CN103459613A - 使用结合分子富集微粒或核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开富集生物学样品中的特定微粒类型的方法。在特定实施方式中，待富集的微粒是胚胎微粒或疾病特异性微粒。在特定实施方式中，方法包括将生物学样品与结合胚胎或疾病特异性微粒的结合分子组合，及分离生物学样品的2种或更多级分，其中分别就胚胎或疾病特异性微粒富集含有结合分子的级分。也公开的是通过就胚胎微粒富集生物学样品级分，然后自富集的级分分离核酸来富集生物学样品中的胚胎核酸的方法。也公开辅助胎儿中的染色体异常的出生前诊断的方法。在特定实施方式中，方法包括将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，自就胚胎微粒富集的级分分离核酸，及分析核酸中突变的存在。

Description

使用结合分子富集微粒或核酸的方法

【现有相关申请】

本申请要求2011年1月31日提交的美国临时申请No.61/437,768的优先权，其内容通过引用以它们的整体在此合并。

【技术领域】

本发明的实施方式涉及使用特异性结合分子自复杂混合物，诸如血富集微粒，细胞或核酸的罕见群的方法。

【背景技术】

评定及监测胚胎健康在怀孕期间具有极大重要性。医生和其他医疗专业需求具有关于胎儿健康可利用的最精确的信息，以便在怀孕期间最小化胎儿和母亲的风险及优化出生的健康婴儿数。可理解地，准双亲和亲属们是也焦虑关于胎儿健康和病情的信息。期望尽可能早期可利用此信息，从而双亲可作出关于怀孕和胎儿可具有的任何不利的医疗病情的知情决定。

访问胚胎遗传物质可提供关于胎儿健康的重要信息。例如，任何遗传缺陷，诸如染色体异常，可通过分析胚胎DNA检测。染色体异常包括点取代，缺失，添加，转位或染色体或染色体组异常数（非整倍性）。非整倍性的一例是单体性，成对染色体中的一个染色体丢失的一类非整倍性。另一类型的非整倍性是三体性，其中代替成对染色体而有3个拷贝的染色体。非整倍性可为致死或可导至下列几种不同遗传病症之一，包括Down综合征（三体性21），Edwards综合征（三体性18），Patau综合征（三体性13），及Turner综合征（X代替XX或XY）。

为这些病情的出生前诊断，目前可利用的过程有限及具有特定缺点。一种目前使用的过程是羊膜腔穿刺术，从胎儿发育的羊膜囊中提取含有胚胎DNA的羊水，然后分析胚胎DNA中有无任何遗传异常的医疗过程。羊膜腔穿刺术通常在怀孕的第15和第20周之间（即,在第2个三个月期间）实施。羊膜腔穿刺术具有几种显著并发症，包括早产，胚胎创伤和甚至胎儿流产的风险。因为测试只有到怀孕的第2个三个月才可可靠地实施，且因为与过程关联的显著风险，羊膜腔穿刺术无法为许多患者的期望过程。目前使用的另一过程是绒毛膜绒毛采样（CVS），其中取及分析胎盘组织样品。CVS可早于羊膜腔穿刺术（即,一般在怀孕的10～12周之间）实施，但此过程也带有感染，胚胎创伤，羊水渗漏，及流产的增加的风险。如果母源细胞未完全自胎盘分离，CVS也经历母源细胞混杂。因此，因为羊膜腔穿刺术和CVS均是相对侵袭性的过程且具有特定健康风险，这些过程无法适宜于许多患者。

一些胚胎物质也存在于母亲的血流中。此物质包括主要在胎盘细胞经历凋亡或其他形式的细胞死亡时形成的微粒（也被称为囊泡,微泡或凋亡体）中含有的胚胎DNA。形态学变化发生在凋亡或其他形式的细胞死亡期间，包括被称为“膜起泡”的过程，其导致这些微粒自细胞的形成和释放。因为这些微粒由细胞膜形成，微粒在它们的表面具有特异于它们所形成的细胞的生物标志物。此外，微粒的内容物可包括核物质诸如特异于它们所释放的细胞的核酸。存在于母亲的血流中的微粒的尺寸和微粒的量可基于个体及，在更少程度，基于胎儿孕龄改变。在一些实例中，存在的微粒的量可与在怀孕期间的不利的病情相关。一般而言，微粒的平均尺寸为约0.1～约1μm。这些微粒仅以非常小量存在于母源血流中，且使用知道的方法区别胚胎DNA与母源DNA极其难。但是，如果胚胎DNA可分离或纯化，可无需给母亲或胎儿施加显著健康风险地获得关于胎儿健康的有价值的信息，包括有关染色体或遗传异常的信息。

微粒的分离和富集也具有其他应用。例如，微粒也在癌细胞的活化或凋亡或其他类型的细胞死亡，或特定其他疾病中的细胞的活化或凋亡或其他细胞死亡期间形成。此外，在具有癌或特定其他疾病的患者，微粒不仅在细胞死亡期间从细胞释放，而且，例如，在癌的转移期间由细胞有意地释放。这些疾病特异性微粒可在与疾病或癌细胞接触的患者的血流或其他体液循环中发现。

因此，需要的是在怀孕早期（即,在头三个月期间）检测胎儿的胚胎染色体或其他遗传异常的欠侵袭性和可靠的方法。也期望该方法精确和在整个怀孕期间可再现（例如,在整个怀孕期间监测胎儿的健康）。也需要自母源物质富集胚胎微粒和胚胎DNA的方法。这些方法优选是有效的，信息性的和廉价的。也需要的是富集疾病特异性微粒（例如,癌微粒）或该微粒中含有的核酸的方法，以便检测，监测及分析疾病，肿瘤或其他癌。

【发明概述】

提供富集生物学样品中的微粒亚群或核酸的方法。在特定方面，富集方法包括将生物学样品与结合亚群的微粒的结合分子组合，及分离生物学样品的2种或更多级分的步骤，其中就微粒亚群富集含有结合分子的级分。在一实施方式中，微粒亚群是胚胎微粒。生物学样品可包括，例如，母源全血样品，血浆样品，血清样品或另一血级分样品中的至少一种。在一些实施方式中，结合分子是抗体或抗体片段。一般而言，结合分子特异性结合胚胎微粒，但不结合母源微粒。在一些实施方式中，2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品处理而去除内源性抗体。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品与结合母源微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的母源微粒。

