CN105132565A - 用于心脏病诊断和分型的超敏分子标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于心脏病诊断和分型的超敏分子标记物及其应用。该生物标志物为AhR，可制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、亚型鉴别和临床诊断的试剂、试剂盒、芯片等相关工具、产品。本发明的生物标记物AhR基因与冠心病发生发展密切相关，利用该AhR基因作为预测冠心病发生和判断冠心病发展程度的生物标志物，与目前常规的病理分型诊断冠心病发病和预后相比，可以更加个体化、准确、灵敏地预测和鉴别冠心病的早期发病情况、恶性程度及病理亚型。

Description

用于心脏病诊断和分型的超敏分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物标志物，具体涉及一种冠心病诊断和分型的超敏生物标志物——血清AhR分子及其在冠心病筛查与临床鉴别中的应用，属于检验医学、临床医学、生物技术、生物化学及分子生物学领域。

背景技术

冠心病（CAD）在全世界范围内尤其是在一些发展中国家拥有较高的发病率和死亡率。据WHO预测，直至2030年，每年将会有23,600,000人死于心血管疾病。冠心病病理学过程复杂，通常被认为是遗传和环境因子共同作用的结果。在过去几十年中，很多因素，如吸烟、高血压、糖尿病（DM）、动脉硬化、肥胖和节食等被证实与冠心病有关，但冠心病的具体发病机理仍不清楚。越来越多的证据说明炎症在冠心病的发病过程中扮演着重要作用，其发病具有明显的家族聚集性，大量的遗传易感基因在疾病的发生发展过程中起着重要作用，所涉及的条件十分复杂，该疾病确切的发病机制至今仍不清楚，从而限制了冠心病诊治有效易感基因的发掘。

AhR是一种HLHPAS结合蛋白家族的转录因子，传统上被作为生物体环境毒性和代谢酶的介导因子。近年来，一些研究逐渐显示该蛋白在心血管系统发育、功能形成和疾病发生等过程发挥重要作用，例如通过AhR基因敲除小鼠的研究，发现小鼠罹患多种典型症状，包括心肌肥大、血管重构和高血压等，而在ApoE缺失的动脉粥样硬化小鼠模型中，AhR基因的激活诱导血管炎症的发生，并促进动脉硬化程度，以上结论均说明AhR受体在心血管疾病的发生发展中具有重要影响，然而其对人类冠心病的系统作用机制及临床应用还少见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种冠心病诊断和分型的超敏生物标志物，该生物标记物用于冠心病筛查与临床鉴别具有高靶向性、稳定性、超灵敏的特点。

本发明所述的检测冠心病的血清学生物标记物为血清AhR分子，该生物标记物AhR所分离出的DNA分子包括：编码具有芳香烃受体活性的多肽的核苷酸序列，其基因表达如SEQIDNO.4；所述多肽氨基酸序列如SEQIDNO.5。

本发明的另一个目的在于提供上述一种检测冠心病的血清学生物标记物AhR的用途：作为用于制备判断冠心病发生的生物标志物试剂的应用，包括制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、临床诊断、分子分型和生化检验的试剂、试剂盒。

所述试剂盒包括引物系统、引物探针系统；所述引物系统由AhR的cDNA扩增引物和锚定引物组成；所述引物探针系统由AhR的cDNA扩增引物和探针组成。所述AhR的cDNA扩增引物为：

上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1：5’-ATTGTGCCGAGTCCCATATC-3’；

下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2：5’-AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3’。

所述检测该标志物的技术包括但不限于荧光定量PCR技术或芯片法，或其他基因检测的相关技术。

所述AhR的探针由以下核苷酸序列（SEQIDNO.3）组成：(6-FAM)AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)。

所述荧光定量PCR技术为DNA染料法或TaqMan探针法。

在采用荧光定量PCR检测方法时，使用特异性基因的AhR作为靶分子，其cDNA扩增引物为：

上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1：5’-ATTGTGCCGAGTCCCATATC-3’；

下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2：5’-AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3’；

其探针核苷酸序列如SEQIDNO.3：

(6-FAM)AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)。

本发明相对于现有技术的有益技术效果如下：本发明的生物标记物AhR分子与冠心病的发生发展密切相关，利用AhR分子作为预测冠心病发生和判断冠心病发展程度的生物标记物，与目前常规的病理分型诊断冠心病发病和预后相比，可以更加个体化、准确地预测冠心病的早期发病情况、恶性程度及病理亚型。

