知成分含量较稳定,测得有效部位群富集物含莫诺苷52.98%、马钱苷16.37%,初步研究证实可控成分已达到70%左右。
试验二、用UVmini-1240紫外可见分光光度计检测实施例1得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群中总环烯醚帖苷的含量,检测过程如下:
马钱苷标准对照品溶液的制备:
取马钱苷对照品10mg,精密称定,置25mL容量瓶中,加蒸馏水使其充分溶解,再加蒸馏水至刻度,即得384.0μg/mL的马钱苷标准对照品溶液。
莫诺苷标准对照品溶液的制备:
取莫诺苷对照品8mg,精密称定,置25mL容量瓶中,加蒸馏水使其充分溶解,再加蒸馏水至刻度,即得295.2μg/mL的莫诺标准苷对照品溶液。
供试品溶液的制备
取实施例1得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群粉末8mg,精密称定,置25mL容量瓶中,加蒸馏水使其充分溶解后加蒸馏水至刻度,即得328.8μg/mL的供试品溶液。
检测波长的确定
取马钱苷标准对照品溶液、莫诺苷标准对照品溶液和供试品溶液各5mL,于200nm~400nm扫描,确定检测波长,马钱苷对照品、莫诺苷对照品溶液与供试品溶液最大吸收波长分别为236.8nm、238.3nm、236.8nm,马钱苷标准对照品溶液与供试品溶液的最大吸收波长一致,均为236.8nm,故确定236.8nm为测定波长,选择马钱苷为对照品,进行总环烯醚帖苷的含量测定。
标准曲线的绘制
精密移取0.2mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.8mL、1.0mL的马钱苷标准对照品溶液分别置于10.0mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度得到浓度为7.68μg/mL、11.5μg/mL、19.2μg/mL、26.9μg/mL、30.7μg/mL、38.4μg/mL的系列标准对照品溶液。取5mL马钱苷标准对照品溶液,在236.8nm下测定吸光度,以吸光度(Y)对浓度(X)进行线性回归,得回归方程y=29.231x-0.0579,r=0.9999,结果见表2。
表2.线性关系结果表
实验结果可见,总环烯醚萜苷在7.68μg/mL~38.4μg/mL之间,线性关系良好,利用该回归方程计算实施例1得到的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群中总环烯醚萜苷含量,测得有效部位群总环烯醚帖苷达到95.34%,有效富集了山茱萸有效部位的总环烯醚萜苷有效部位,为成品制剂的制备提供了技术支持。
试验三、糖皮质激素型骨质疏松检测试验
1、前处理:
取60只清洁级SD雌性大鼠,体重230±20g,随机分成6组,每组10只,设为空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组;其中所述的清洁级SD雌性大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组做如下处理:
①空白组:每日上午8-10点左右灌胃蒸馏水5mL·kg-1(以大鼠体重Kg计)1次,连续12周,除灌胃外正常喂食,然后肌肉注射生理盐水,每周3次,每次0.2mL·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续8周,再每周1次,每次0.2mL·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续4周,每周称量一次体重,调整给药剂量。
②模型组:每日上午8-10点左右灌胃蒸馏水5mL·kg-1(以大鼠体重Kg计)1次/,连续12周,除灌胃外正常喂食,然后肌肉注射地塞米松,每周3次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续8周,然后每周1次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续4周,每周称量一次体重,调整给药剂量。
③阿仑膦酸钠组:每日上午8-10点左右灌胃阿仑膦酸钠溶液1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计)1次,连续12周,除灌胃外正常喂食,然后肌肉注射地塞米松,每周3次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续8周,然后每周1次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续4周,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的阿仑磷酸钠溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为0.2mg/mL。