在其他方面，提供富集生物学样品中的胚胎核酸（例如,DNA）的方法，方法包括以下步骤：将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分，及自含有结合分子的级分分离核酸，由此富集生物学样品中的胚胎核酸。富集的胚胎核酸可，例如，使用数字PCR分析。生物学样品可包括，例如，母源全血样品，血浆样品，血清样品或另一血级分样品中的至少一种。在一些实施方式中，结合分子是抗体或抗体片段。一般而言，结合分子特异性结合胚胎微粒，但不结合母源微粒。在一些实施方式中，2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品处理而去除内源性抗体。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品与结合母源微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的母源微粒。

在特定方面，提供辅助胎儿中的染色体异常的出生前诊断的欠侵袭性的方法。方法包括以下步骤：自怀孕的女性获得生物学样品，将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分，自含有结合分子的级分分离核酸（例如,DNA），及分析核酸以检测染色体异常的存在或缺失。生物学样品可包括，例如，母源全血样品，血浆样品，血清样品或其他血级分样品中的至少一种。在特定实施方式中，染色体异常是第13，18，21或X染色体的非整倍性。在其他实施方式中，染色体异常是与疾病关联的突变。或者，可检测其他遗传异常。可分析胚胎核酸，例如，使用数字PCR。在特定实施方式中，当胎儿孕龄小于约16周时，欠侵袭性的方法对于自怀孕的女性获得的样品是可靠的。在一些实施方式中，结合分子是抗体或抗体片段。一般而言，结合分子特异性结合胚胎微粒，但不结合母源微粒。在一些实施方式中，2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前处理生物学样品而去除内源性抗体。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品与结合母源微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的母源微粒。

在其他方面，公开的方法也可应用于疾病的检测。例如，提供辅助与细胞活化，细胞死亡，凋亡或微粒释放（或其组合）关联的癌或另一疾病的诊断的方法。方法可包括以下步骤：自患者获得生物学样品，将生物学样品与结合包含特异于患病细胞（例如,癌细胞）的生物标志物的微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，其中就疾病特异性微粒富集含有结合分子的级分，自含有结合分子的级分分离DNA，及分析DNA以检测与疾病关联的突变的存在或缺失，其中突变的存在指示患者具有疾病。在特定实施方式中，疾病是癌。在一些实施方式中，结合分子是抗体或抗体片段。一般而言，结合分子特异性结合源于癌的或疾病-特异性微粒，但不结合源于正常细胞的微粒。在一些实施方式中，2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。在特定实施方式中，在生物学样品与结合分子组合之前处理生物学样品而去除内源性抗体。在特定实施方式中，在将生物学样品与癌-特异性或疾病-特异性结合分子组合之前，将生物学样品与结合自预期存在于样品中的细胞形成的微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的该微粒。生物学样品可包括，例如，全血样品，血浆样品，血清样品，其他血级分样品，或与癌或患病细胞接触的任何体液样品中的至少一种。富集的核酸可，例如，使用数字PCR分析。也提供的是富集生物学样品中的包含疾病特异性生物标志物的微粒的方法和方法for富集疾病特异性核酸，包括：将生物学样品与结合疾病特异性微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，其中就疾病特异性微粒富集含有结合分子的级分。

【附图说明】

在下图中例示本发明的方法的非限制性实施方式。

图1是显示用如显示的各种抗体捕获的微粒中基因组当量的总DNA的图。基因组当量的总DNA通过用针对β-珠蛋白基因的引物进行数字PCR来测定。各对条的左条反映自怀男性胎儿的32周怀孕的患者分离的基因组当量，及右条反映自非-怀孕的女性对照分离的基因组当量。PLAP指示，当将结合胎盘碱性磷酸酶的抗体用于捕获胚胎微粒的获得结果。G233，G1和G9指示，当将（结合人白细胞抗原G（HLA-G）的不同表位）的那些抗体的每一种用于捕获胚胎微粒时获得结果。CD41指示，当使用结合CD41（血小板的标记物）的抗体时获得结果。对于CD41结果，该对条的左条在此图中无法观察到。Fas-L指示，当使用结合Fas-L（Fas配体,凋亡标记物）的抗体时获得结果。

图2是显示用如显示的各种生物标志物捕获的微粒中基因组当量的胚胎DNA的图。基因组当量的胚胎DNA通过用针对Y染色体-特异性序列Y49a（DYS1）基因的引物的数字PCR测定。各对条的左条反映自怀男性胎儿的32周怀孕的患者分离的基因组当量，及右条反映自非-怀孕的女性对照分离的基因组当量。为在各实验中微粒捕获使用的生物标志物在以下各对条中显示。胚胎DNA的富集通过使用用于此样品的微粒捕获的抗-PLAP抗体实现。对于PLAP结果，该对条的右条在此图中无法观察。对于G233结果，该对条的左条在此图中无法观察。对于G1结果，该对条的左条在此图中无法观察。对于G9结果，该对条的右条在此图中无法观察。对于CD41结果，该对条的右条在此图中无法观察。对于Fas-L结果，该对条的右条在此图中无法观察。

图3显示在由微粒捕获富集之后及由数字PCR测定的DNA的百分率产率。小图A是显示在富集之后总DNA的百分率产率的图，及小图B是显示在富集之后胚胎DNA的百分率产率的图。产率是相对于在微粒捕获之前存在于母源血浆中的量（即,在捕获之前，对于总和胚胎DNA,分别是1350基因组相当的(GE)/mL血浆和194GE/mL血浆）的总或胚胎DNA的量。各对条的左条反映自怀男性胎儿的32周怀孕的患者分离的基因组当量，及右条反映自非-怀孕的女性对照分离的基因组当量。为在各实验中微粒捕获使用的生物标志物在以下各对条中显示。

图4是显示在用各种生物标志物捕获之后获得的胚胎DNA的富集的图。富集倍数计算为在捕获之后的百分率胚胎DNA除于在微粒捕获之前母源血浆中的百分率胚胎DNA（富含例如,2倍富集是胚胎级分的倍增;1倍是无富集）。此实验中使用的血浆样品来自怀男性胎儿的32周怀孕的患者。为在各实验中微粒捕获使用的生物标志物在以下各条显示。