附图说明

图1：冠心病组与对照组（Non-CAD）血清AhR水平比较（***P<0.0001）；图2：四种亚型冠心病：ST段抬高心肌梗死（STEMI）、非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）、稳定性心绞痛（SAP）和不稳定性心绞痛（UAP），与对照组（Control）血清AhR水平比较（**P<0.01）；图3：血清AhR基因水平诊断冠心病的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

受试群体：受试对象来自医院诊治的患者。

冠心病患者入选标准：既往有心肌梗死病史，或者冠状动脉造影检查至少有一支冠状动脉狭窄≥50%；年龄大于18岁且小于80岁。

排除标准：静息时有心绞痛；合并严重心力衰竭患者（EF<35%）；合并严重瓣膜疾病或心肌病患者。

一共选取冠心病组180例，非冠心病组169例，所有受试对象均签署知情同意书。病例基本信息表见表1。

表1病例基本信息表

。

实施例2血液总RNA提取

（1）红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液（例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl10×红细胞裂解液），用RNase-freeddH₂O稀释至1×红细胞裂解液；

（2）向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液（需自备合适的干净管子）；注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的裂解液RL的使用体积也要进行相应调整；

（3）在冰上孵育10~15分钟，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次；注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20分钟；

（4）4℃2,100rpm(~400×g)离心10分钟，将上清完全去除；注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失；

（5）向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液（加入1×红细胞裂解液的体积是第1步中全血用量的2倍），重悬细胞；

（6）4℃，2,100rpm(~400×g)离心10分钟，将上清完全去除；注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低；

（7）向白细胞沉淀中加入裂解液RL（使用前加入β-巯基乙醇），采用涡旋或使用移液器混匀；如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RL的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失；

（8）将溶液转移至过滤柱CS中（过滤柱CS放在收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，弃去过滤柱CS，收集滤液；注意：为避免气溶胶的形成，将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况；

（9）向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350μl或600μl），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中（吸附柱CR2放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；注意：配制70%乙醇时使用RNase-freeddH₂O，如果滤液体积有所损失，相应减少70%乙醇用量；将溶液和沉淀转移至吸附柱CR2时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成；

（10）向吸附柱CR2中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(~13,400×g)离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

（11）DNaseI工作液的配制：取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；（12）向吸附柱CR2中央加入80μl的DNaseI工作液，室温放置15分钟；

（13）向吸附柱CR2中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(~13,400×g)离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

（14）向吸附柱CR2中加入500μl漂洗液RW（使用前先检查是否已加入乙醇），室温静置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

（15）重复步骤14；

（16）12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR2在室温放置片刻，以充分晾干；如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验；

（17）将吸附柱CR2转入一个新的RNase-free离心管中，加入30~50μlRNase-freeddH₂O室温放置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，得到RNA溶液；注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液于-70℃保存。

实施例3逆转录合成mRNA的cDNA第一链

（1）在微量离心管内配制下列反应液，总量为20μl：模板RNA溶液1μg，5×ReverseTranscriptaseBuffer4μl，dNTPMixture（10mMeach）2μl，RNaseInhibitor20U，Oligo(dT)18Primer50pmol，AMVReverseTranscriptase10U，加RNaseFreeWater至20μl；

（2）轻轻吸打混匀；

（3）室温放置10分钟后移入42℃恒温槽中；

（4）42℃保温1小时；

（5）在冰水中冷却2分钟。

实施例4荧光定量PCR

（1）按下列组份配制PCR反应液（冰上进行）：SYBRPremixExTaq（TliRNaseHPlus,2×）12.5μl，ForwardPrimer（10μM）1μl，ReversePrimer（10μM）1μl，cDNA模板2μl，dH₂O8.5μl；