④低剂量组:每日灌胃实施例1抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液15mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续12周,除灌胃外正常喂食,然后肌肉注射地塞米松,每周3次,于上午8-10点左右进行,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续8周,然后每周1次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续4周,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为3mg/mL。
⑤中剂量组:每日灌胃实施例1抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液45mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续12周,除灌胃外正常喂食,然后肌肉注射地塞米松,每周3次,于上午8-10点左右进行,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续8周,然后每周1次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续4周,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为15mg/mL。
⑥高剂量组:每日灌胃实施例1抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液135mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续12周,除灌胃外正常喂食,然后肌肉注射地塞米松,每周3次,于上午8-10点左右进行,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续8周,然后每周1次,每次1mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续4周,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为135mg/mL。
2.检测过程及结果
数据采用均数±标准差(mean±SD)表示,SPSS17.0统计软件分析,两组间比较采用独立样本t检验(independent Sample Stest);多组比较采用单因素方差分析;One-way ANVOA方法进行统计分析,LDS多重检验,P<0.05为有显著性差异。
2.1血清的采集及指标的测定
检测过程:对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组进行采样,采样前禁食24h,然后用质量浓度为3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,由腹主静脉采血5mL,置普通生化采血管中,静置20min,以转速3000r·min-1离心10min,移取上层血清,按照试剂盒的方法采用分光光度法测定血清中的血清碱性磷酸酶含量,血清酸性磷酸酶含量,血清钙含量和血清磷含量,记录并分析数据;其中血清碱性磷酸酶试剂盒,血清酸性磷酸酶试剂盒,血清钙试剂盒和血清磷试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。
检测结果:
Ⅰ、血清碱性磷酸酶
见图2,由图2可以得出与空白组血清碱性磷酸酶比较,模型组增加了8.72%,阿仑膦酸钠组增加了1.48%,低剂量组增加了7.28%,中剂量组增加了5.83%,高剂量组增加了4.38%,各组均较空白组有增加趋势。
Ⅱ、血清抗酒石酸酸性磷酸酶的测定
见图3,由图3可以得出与空白组酸性磷酸酶比较,模型组增加了9.00%,阿仑膦酸钠组增加了1.45%,低剂量组增加了7.32%,中剂量组增加了3.13%,高剂量组增加了2.29%,各组均较空白组有增加趋势。
Ⅲ、血清钙的测定
见图4,由图4可以得出与空白组血清钙比较,模型组增加了4.51%,阿仑膦酸钠组下降了0.33%,低剂量组下降了1.57%,中剂量组下降了0.33%,高剂量组下降了0.33%,除了模型组较空白组有增加趋势外,其余各组都呈下降趋势。由成骨细胞分泌的骨钙素被认为是评价成骨功能的较特异参数,其直接反映成骨细胞的活性和骨生理代谢变化。
Ⅳ、血清磷的测定
见图5,由图5可以得出与空白组血清磷比较,模型组增加了4.84%,阿仑膦酸钠组增加了8.87%,低剂量组增加了3.26%,中剂量组增加了8.06%,高剂量组增加了12.10%,各组均较空白组有增加趋势。说明山茱萸有效部位群可促进骨形成,从而阻止骨量丢失,对骨质疏松症有明显的防治作用。
2.2、LV1-4的制备及骨密度的测定
对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组进行采样,剪开大鼠背部皮肤,用咬骨钳咬断大鼠尾骨和胸骨,将椎骨从大鼠身体分离出来,去掉少许附着在椎骨上的肌肉,辨认出第一椎骨,用手术刀切断椎骨与胸骨之间的椎间盘和肌腱,再切断第四腰椎与第五腰椎之间的椎间盘和肌腱,即取出LV1-4,用浸透生理盐水的纱布包裹,-20℃冷冻4h,测定时,取出冷冻的腰椎,自然解冻至室温,置于双能X扫描骨密度测定仪(美国NORLAND)下,进行腰椎和股骨扫描,测定BMD值。