【发明详述】

本发明的实施方式提供富集及定量在复杂混合物中微粒，细胞或核酸的罕见群的方法。方法涉及使用捕获微粒或细胞的特定群的生物标志物和由此，富集这些微粒或细胞之内的核酸。这些方法也涉及使用本领域技术人员知道的灵敏方法，诸如单分子计数方法定量这些核酸，预期分离的核酸量会非常低，高度纯，且对于更常规定量方法诸如分光光度法，染料嵌入或定量PCR(qPCR)(尽管该常规定量方法可为在一些实例中适当的)可为检测限以下。公开的富集方法对于在胎盘细胞凋亡期间微粒中包裹的胚胎DNA的分离，富集和检测具有特定应用。含有这些胚胎DNA的微粒已知在整个妊娠期间在母源血浆中循环。公开的富集方法也在血中循环的罕见患病细胞（例如,癌细胞）或疾病特异性微粒（例如,癌微粒）中突变的鉴定中具有应用。

【定义和缩写】

术语“微粒”，“凋亡体”，“微泡”和“囊泡”在本文互换使用而指称膜结合粒子，其可包括例如在凋亡或其他类型的细胞死亡期间来自它们所来源的细胞的遗传物质和表面生物标志物。如本文所用，术语“生物标志物”指称在特定细胞类型上或中存在的分子（例如,胚胎细胞表面上的胎盘碱性磷酸酶蛋白）。“胚胎微粒”，“胚胎来源的微粒”，“胚胎-关联的微粒”等是主要由于胚胎细胞的凋亡可见于准母亲的血流或其他生物学样品中的微粒。胚胎微粒可在它们的表面具有胚胎-特异性生物标志物及含有胚胎DNA。“疾病微粒”，“疾病特异性微粒”，“疾病-关联的微粒”等是具有特异于特定疾病的生物标志物的微粒。癌微粒可在它们的表面具有肿瘤或癌特异性标记物。“癌微粒”，“癌细胞来源的微粒”，“癌-关联的微粒”等是由于癌细胞的凋亡或其他类型的细胞死亡，或其他自癌细胞释放可见于患癌患者的血流或其他体液的微粒。癌微粒可在它们的表面具有肿瘤或癌特异性标记物。

如本文所用，术语“生物学样品”包括自适合在本方法中使用的生物学源获得的任何样品，其中罕见细胞，微粒或核酸与其他细胞，微粒或核酸存在于相同的样品中。生物学样品可，由非限制性例的方式，包括全血，血清，血浆，其他血级分，羊水，培养的细胞和/或绒毛膜绒毛。在特定实施方式中，生物学样品是全血样品，血浆样品，血清样品，任何其他血级分样品，或其组合。生物学样品可由本领域技术人员知道的任何方法从个体得到，及可直接（例如,自个体由静脉穿刺获得血样品）或间接（例如,自患者直接获得的生物学样品自医疗保健提供者,医院或医师获得生物学样品）获得。

如本文所用，术语“受试者”用于指称人或任何非-人动物（例如,小鼠,大鼠,兔,狗,猫,牛,猪,绵羊,马或灵长类动物）。优选地，受试者是人。受试者可为“患者”，其指称为病情或疾病的诊断，治疗或护理面对医疗提供者的人。术语“患者”和“个体”可在本文互换使用。在一实施方式中，患者或个体是女性，且其病情是怀孕。在一些实施方式中，受试者可患或敏感于疾病或病症，但可或可不显示疾病或病症的症状。

如本文所用，术语“凋亡”指称一种形式的程序性细胞死亡。凋亡导致细胞表面的形态学变化，常常导致细胞膜“起泡”，其导致微粒形成。因为微粒由细胞膜形成，它们携带原细胞也表达的任何膜-特异性标记物（例如,胚胎-特异性标记物,疾病-特异性标记物或肿瘤-特异性标记物）。在一例中，凋亡在怀孕期间在胎盘或胚胎细胞天然地发生。

术语“富集”在本文用来指称自复杂混合物的罕见微粒，细胞或核酸的浓缩（例如,母源血样品中胚胎微粒的富集）。术语“免疫富集”也可用于指称富集方法，其中抗体，抗体片段，或特异性结合分子用于自复杂混合物捕获罕见微粒，细胞或核酸。如本文所用，术语“结合分子”用于指称特异性结合复杂混合物中的罕见粒子，目标细胞或核酸的分子。在一实施方式中，结合分子是特异性结合罕见粒子，目标细胞或核酸的抗体，抗体片段，蛋白受体或其他蛋白。在另一实施方式中，结合分子是“生物标志物”，其指称与罕见粒子，目标细胞或核酸特异性相互作用的蛋白。富集通过比较在捕获发生之后样品中靶物质（例如,胚胎微粒）和其他物质的量的比与在捕获之前初始样品中靶物质和其他物质的比来测定。富集导致相对于检测靶物质的捕获的物质的质量的增加（即,靶物质与存在的其他物质的比增加）。

术语“染色体异常”在本文用来指称与染色体关联的任何种缺陷，包括单或多碱基对缺失，添加和取代；转位；或完全染色体或染色体组数缺陷。术语“非整倍性”指称一个或更多染色体丢失或多于正常拷贝数存在。非整倍性相关于许多疾病或综合征，包括但不限于Down综合征，Edwards综合征，Patau综合征和Turner综合征。

“聚合酶链反应”或“PCR”指称扩增（增加浓度）和/或定量少量的核酸（例如,DNA）中使用的分子生物学技术。有许多形式的PCR，诸如为特定目的专门化的数字PCR或实时PCR。例如，数字PCR是原PCR技术的优化，其通过将个体核酸分子分隔进分离的区能更好提供核酸的绝对定量。各种其他PCR技术，包括本文所述的那些（例如,定量实时PCR,乳剂PCR,多重PCR和数字PCR）由本领域技术人员熟知和可依赖于存在于特定样品中的核酸量而在本方法中使用。