（2）反应条件（RocheCycler480）：

a.变性：95℃30s；1cycle；

b.PCR：分析模式：定量分析；95℃5s；60℃30s；40cycles；

c.融解：分析模式：融解曲线；93℃5s；60℃1min；1cycle。

实施例5AhR表达水平与冠心病易感性和进展程度的关联分析

将所有生理生化指标包括身体质量指数（BMI）、肌酐酸（CK）、肌酸激酶（CK-MB）、葡萄糖（Glu）、葡萄糖2小时（Glu2h）、脂蛋白A（Lpa）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、尿酸（SUA）、胆固醇（Chol）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、载脂蛋白A1（ApoA1）、载脂蛋白B(ApoB）、肌红蛋白（MYO）、肌钙蛋白（TnI-hs）、脑钠肽（BNP）、AhR进行冠心病组与对照组、不同性别组、不同年龄组、冠心病亚组之间、对照组亚组之间进行统计学分析。所有数据均采用±s表示，两样本均数间比较采用学生t检验（student’sttest）；冠心病组与对照组之间病史的比较采用卡方检验；相关性分析用logistic回归分析。用统计软件SPSS20.0进行统计学分析，当P值（Pvalue）<0.05时认为存在显著差异。血清中AhR与冠心病及其风险因素的相关性用多元逻辑回归模型进行分析，并通过ROC曲线等统计学方法与目前常见临床生化标志物进行比较和评估各AhR对冠心病的识别能力及诊断价值。

血清AhR基因水平诊断冠心病的ROC曲线如图3所示。结果表明，随机选取53例对照组和57例冠心病患者检测血清AhR的相对表达量，与对照组比较，冠心病组显著增高了约2.197倍，且不同类型冠心病组之间也有明显差异。

序列表

<110>雷桅

<120>用于心脏病诊断和分型的超敏分子标志物及其应用

<160>5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

attgtgccgagtcccatatc

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aagcaggcgtgcattagact

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aguuuugcauaguugcacuaca

<210>4

<211>4778

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>（54）...（752）

<400>4

1gaacggaagctgggagcagccgggactggtggcccgcgcccgagctccgcaggcgggaag

61caccctggatttgggaagtcccgggagcagcgcggcggcacctccctcacccaaggggcc

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2101gctggaggtcacccagggctctttcaagatagtaaaaacagtgacttgtacagcataatg

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4681tagatttttgcttaaagtatgatttataatatcctcattatcaaagttgtatacaataat