检测结果:见图6,由图6可以得出与空白组骨密度比较,模型组下降了7.82%(P<0.05),阿仑膦酸钠组下降了0.74%,低剂量组下降了7.65%(P<0.05),中剂量组下降了6.63%(P<0.05),高剂量组下降了1.54%;与模型组骨密度比较,阿仑膦酸钠组增加了7.68%(P<0.05),低剂量组增加了0.17%,中剂量组增加了1.29%,高剂量组增加了6.81%(P<0.05)。阿仑膦酸钠和有效部位群富集物高剂量组都能将骨密度恢复到原有水平。
2.3、L5的制备及凹入试验最大载荷的测定
对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组进行采样,切断LV4与LV5的椎间盘及LV5与LV6的椎间盘,即取出LV5,用咬骨钳去掉棘突,用手术刀去掉远端椎间盘,再用挫磨平,并露出骨松质。然后将LV5放入牙托粉混合液中,凝固后,用浸透生理盐水的纱布包裹,-20℃冷冻,测定时,取出-20℃冷冻的LV5,融化至室温,始终保持湿润状态,置于德国Zwick/Roell的万能材料试验机上,凹入子内径1mm,加载速度1mm/min,位移2mm。记录最大载荷,其中所述的牙托粉混合液由由牙托粉和牙托水调和比例为3:1(体积比)混合而成。
检测结果:见图7,由图7可以得出,与空白组最大载荷比较,模型组下降了35.35%(P<0.05),阿仑膦酸钠组下降了11.19%,,低剂量组下降了22.65%(P<0.05),中剂量组下降了21.93%(P<0.05),高剂量组下降了12.46%;与模型组最大载荷比较,阿仑膦酸钠组增加了37.38%(P<0.05),低剂量组增加了19.64%,中剂量组增加了20.77%,无统计学意义,高剂量组增加了32.31%(P<0.05)。与模型组比较,阿仑膦酸钠和有效部位群富集物高剂量组显示了预防作用。
2.4、大鼠体重的变化检测
见图8,由图8可以得出,第6周的体重变化:与空白组体重比较,模型组下降了6.23%(P<0.001),阿仑膦酸钠组下降了13.73%(P<0.001),低剂量组下降了4.71%(P<0.001),中剂量组下降了10.55%(P<0.001),高剂量组下降了9.23%(P<0.001)。
第12周的体重变化:与空白组体重比较,模型组下降了17.62%(P<0.001),阿仑膦酸钠组下降了24.22%(P<0.001),低剂量组下降了16.29%(P<0.001),中剂量组下降了21.41%(P<0.001),高剂量组下降了20.34%(P<0.001)。
试验四、去卵巢骨质疏松检测试验
1、前处理:
取60只清洁级SD雌性大鼠,体重230±20g,随机分成6组,每组10只,设为空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组;其中所述的清洁级SD雌性大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组做如下处理:
①空白组:每日上午8-10时灌胃蒸馏水5mL·kg-1(以大鼠体重Kg计)1次,连续12周,除灌胃外正常喂食,每周称量一次体重,调整给药剂量。
②模型组:3%戊巴比妥(0.1mL/100g)腹腔注射,待麻醉完全后,俯卧位,肋弓下第3腰椎处,去毛,消毒,切皮,切口约1cm,钝性分离至肌肉层,腰椎左侧约1cm钝性分离肌肉,小心剪开腹膜,组织镊深入伤口,夹出并翻开腹腔脂肪,找到梅花状的卵巢,眼科剪从输卵管剪断分离卵巢,压迫止血后,将脂肪小心放入腹腔,分层缝合肌肉筋膜,同样的方法,切除右侧卵巢,皮下撒上少量的青霉素溶液,缝合皮肤,消毒伤口。麻醉4~5h后完全清醒,可正常进食。24h后切口无红肿,可正常活动,72h后切口无感染征象。单笼饲养一周,1周后切口完全愈合、缝线脱落。合笼饲养,每笼10只。自由摄水,给予标准饲料。所有动物饲养于23~25℃,相对湿度50%~70%的洁净环境中。
③尼尔雌醇组:每周任选一天于上午8~10点灌胃尼尔雌醇溶液0.2mg·kg-1(以大鼠体重Kg计)1次,连续12周,除灌胃外正常喂食,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的阿仑磷酸钠溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为0.2mg/mL。
④低剂量组:每日上午8~10点灌胃实施例1抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液15mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续12周,除灌胃外正常喂食,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为3mg/mL。
⑤中剂量组:每日上午8~10点灌胃实施例1抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液45mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续12周,除灌胃外正常喂食,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为15mg/mL。
⑥高剂量组:每日上午8~10点灌胃实施例1抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液135mg·kg-1(以大鼠体重Kg计),连续12周,除灌胃外正常喂食,每周称量一次体重,调整给药剂量。