【在复杂组合物中胚胎微粒的富集方法】

在一些实施方式中，本发明提供富集生物学样品中的胚胎微粒的方法，其通过将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，及分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分。在特定实施方式中，生物学样品包括下列中的至少一种：全血样品，血浆样品，血清样品和其他血级分样品。因为微粒含有来自它们所源于的细胞的表面生物标志物和核酸（例如,DNA），微粒的捕获及富集可通过使用来自原细胞的表面-特异性生物标志物来实现。例如，为胚胎DNA富集，可将结合胚胎-特异性蛋白，诸如人白细胞抗原G（HLA-G;组织相容性抗原,I类,G），胎盘碱性磷酸酶（PLAP），或胚胎纤连蛋白，或其组合的结合分子用于鉴定及捕获在母源血浆中循环的胚胎微粒。在其他实施方式中，胚胎特异性蛋白选自：胎盘催乳激素，第21染色体开放阅读框105，内收蛋白1（α），生物素酶，密蛋白6，凝血因子II（凝血酶），凝血因子VIII促凝血组分，主要组织相容性复合物II类DRβ4，乳转铁蛋白，MAS1癌基因，肌联蛋白，vasohibin1，绒毛膜生长促乳素激素1，绒毛膜生长促乳素激素2，绒毛膜生长促乳素激素-样1，胰岛素-样生长因子结合蛋白1，怀孕特定β-1糖蛋白1，H19，组织因子通路抑制物2，怀孕特定β-1糖蛋白3，怀孕特定β-1糖蛋白9，怀孕特定β-1糖蛋白6，胰岛素-样生长因子2，δ-样1同源物，蛋白聚糖2，EF手结构域家族成员D1，怀孕-特异性β-1-糖蛋白7，解聚素和金属硫蛋白酶结构域12，纤连蛋白1，pappalysin1，促皮质激素释放激素，胰岛素-样生长因子结合蛋白3，信号素3B，胶原IV型α1，怀孕-特异性β-1-糖蛋白5，怀孕特定β-1-糖蛋白2，阿米洛利结合蛋白1，S100钙结合蛋白P，生长分化因子15，内皮PAS结构域蛋白1，CD59抗原，生长激素2，多配体蛋白聚糖1，丝氨酸蛋白酶抑制物分化体E成员2，胶原，III型，α1，胶原4型α2，磷脂酶A2组IIA，羟基-δ-5-甾脱氢酶3β1，爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的基因3，KiSS-1转移-抑制物，KISS1-R（受体），细胞色素P450家族19subA1，fibulin1，角蛋白18，polydom，转谷氨酰胺酶2，细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制物1，肾上腺髓质素，蛋白酶丝氨酸11，金属硫蛋白酶2的组织抑制物，卵泡抑素-样1，羟类固醇（17-β）脱氢酶1，金属硫蛋白酶3的组织抑制物，表皮生长因子受体，糖蛋白nmb，绒毛膜促性腺激素β多肽7，绒毛膜促性腺激素β多肽8，绒毛膜促性腺激素β多肽2，伤残的同源物2，肿瘤-关联的钙信号转导物2，FLJ14146，具有序列相似性46家族成员A，细胞色素p450家族11subf A多肽1，羟类固醇（17-β）脱氢酶2，丝氨酸蛋白酶抑制物分化体E成员1，胶原I型α1，热休克22kDa蛋白8，甘露糖苷酶α1C类成员1，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，胎盘-特异性1，新MAFF如蛋白，钙蛋白酶6，G抗原家族C1，ρ-相关的BTB结构域含有3，胶原6型α1，肿瘤抑制物候选3，EGF-样结构域多6，速激肽3，速激肽3受体，分泌的磷蛋白1，RAS p21蛋白活化物，凝集素半乳糖苷结合可溶性14（ppl13），张力蛋白-样SH2结构域含有1，富含半胱氨酸的运动神经元1，肌原纤维蛋白2，矩阵金属硫蛋白酶11，绒毛膜促性腺激素β多肽，绒毛膜促性腺激素β多肽5，血小板反应蛋白1型结构域3，父源地表达的10，二聚糖，胶原XV型α1，丝氨酸蛋白酶抑制物分化体B成员2，死亡-关联的蛋白激酶1，转录因子AP-2α，转胶蛋白，胎盘生长因子，微原纤维关联的蛋白5，pappalysin2（plac3），磷脂转移蛋白，普列克底物蛋白同源性-样结构域，家族A，成员2，角蛋白8，蛋白激酶抑制物β，胰岛素受体，disc大同源物5，羟类固醇（11-β）脱氢酶2，骨形态发生蛋白1，T-箱3，怀孕-特异性β-1-糖蛋白11，神经胶质细胞丢失同源物1，碱性磷酸酶胎盘-样2，血管紧张素II受体1型，钙粘素52型，frizzled-相关的蛋白，胰岛素-样4（胎盘），抑制素βA（激活素A），COBL-样1，转化生长因子β受体III，组织因子通路抑制物，由视黄酸基因刺激的6同源物，接合粘接分子2，dickkopf同源物1，退化的如1，ρ-相关的BTB结构域含有1，脑-特异性蛋白，白细胞介素1受体1型，甾硫酸酯酶，丝氨酸蛋白酶抑制物分化体H成员1，G蛋白-偶联的受体126，及凝集素半乳糖苷结合可溶性13。或者，可使用特异于凋亡，诸如膜联蛋白V或Fas配体（FasL），或其组合的生物标志物。此外，可使用胚胎特异性标记物和凋亡性标记物的组合。

在特定实施方式中，使用的结合分子是抗体或抗体片段。在其他实施方式中，结合分子是特异性结合期望的生物标志物的受体或其他蛋白。优选地，结合分子可结合胚胎微粒，但不结合母源微粒。在特定实施方式中，抗体或抗体片段结合PLAP，HLA-G或Fas-L。结合HLA-G的抗体例包括G1，G9和G233。

在一些实施方式中，抗体，抗体片段，或其他结合分子可具有用于直接检测微粒的可检测的标记物。可检测的标记物的例包括荧光染料，放射性标签，比色标签，等，其为本领域技术人员所知。如本文所用，术语“标记物”和“标签”互换使用以指称附接于结合分子或第二抗体蛋白的部分。或者，间接检测结合分子/微粒复合物。在一些实施方式中，具有可检测的标记物及可结合微粒-特异性抗体，抗体片段或其他结合分子的第二抗体可用于间接检测期望的微粒群。

在特定实施方式中，将期望的微粒群在免疫富集之前或之后用抗体，抗体片段，或其他结合分子进一步富集。例如，可将在特定细胞条件下也结合核酸的本领域技术人员知道的复染料诸如DAPI，碘化丙锭，Hoechst或其他另一染色剂用于进一步亚分级分离及富集那些含有核酸的微粒。在其他实施方式中，通过使用特异于母源生物标志物的结合分子而生物学样品选择性地耗竭母源微粒。检测和富集可然后经将固体支持物用于自其余血浆分离抗体/微粒和/或生物标志物/微粒复合物的免疫富集而达到。在免疫富集之前也可使用流式细胞术，以由尺寸，形状和荧光信号分选标记的微粒。

在特定实施方式中，抗体，将抗体片段，或生物标志物在富集之前直接结合到固体支持物。或者，可首完形成结合分子/微粒复合物，然后直接或间接经与支持物缀合的第二抗体结合到分离用固体支持物。此外，在形成抗体/微粒和/或生物标志物/微粒复合物之前，样品中的内源性抗体可由本领域技术人员知道的方法去除，由于内源性抗体可在免疫富集期间非特异性地结合固体支持物，由此降低方法的效率。