4741atataataaaataacaaatacgaaaaaaaaaaaaaaaa

<210>5

<211>848

<212>氨基酸

<213>人工序列

<400>5

MetAsnSerSerSerAlaAsnIleThrTyrAlaSerArgLysArgArgLysProValGln

15101520

LysThrValLysProIleProAlaGluGlyIleLysSerAsnProSerLysArgHisArg

25303540

AspArgLeuAsnThrGluLeuAspArgLeuAlaSerLeuLeuProPheProGlnAspVal

30354045

IleAsnLysLeuAspLysLeuSerValLeuArgLeuSerValSerTyrLeuArgAlaLys

50556065

SerPhePheAspValAlaLeuLysSerSerProThrGluArgAsnGlyGlyGlnAspAsn

70758085

CysArgAlaAlaAsnPheArgGluGlyLeuAsnLeuGlnGluGlyGluPheLeuLeuGln

9095100105

AlaLeuAsnGlyPheValLeuValValThrThrAspAlaLeuValPheTyrAlaSerSer

110115120125

ThrIleGlnAspTyrLeuGlyPheGlnGlnSerAspValIleHisGlnSerValTyrGlu

130135140145

LeuIleHisThrGluAspArgAlaGluPheGlnArgGlnLeuHisTrpAlaLeuAsnPro

150155160165

SerGlnCysThrGluSerGlyGlnGlyIleGluGluAlaThrGlyLeuProGlnThrVal

170175180185

ValCysTyrAsnProAspGlnIleProProGluAsnSerProLeuMetGluArgCysPhe

190195200205

IleCysArgLeuArgCysLeuLeuAspAsnSerSerGlyPheLeuAlaMetAsnPheGln

210215220225

GlyLysLeuLysTyrLeuHisGlyGlnLysLysLysGlyLysAspGlySerIleLeuPro

230235240245

ProGlnLeuAlaLeuPheAlaIleAlaThrProLeuGlnProProSerIleLeuGluIle

250255260265

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270275280285

AspAlaLysGlyArgIleValLeuGlyTyrThrGluAlaGluLeuCysThrArgGlySer

290295300305

GlyTyrGlnPheIleHisAlaAlaAspMetLeuTyrCysAlaGluSerHisIleArgMet

310315320325

IleLysThrGlyGluSerGlyMetIleValPheArgLeuLeuThrLysAsnAsnArgTrp

330335340345

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350355360365

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370375380385

LysLeuProPheMetPheThrThrGlyGluAlaValLeuTyrGluAlaThrAsnProPhe

390395400405

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410415420425

AlaThrThrSerThrLeuSerLysAspSerLeuAsnProSerSerLeuLeuAlaAlaMet

430435440445

MetGlnGlnAspGluSerIleTyrLeuTyrProAlaSerSerThrSerSerThrAlaPro

450455460465

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470475480485

AlaProMetGlyAsnAspThrIleLeuLysHisGluGlnIleAspGlnProGlnAspVal

490495500505

AsnSerPheAlaGlyGlyHisProGlyLeuPheGlnAspSerLysAsnSerAspLeuTyr

510515520525

SerIleMetLysAsnLeuGlyIleAspPheGluAspIleArgHisMetGlnAsnGluLys

530535540545

PhePheArgAsnAspPheSerGlyGluValAspPheArgAspIleAspLeuThrAspGlu

550555560565

IleLeuThrTyrValGlnAspSerLeuSerLysSerProPheIleProSerAspTyrGln

570575580590

GlnGlnGlnSerLeuAlaLeuAsnSerSerCysMetValGlnGluHisLeuHisLeuGlu

595600605610

GlnGlnGlnGlnHisHisGlnLysGlnValValValGluProGlnGlnGlnLeuCysGln

615620625630

LysMetLysHisMetGlnValAsnGlyMetPheGluAsnTrpAsnSerAsnGlnPheVal

635640645650

ProPheAsnCysProGlnGlnAspProGlnGlnTyrAsnValPheThrAspLeuHisGly

655660665670

IleSerGlnGluPheProTyrLysSerGluMetAspSerMetProTyrThrGlnAsnPhe

675680685690

IleSerCysAsnGlnProValLeuProGlnHisSerLysCysThrGluLeuAspTyrPro

695700705710

MetGlySerPheGluProSerProTyrProThrThrSerSerLeuGluAspPheValThr

715720725730

CysLeuGlnLeuProGluAsnGlnLysHisGlyLeuAsnProGlnSerAlaIleIleThr

735740745750

ProGlnThrCysTyrAlaGlyAlaValSerMetTyrGlnCysGlnProGluProGlnHis

755760765770

ThrHisValGlyGlnMetGlnTyrAsnProValLeuProGlyGlnGlnAlaPheLeuAsn

775780785790

LysPheGlnAsnGlyValLeuAsnGluThrTyrProAlaGluLeuAsnAsnIleAsnAsn

795800805810

ThrGlnThrThrThrHisLeuGlnProLeuHisHisProSerGluAlaArgProPhePro

815820825830

AspLeuThrSerSerGlyPheLeu***

835

Claims (8)

1.一种检测冠心病的血清学生物标记物AhR，其特征在于：该生物标记物AhR所分离出的DNA分子包括：编码具有芳香烃受体活性的多肽的核苷酸序列，其基因表达如SEQIDNO.4；所述多肽氨基酸序列如SEQIDNO.5。

2.根据权利要求1所述的血清学分子生物标记物AhR的用途，其特征在于：用于制备判断冠心病发生的生物标志物试剂，包括制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、临床诊断、分子分型和生化检验的试剂、试剂盒。

3.根据权利要求2所述的血清学分子生物标记物AhR的用途，其特征在于：所述试剂盒包括引物系统、引物探针系统；

所述引物系统由AhR的cDNA扩增引物和锚定引物组成；

所述引物探针系统由AhR的cDNA扩增引物和探针组成。

4.根据权利要求3所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述试剂盒检测该标志物的技术为荧光定量PCR技术或芯片法。

5.根据权利要求3所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述AhR的cDNA扩增引物为：

上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1：5’-ATTGTGCCGAGTCCCATATC-3’；

下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2：5’-AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3’。

6.据权利要求3所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述AhR的探针由以下核苷酸序列组成：(6-FAM)AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)。

7.根据权利要求4所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：所述荧光定量PCR技术为DNA染料法或TaqMan探针法。

8.根据权利要求5所述的检测冠心病的血清学生物标志物的用途，其特征在于：在荧光定量PCR检测方法中，使用特异性基因的AhR作为靶分子，其cDNA扩增引物为：

上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1：5’-ATTGTGCCGAGTCCCATATC-3’；

下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2：5’-AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3’；

其探针为核苷酸序列如SEQIDNO.3：

(6-FAM)AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)。