其中所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群溶液用蒸馏水配制而成,溶液浓度为135mg/mL。
2.检测过程及结果
数据采用均数±标准差(mean±SD)表示,SPSS17.0统计软件分析,两组间比较采用独立样本t检验(independent Sample Stest);多组比较采用单因素方差分析;One-way ANVOA方法进行统计分析,LDS多重检验,P<0.05为有显著性差异。
2.1血清的采集及指标的测定
检测过程:对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组进行采样,采样前禁食24h,然后用质量浓度为3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,由腹主静脉采血5mL,置普通生化采血管中,静置20min,以转速3000r·min-1离心10min,移取上层血清,按照试剂盒的方法采用分光光度法测定血清中的血清碱性磷酸酶含量,血清酸性磷酸酶含量,血清钙含量和血清磷含量,记录并分析数据;其中血清碱性磷酸酶试剂盒,血清酸性磷酸酶试剂盒,血清钙试剂盒和血清磷试剂盒均购自??。
检测结果:
Ⅰ、血清碱性磷酸酶
见图9,由图9可以得出与空白组血清碱性磷酸酶比较,模型组增加了54.77%(P<0.001),尼尔雌醇组增加了11.62%,无统计学意义,低剂量组增加了44.87%(P<0.05),中剂量组增加了34.61%,高剂量组增加了20.66%;与模型组比较,尼尔雌醇组减少了27.88%(P<0.05),低剂量组减少了6.40%,中剂量组减少了13.02%,高剂量组减少了22.04%(P<0.05)。
Ⅱ、血清抗酒石酸酸性磷酸酶的测定
见图10,由图10可以得出与空白组酸性磷酸酶比较,模型组增加了67.61%(P<0.05),尼尔雌醇组增加了11.17%,无统计学意义;低剂量组增加了48.11%(P<0.05);中剂量组增加了17.34%;高剂量组增加了10.36%。与模型组比较,尼尔雌醇组减少了33.67%(P<0.05),低剂量组减少了11.63%,中剂量组减少了29.99%(P<0.05),高剂量组减少了34.15%(P<0.05)。
Ⅲ、血清钙的测定
见图11,由图11可以得出与空白组血清钙比较,模型组增加了10.87%,尼尔雌醇组增加了0.87%,低剂量组增加了7.27%,中剂量组增加了12.66%,高剂量组增加了3.36%。与空白组比较,其他各组均呈增加趋势,但各组之间均无统计学意义。
Ⅳ、血清磷的测定
见图12,由图12可以得出与空白组血清磷比较,模型组减少了7.60%,尼尔雌醇组减少了3.41%,低剂量组减少了6.24%,中剂量组减少了6.19%,高剂量组减少了12.57%,各组均较空白组均有减少趋势。
以上指标说明中药抗骨质疏松的山茱萸有效部位群能够抑制骨吸收,促进骨形成,从而阻止骨量丢失,对骨质疏松症有明显的防治作用。
2.2、LV1-4的制备及骨密度的测定
对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组进行采样,剪开大鼠背部皮肤,用咬骨钳咬断大鼠尾骨和胸骨,将椎骨从大鼠身体分离出来,去掉少许附着在椎骨上的肌肉,辨认出第一椎骨,用手术刀切断椎骨与胸骨之间的椎间盘和肌腱,再切断第四腰椎与第五腰椎之间的椎间盘和肌腱,即取出LV1-4,用浸透生理盐水的纱布包裹,-20℃冷冻?h,测定时,取出冷冻的腰椎,自然解冻至室温,置于美国DPX-MD的双能X扫描骨密度测定仪下,应用应用常规标准软件进行腰椎和股骨扫描,测定BMD值。
检测结果:见图13,由图13可以得出与空白组骨密度比较,模型组下降了8.77%(P<0.05),尼尔雌醇组下降了2.32%,无统计学意义,低剂量组下降了6.27%(P<0.05),中剂量组下降了6.77%(P<0.05),高剂量组下降了2.97%;与模型组骨密度比较,尼尔雌醇组增加了7.07%(P<0.05),低剂量组增加了2.20%,中剂量组增加了2.75%,高剂量组增加了6.36%(P<0.05)。尼尔雌醇和有效部位群富集物高剂量组都能将骨密度恢复到原有水平。
2.3、L5的制备及凹入试验最大载荷的测定
对空白组、模型组、阿仑磷酸钠组、低剂量组、中剂量组和高剂量组进行采样,切断LV4与LV5的椎间盘及LV5与LV6的椎间盘,即取出LV5,用咬骨钳去掉棘突,用手术刀去掉远端椎间盘,再用挫磨平,并露出骨松质。然后将LV5放入牙托粉混合液中,凝固后,用浸透生理盐水的纱布包裹,-20℃冷冻,测定时,取出-20℃冷冻的LV5,融化至室温,始终保持湿润状态,置于德国Zwick/Roell万能材料试验机上,凹入子内径1mm,加载速度1mm/min,位移2mm。记录最大载荷,其中所述的牙托粉混合液由牙托粉和牙托水按体积比为3:1混合而成。
检测结果:见图14,由图14可以得出,与空白组最大载荷比较,模型组下降了35.64%(P<0.05),尼尔雌醇组下降了15.39%(P<0.05),低剂量组下降了30.21%(P<0.05),中剂量组下降了23.22%(P<0.05),高剂量组下降了20.97%(P<0.05);与模型组最大载荷比较,尼尔雌醇组增加了31.46%(P<0.05),低剂量组增加了8.44%,中剂量组增加了19.30%(P<0.05),高剂量组增加了22.79%(P<0.05)。与模型组比较,尼尔雌醇组、有效部位群富集物中剂量和高剂量组显示了治疗作用,但是三者都没有将最大载荷恢复到原有水平,与空白组有差别。表明山茱萸有效部位群能够改善去势大鼠骨结构力学及材料力学性能,提高骨质量。