在一些实施方式中，固体支持物是聚苯乙烯珠或树脂。使用抗体作为结合分子，结合到树脂作为固体支持物的免疫沉淀用方法的一例是PIERCE DIRECT IP KIT（Thermo Scientific,Rockford,IL）。在其他实施方式中，固体支持物可为柱，板，孔，管，等。其他固体支持物包括，但不限于，磁珠或树脂，琼脂糖珠或树脂，及聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺树脂。生物学样品分离为2种或更多级分可，例如，通过使样品经历流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩来发生。

生物学样品可包括下列中的至少一种：全血样品，血浆样品，血清样品，或任何其他血级分样品，及可由本领域技术人员知道的任何方法从患者得到的样品。将全血样品分离为2种或更多血级分样品的各种方法为本领域技术人员所熟知。在一实施方式中，全血样品由静脉穿刺自个体获得，然后通过使用低速离心来离心，以便自其余血级分分离血浆级分。

【用于胚胎核酸富集的方法】

也提供富集生物学样品中的胚胎核酸（例如,DNA）的方法，其包括将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分，及自含有结合分子的级分分离DNA，由此富集生物学样品中的胚胎DNA。生物学样品可为，例如，全血样品，血浆样品，血清样品或其他血级分样品。结合分子结合胚胎微粒及不结合母源微粒，且可为，例如，抗体，抗体片段，受体或其他特异性结合蛋白。在一些实施方式中，结合分子结合胎盘碱性磷酸酶（PLAP），人白细胞抗原G（HLA-G），或Fas配体（Fas-L）。特异性结合HLA-G的抗体的例是G1，G9和G233。在其他实施方式中，结合分子结合之前部分所列的胚胎特异性蛋白之一。

在DNA富集方法的特定实施方式中，结合分子具有可检测的标记物。例如，结合分子可具有荧光标签，放射性标记物或比色标记物。结合分子可直接或间接经缀合于支持物的第二抗体附接于富集用固体支持物。在一些实施方式中，固体支持物是聚苯乙烯珠或树脂。在其他实施方式中，固体支持物是柱，板，孔，管，等。在其他实施方式中，固体支持物可为磁珠或树脂，琼脂糖珠或树脂，或聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺树脂。

生物学样品分离为2种或更多级分可通过使样品经历流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩来发生。在特定实施方式中，将期望的微粒群在免疫富集之前或之后用抗体，抗体片段，或其他结合分子进一步富集。例如，在抗体/微粒和/或生物标志物/微粒复合物形成之前，样品中的内源性抗体可由本领域技术人员知道的方法去除，由于内源性抗体可在免疫富集期间非特异性地结合固体支持物，由此降低方法的效率。此外，可将也在特定细胞条件下结合核酸的复染料诸如DAPI，碘化丙锭，Hoechst或其他本领域技术人员知道的另一染色剂用于进一步亚分级分离及富集含有核酸的那些微粒。在其他实施方式中，首先将生物学样品通过使用特异于母源生物标志物的结合分子选择性地耗竭母源微粒。检测和富集可然后经将固体支持物用于自其余血浆分离抗体/微粒和/或生物标志物/微粒复合物的免疫富集实现。也可在免疫富集之前使用流式细胞术以由尺寸，形状和荧光信号分选标记的微粒。在特定实施方式中，将抗体，抗体片段，或生物标志物在富集之前直接结合到固体支持物。

自富集的微粒级分分离核酸可由本领域技术人员所熟知的一种或更多方法进行。例如，微粒可使用标准分子生物学技术直接在固体支持物上溶解。该方法的例包括使用去污剂或离液序列高的盐以便溶解或解聚微粒。DNA提取方法的一例是使用QIAAMP循环核酸试剂盒（Qiagen）的方法。或者，在一些实例中，可将样品与蛋白酶K于56℃温育30分钟而以400rpm振摇，之后是于95℃热灭活20分钟，以5,000g离心5分钟，及自碎片移出上清液用于进一步分析。各种修饰也可适宜于在一些实施方式中提取。此外，用于DNA提取的其他适合的方法为本领域技术人员所熟知。

可测定各级分中的胚胎核酸量由灵敏方法诸如实时PCR或数字PCR。然后也可检查胚胎核酸的任何遗传缺陷或染色体异常。在一些实施方式中，可使用多重PCR（即,可在单PCR反应中同时扩增多于一个胚胎基因）。或者，胚胎核酸可通过本领域技术人员知道的测序方法分析。可扩增靶分子的其他方法包括，但不限于全基因组扩增，链位移扩增，滚环扩增，连接酶链扩增，及多PCR方法包括定量实时PCR，乳剂PCR和数字PCR。扩增的靶可用方法诸如但不限于荧光诸如探查染料，或核苷酸；化学发光；放射性；毛细管电泳；微阵列；测序；质量光谱法；及纳米串技术检测。公开的富集方法可在早至怀孕的头三个月实施，及可在整个怀孕期间重复以持续监测发育中的胎儿的健康。

【用于胚胎健康的出生前诊断的更少侵袭性的方法】

提供辅助胎儿中的染色体异常的出生前诊断的欠侵袭性的方法，包括自怀孕的女性获得生物学样品，将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分，自含有结合分子的级分分离核酸，及分析分离的核酸以检测染色体异常的存在或缺失。

在一实施方式中，染色体异常是相关于疾病的突变。在特定方面，染色体异常可为第13，18，21或X染色体的非整倍性。在特定其他方面，染色体异常是父源地控制的等位基因。在特定其他方面，染色体异常是点突变。在一些实施方式中，当胎儿孕龄小于约16周时，欠侵袭性的方法对于自怀孕的女性获得的样品是可靠的。在一实施方式中，非侵袭方法对于自在其怀孕的头三个月期间的怀孕的女性获得的样品是可靠的。

在一些实施方式中，结合分子结合胚胎微粒及不结合母源微粒，及可为，例如，抗体，抗体片段，受体或其他特异性结合蛋白。在一些实施方式中，结合分子结合胎盘碱性磷酸酶（PLAP），人白细胞抗原G（HLA-G），或Fas配体（Fas-L）。特异性结合HLA-G的抗体的例是G1，G9和G233。可使用结合以上所列的胚胎特异性结合蛋白之一的其他结合分子。

在核酸富集方法的特定实施方式中，结合分子具有可检测的标记物。例如，结合分子可具有荧光标签，放射性标记物或比色标记物。可将结合分子直接或间接经缀合于支持物的第二抗体附接于富集用固体支持物。在一些实施方式中，固体支持物是聚苯乙烯珠或树脂。在其他实施方式中，固体支持物是柱，板，孔，管，等。在其他实施方式中，固体支持物是磁珠或树脂，琼脂糖珠或树脂，或聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺树脂。生物学样品分离为2种或更多级分可发生通过使样品经历流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩。在特定实施方式中，将期望的微粒群在免疫富集之前或之后用抗体，抗体片段，或其他结合分子进一步富集。例如，在抗体/微粒和/或生物标志物/微粒复合物形成之前，样品中的内源性抗体可由本领域技术人员知道的方法去除，由于内源性抗体可在免疫富集期间非特异性地结合固体支持物，由此降低方法的效率。此外，可将在特定细胞条件下也结合核酸的复染料诸如DAPI，碘化丙锭，Hoechst或其他本领域技术人员知道的另一染色剂用于进一步亚分级分离及富集含有核酸的那些微粒。在其他实施方式中，将生物学样品首先通过使用特异于母源生物标志物的结合分子选择性地耗竭母源微粒。检测和富集可然后经将固体支持物用于自其余血浆分离抗体/微粒和/或生物标志物/微粒复合物的免疫富集而达到。也可在免疫富集之前使用流式细胞术，以由尺寸，形状和荧光信号分选标记的微粒。在特定实施方式中，抗体，抗体片段，或生物标志物在富集之前直接结合固体支持物。

自富集的微粒级分的核酸分离可由本领域技术人员所熟知的一种或更多方法进行。例如，微粒可使用标准分子生物学技术直接在固体支持物上溶解。该方法的例包括使用去污剂或离液序列高的盐以便溶解或解聚微粒。DNA提取方法的一例是使用QIAAMP循环核酸试剂盒（Qiagen）的方法。或者，在一些实例中，可将样品与蛋白酶K于56℃温育30分钟而以400rpm振摇，之后是于95℃热灭活20分钟，以5,000g离心5分钟，及自碎片移出上清液用于进一步分析。这些提取方法的各种修饰也可适宜于在一些实施方式中提取。此外，用于核酸提取的其他适合的方法为本领域技术人员所熟知。

可由灵敏方法诸如实时PCR或数字PCR测定各级分中的胚胎核酸量。然后也可检查胚胎核酸的任何遗传缺陷或染色体异常。在一些实施方式中，可使用多重PCR（即,可在单PCR反应中同时扩增多于一个胚胎基因）。或者，胚胎核酸可通过本领域技术人员知道的测序方法分析。可扩增靶分子的其他方法包括，但不限于全基因组扩增，链位移扩增，滚环扩增，连接酶链扩增，及多PCR方法包括定量实时PCR，乳剂PCR和数字PCR。扩增的靶可用方法诸如但不限于荧光诸如探查染料，或核苷酸；化学发光；放射性；毛细管电泳；微阵列；测序；质量光谱法；及纳米串技术检测。公开的富集方法可在早至怀孕的头三个月实施，及可在整个怀孕期间重复，以持续监测发育中的胎儿的健康。

【富集疾病特异性微粒的方法】

也可将公开的方法应用于检测特异于疾病的微粒。例如，提供在复杂混合物中富集癌微粒或其他疾病特异性微粒的方法，以及辅助癌或其他与细胞死亡和凋亡关联的疾病的诊断的方法。该富集和诊断方法包括将生物学样品与结合疾病特异性微粒的结合分子组合，及分离生物学样品的2种或更多级分，其中富集含有结合分子的级分的疾病特异性微粒。为诊断疾病诸如癌，然后自含有结合分子的级分分离核酸及分析以检测与疾病诸如癌关联的突变的存在或缺失，其中突变的存在指示个体具有疾病。生物学样品可为血样品，血浆样品，其他血级分样品，或与癌或患病细胞接触的任何体液样品（例如,胆汁,尿,粘液,脑脊液,腹膜液,淋巴液,等）。结合分子可为结合疾病微粒及不结合源于正常细胞的微粒的抗体，抗体片段，受体或其他特异性结合蛋白。

在这些方法的特定实施方式中，结合分子具有可检测的标记物，诸如荧光标签，放射性标记物或比色标记物。可将结合分子直接或间接经缀合于支持物的第二抗体附接于富集用固体支持物。在一些实施方式中，固体支持物是聚苯乙烯珠或树脂。在其他实施方式中，固体支持物是柱，板，孔，管，等。在其他实施方式中，固体支持物是磁珠或树脂，琼脂糖珠或树脂，或聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺树脂。生物学样品分离为2种或更多级分可通过使样品经历流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩来发生。在特定实施方式中，期望的癌微粒群在免疫富集之前或之后用抗体，抗体片段，或其他结合分子进一步富集。例如，在结合分子/微粒复合物形成之前，生物学样品中的内源性抗体可在免疫富集期间由本领域技术人员知道消除或减少内源性抗体与固体支持物的非特异性结合的方法去除。此外，可将复染料诸如DAPI，碘化丙锭，Hoechst或其他本领域技术人员知道在特定细胞条件下也结合核酸的另一染色剂用于进一步亚分级分离及富集含有核酸的那些微粒。在其他实施方式中，通过使用特异于在那些细胞上存在的生物标志物的结合分子使生物学样品选择性地耗竭由会预期在特定生物学样品中的细胞类型产生的微粒。检测和富集可然后经将固体支持物用于自其余样品分离结合分子/微粒复合物的免疫富集来达到。也可在免疫富集之前使用流式细胞术以由尺寸，形状和荧光信号分选标记的微粒。在特定实施方式中，抗体，抗体片段，或生物标志物在富集之前直接结合到固体支持物。

自富集的微粒级分的核酸分离可由本领域技术人员所熟知的一种或更多方法进行。可由灵敏方法诸如实时PCR或数字PCR测定各级分中的核酸量。在一些实施方式中，可使用多重PCR（即,可在单PCR反应中同时扩增多余一个基因）。或者，核酸可通过本领域技术人员知道的测序方法分析。可扩增靶分子的其他方法包括，但不限于全基因组扩增，链位移扩增，滚环扩增，连接酶链扩增，及多PCR方法包括定量实时PCR，乳剂PCR和数字PCR。扩增的靶可用方法诸如但不限于荧光诸如探查染料，或核苷酸；化学发光；放射性；毛细管电泳；微阵列；测序；质量光谱法；及纳米串技术检测。