2.4、大鼠体重的变化检测
见图15,由图15可以得出,第12周的体重变化:与空白组体重比较,模型组增加了11.26%(P<0.05),尼尔雌醇组增加了10.24%(P<0.05),低剂量组增加了9.79%(P<0.05),中剂量组增加了11.08%(P<0.05),高剂量组增加了11.98%(P<0.05)。
Claims (10)
1.抗骨质疏松的山茱萸有效部位群,其特征在于抗骨质疏松的山茱萸有效部位群是以山茱萸为原料,利用大孔吸附树脂技术制备得到总环烯醚萜苷的质量分数为85%~95%的有效部位群,其中所述的总环烯醚萜苷中莫诺苷的质量分数为40%~65%,马钱苷的质量分数15%~30%。
2.根据权利要求1所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群,其特征在于抗骨质疏松的山茱萸有效部位群是以山茱萸为原料,利用大孔吸附树脂技术制备得到总环烯醚萜苷的质量分数为85%~95%的有效部位群,其中所述的总环烯醚萜苷中莫诺苷的质量分数为55%~65%,马钱苷的质量分数16%~30%。
3.制备如权利要求1所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的方法,其特征在于抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法按以下步骤进行:
一、称取山茱萸药材,然后加入质量为山茱萸药材质量5~7倍的水进行煎煮,煎煮1~3次,每次煎煮1.5h~2.5h,每次煎煮后分离煎煮液和药渣,收集煎煮液,然后对所得药渣进行下一次煎煮,合并各次煎煮液静置20h~24h后,于常压下用纱布过滤,得到滤液,将得到的滤液在温度为60~80℃的条件下,减压浓缩至相对密度为1.10~1.30,得到浓缩药液;
二、向步骤一得到的浓缩药液中加入体积浓度为70%~85%的乙醇,使浓缩液醇沉至浓缩药液中乙醇的体积浓度为0.5%~1.5%,静止10h~14h,抽滤,收集滤液,减压蒸馏回收滤液中的乙醇,使滤液浓缩至浓度为(1.20~1.50)g生药/mL,得到水提醇沉浓缩液;
三、用体积浓度为93%~97%的乙醇浸泡大孔吸附树脂20h~24h,漂去上层漂浮的杂质及细小颗粒,待大孔吸附树脂充分溶胀后用抽滤瓶抽干乙醇大孔树脂内、外部含有的乙醇,完成预处理,然后将预处理后的大孔吸附树脂采用湿法装柱,装柱后用20%~30%乙醇洗脱至流出液加水不变浑浊为止,再用体积为4~6个树脂柱体积的水洗脱至无醇味,得到树脂柱;
四、将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.0BV/h~1.5BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱,然后用体积为13~17个树脂柱体积的水以洗脱速度为2BV/h~2.5BV/h洗脱树脂柱,弃去水洗液,再用体积为8~12个树脂柱体积、体积浓度为8%~12%的乙醇以洗脱速度为1.0BV/h~2.0BV/h洗脱树脂柱,得到第一次洗脱液,重复洗脱操作8~10次,收集各次洗脱液,得到乙醇洗脱液;其中步骤二得到的水提醇沉浓缩液中生药质量与步骤三中预处理前的大孔吸附树脂的质量比为1:(4~5);
五、减压蒸馏回收步骤四得到的乙醇洗脱液中的乙醇,然后浓缩至相对密度为1.1~1.5,最后进行减压干燥,得到抗骨质疏松的山茱萸有效部位群。
4.根据权利要求3所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤一中加入质量为山茱萸药材质量6倍的水进行煎煮,煎煮2次,每次煎煮2h。
5.根据权利要求3或4所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤一中减压浓缩至相对密度为1.2。
6.根据权利要求5所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤二中使滤液浓缩至浓度为1.40g生药/mL。
7.根据权利要求5所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤三中再用体积为5个树脂柱体积的水洗脱至无醇味。
8.根据权利要求5所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤四中将步骤二得到的水提醇沉浓缩液以1.1BV/h~1.4BV/h的速度通过步骤三得到的树脂柱。
9.根据权利要求5所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤四中然后用体积为15个树脂柱体积的水以洗脱速度为2.2BV/h洗脱树脂柱,弃去水洗液,再用体积为10个树脂柱体积、体积浓度为10%的乙醇以洗脱速度为1.5BV/h洗脱树脂柱。
10.根据权利要求5所述的抗骨质疏松的山茱萸有效部位群的制备方法,其特征在于步骤五中然后浓缩至相对密度为1.3。
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