应明白，上述涉及本发明的特定实施方式及可对其实施多种变化而不离开本发明的范围。本发明还由下列实施例例证，其不被以任何方式解释为对本发明的范围的限制。相反，本领域技术人员在读过本说明书之后可被提示可采用各种其他实施方式，修饰和其相当体而不离开本发明的精神和/或随附的权利要求的范围。

【实施例】

本发明可通过引用以下非限制性例而更佳明白。

【实施例1：母源血样品中胚胎DNA的富集】

从32周妊娠的怀男性胎儿的怀孕的女性或未怀孕的对照女性得到全血样品。将血样品以1600g于22～23℃离心10分钟以分离血浆级分。然后将血浆样品以3500g和22～23℃旋转另外的10分钟以移出细胞碎片和血小板。将聚苯乙烯珠与针对胚胎生物标志物HLA-G，PLAP或FasL制造的抗体交联。然后使血浆样品与抗体交联的珠于4℃温育几小时以捕获胚胎微粒。在捕获之后，将微粒在珠上使用标准分子生物学方法（例如,使用去污剂或离液序列高的盐）直接溶解，及将DNA由数字PCR使用特异于胚胎DNA及总DNA的靶表征及定量。

图1和2显示此数字PCR分析的结果。通过用针对β-珠蛋白基因的引物的数字PCR测定总DNA的基因组当量。图1中各对条的左条反映自怀男性胎儿的32周怀孕的患者分离的基因组当量，及右条反映自非-怀孕的女性对照分离的基因组当量。PLAP指示当将结合胎盘碱性磷酸酶的抗体用于捕获胚胎微粒时获得结果。G233，G1和G9指示当将各那些抗体（其结合人白细胞抗原G（HLA-G）的不同表位）用于捕获胚胎微粒时获得结果。CD41指示当使用结合CD41（血小板的标志物）的抗体时获得结果。fas-L指示当使用结合Fas-L（Fas配体,凋亡的标志物）的抗体时获得结果。图1展示抗体交联的珠能捕获含有DNA的微粒。

图2是显示被捕获的微粒中胚胎DNA的基因组当量的图。因为胎儿是男性，通过用针对DYS1基因的引物的数字PCR测定胚胎DNA的基因组当量。或者，知道由父亲贡献的特定序列也可用于检测胚胎DNA。图2中各对条的左条反映自怀男性胎儿的32周怀孕的患者分离的基因组当量，及右条反映自非-怀孕的女性对照分离的基因组当量。为在各实验中微粒捕获使用的生物标志物在以下各对条中显示。胚胎DNA的富集通过使用用于此样品的微粒捕获的抗-PLAP抗体实现。图2展示抗体交联的珠能捕获及富集含有DNA的胚胎微粒。

图3显示来自此相同的实验的DNA的百分率产率（在由微粒捕获富集之后及如由数字PCR测定）。小图A是显示在富集之后总DNA的百分率产率的图，及小图B是显示在富集之后胚胎DNA的百分率产率的图。产率是相对于在微粒捕获之前存在于母源血浆中的量的总或胚胎DNA的量（即,在捕获之前对于总和胚胎DNA分别是1350基因组相当的(GE)/mL血浆和194GE/mL血浆）。各对条的左条反映自怀男性胎儿的32周怀孕的患者分离的基因组当量，及右条反映自非-怀孕的女性对照分离的基因组当量。为在各实验中微粒捕获使用的生物标志物在以下各对条中显示，及将抗-PLAP用于富集。图3还展示抗体交联的珠能捕获及富集含有DNA的胚胎微粒。因为PLAP是晚期孕龄标记物，为捕获及富集的此标记物的使用可对于晚期孕龄筛选有用。其他早期孕龄标记物会对于早期出生前诊断有用。

图4是显示在此相同的实验中用各种生物标志物捕获之后获得的胚胎DNA的富集的图。富集倍数计算为在富集之后的百分率胚胎DNA除以在微粒捕获之前母源血浆中的百分率胚胎DNA（例如,2倍富集是胚胎级分的倍增;1倍是无富集）。此实验中使用的血浆样品来自怀男性胎儿的32周怀孕的患者。为在各实验中微粒捕获使用的生物标志物在以下各对条中显示。图4还展示抗体交联的珠能成功地捕获及富集含有DNA的胚胎微粒。

【实施例2：胚胎染色体异常的出生前诊断】

从要测定12周妊娠的胎儿的染色体状态的怀孕的女性患者得到全血样品，及将样品于22～23℃以1600g离心10分钟以分离血浆级分。然后将血浆级分以3500g和22～23℃旋转另外的10分钟以移出细胞碎片和血小板。将与针对胚胎生物标志物HLA-G制造的抗体交联的聚苯乙烯珠加入血浆级分及于4℃温育几小时以捕获胚胎微粒。在捕获之后，将微粒使用标准分子生物学方法在珠上直接溶解。将DNA通过使用标准分子生物学技术表征以检测非整倍性或其他特定染色体异常。未检测到染色体异常，及将此信息提供给患者。

【实施例3：血样品中癌微粒的富集】

从怀疑具有淋巴瘤的患者得到全血样品。将全血样品以1600g于22～23℃离心10分钟以分离血浆级分，然后将血浆级分以3500g和22～23℃再旋转另外10分钟以移出细胞碎片和血小板。将与针对癌细胞生物标志物制造的抗体交联的聚苯乙烯珠加入血浆级分及于4℃温育几小时以捕获在患者的血中循环的癌微粒或细胞。在捕获之后，将微粒使用标准分子生物学方法在珠上直接溶解。DNA通过使用标准分子生物学技术表征以检测与淋巴瘤关联的突变。检测关联突变，及将此信息随着建议的治疗选项提供给患者。

虽然已参照其特定实施方式描述及例证本发明，本领域技术人员会同意，可对本发明制造各种变化，修饰和取代而不离开本发明的精神和范围。本文中的全部专利，公开的专利申请，及其他非-专利参考文献通过引用以它们的整体在本文合并。

【参考文献】

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Claims (59)

1.富集生物学样品中的微粒亚群的方法，包括：

将生物学样品与结合来自亚群的微粒的结合分子组合，以及

分离生物学样品的2种或更多级分，其中就微粒亚群富集含有结合分子的级分。

2.权利要求1的方法，其中生物学样品包括下列中的至少一种：全血样品，血浆样品，血清样品和其他血级分样品。

3.权利要求1的方法，其中结合分子是抗体或抗体片段。

4.权利要求1的方法，其中结合分子结合胚胎微粒及不结合母源微粒。

5.权利要求3的方法，其中抗体或抗体片段结合胎盘碱性磷酸酶（PLAP），人白细胞抗原G（HLA-G），或Fas配体（Fas-L）。

6.权利要求5的方法，其中抗体或抗体片段结合HLA-G。

7.权利要求6的方法，其中抗体或抗体片段是G1，G9或G233。

8.权利要求3的方法，其中抗体或抗体片段具有可检测的标记物。

9.权利要求3的方法，其中抗体或抗体片段附接于固体支持物。

10.权利要求9的方法，其中固体支持物是珠或树脂，其包括下列中的至少一种：聚苯乙烯，磁，琼脂糖和聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺。

11.权利要求9的方法，其中固体支持物是柱。

12.权利要求1的方法，其中2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。

13.权利要求1的方法，其中在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品处理而去除内源性抗体。

14.权利要求1的方法，其中在将生物学样品与胚胎特异性结合分子组合之前，将生物学样品与结合母源微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的母源微粒。

15.富集生物学样品中的胚胎核酸的方法，包括：

将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，

分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分，以及

自含有结合分子的级分分离核酸，由此富集生物学样品中的胚胎核酸。

16.权利要求15的方法，其中生物学样品包括下列中的至少一种：全血样品，血浆样品，血清样品和其他血级分样品。

17.权利要求15的方法，其中结合分子是抗体或抗体片段。

18.权利要求17的方法，其中抗体或抗体片段结合胚胎微粒及不结合母源微粒。

19.权利要求17的方法，其中抗体或抗体片段结合胎盘碱性磷酸酶（PLAP），人白细胞抗原G（HLA-G），或Fas配体（Fas-L）。

20.权利要求19的方法，其中抗体或抗体片段结合HLA-G。

21.权利要求20的方法，其中抗体或抗体片段是G1，G9或G233。

22.权利要求17的方法，其中抗体或抗体片段具有可检测的标记物。

23.权利要求17的方法，其中抗体或抗体片段附接于固体支持物。

24.权利要求23的方法，其中固体支持物是珠或树脂，其包括下列中的至少一种：聚苯乙烯，磁，琼脂糖和聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺。

25.权利要求23的方法，其中固体支持物是柱。

26.权利要求15的方法，其中2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。

27.权利要求15的方法，其中在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品处理而去除内源性抗体。

28.权利要求15的方法，其中在将生物学样品与胚胎特异性结合分子组合之前，将生物学样品与结合母源微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的母源微粒。

29.辅助胎儿中的染色体异常的出生前诊断的方法，包括：

自怀孕的女性获得生物学样品，

将生物学样品与结合胚胎微粒的结合分子组合，

分离生物学样品的2种或更多级分，其中就胚胎微粒富集含有结合分子的级分，

自含有结合分子的级分分离核酸，以及

分析核酸以检测染色体异常的存在或缺失。

30.权利要求29的方法，其中染色体异常是非整倍性。

31.权利要求30的方法，其中非整倍性是第13，18或21染色体的非整倍性。

32.权利要求29的方法，其中染色体异常是与疾病关联的突变。

33.权利要求29的方法，其中生物学样品在胎儿孕龄小于约16周时从女性得到。

34.权利要求29的方法，其中在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品处理而去除内源性母源抗体。

35.权利要求29的方法，其中生物学样品是全血样品或血浆样品。

36.权利要求29的方法，其中结合分子是抗体或抗体片段。

37.权利要求36的方法，其中抗体或抗体片段结合胚胎微粒及不结合母源微粒。

38.权利要求36的方法，其中抗体或抗体片段结合胎盘碱性磷酸酶（PLAP），人白细胞抗原G（HLA-G），或Fas配体（Fas-L）。

39.权利要求38的方法，其中抗体或抗体片段结合HLA-G。

40.权利要求39的方法，其中抗体或抗体片段是G1，G9或G233。

41.权利要求36的方法，其中抗体或抗体片段具有可检测的标记物。

42.权利要求36的方法，其中抗体或抗体片段附接于固体支持物。

43.权利要求42的方法，其中固体支持物是珠或树脂，其包括下列中的至少一种：聚苯乙烯，磁，琼脂糖和聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺。

44.权利要求42的方法，其中固体支持物是柱。

45.权利要求29的方法，其中2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。

46.权利要求29的方法，其中DNA通过使用数字PCR分析。

47.权利要求29的方法，其中在将生物学样品与胚胎特异性结合分子组合之前，将生物学样品与结合母源微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的母源微粒。

48.辅助癌诊断的方法，包括：

自患者获得生物学样品，

将生物学样品与结合源于癌细胞的微粒的结合分子组合，

分离生物学样品的2种或更多级分，其中就源于癌细胞的微粒富集含有结合分子的级分，

自含有结合分子的级分分离核酸，以及

分析核酸以检测与癌关联的突变的存在或缺失，其中突变的存在指示患者具有癌。

49.权利要求48的方法，其中在生物学样品与结合分子组合之前，将生物学样品处理而去除内源性抗体。

50.权利要求48的方法，其中在将生物学样品与癌特异性结合分子组合之前，将生物学样品与结合自预期存在于生物学样品中的细胞形成的微粒的结合分子组合而去除生物学样品中的该微粒。

51.权利要求48的方法，其中生物学样品包括下列中的至少一种：全血样品，血浆样品，血清样品，其他血级分样品，或与癌或患病细胞接触的任何体液样品。

52.权利要求48的方法，其中结合分子是抗体或抗体片段。

53.权利要求52的方法，其中抗体或抗体片段结合源于癌的微粒及不结合源于正常细胞的微粒。

54.权利要求52的方法，其中抗体或抗体片段具有可检测的标记物。

55.权利要求52的方法，其中抗体或抗体片段附接于固体支持物。

56.权利要求55的方法，其中固体支持物是珠或树脂，其包括下列中的至少一种：聚苯乙烯，磁，琼脂糖和聚丙烯酰胺/双-丙烯酰胺。

57.权利要求55的方法，其中固体支持物是柱。

58.权利要求48的方法，其中2种或更多级分由流式细胞术，尺寸排阻过滤，或磁粒子浓缩分离。

59.权利要求48的方法，其中DNA通过使用数字PCR分析。

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