CN103454237B - 基于氯过氧化物酶法检测亚硝酸盐含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于氯过氧化物酶法检测亚硝酸盐含量的方法，利用NO2 -的存在能够提高氯过氧化物酶对吲哚的氧化活性，并在一定浓度范围内与氯过氧化物酶的氧化活性成线性关系这一特性，来定量检测NO2 -的浓度。本发明方法操作简单，加标回收率95%～115.8%，检出限为0.0048mmol/L，线性范围为0.005～0.055mmol/L，该方法准确、可靠，精密度高，检出限低，绿色环保，可检测的样品范围广泛，对食品安全评估具有一定意义。
Description
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种基于氯过氧化物酶与NO2 -之间的相互作用来检测食品中亚硝酸盐含量的方法。
背景技术
亚硝酸盐对人体有极大危害，它可与人体血红蛋白反应，使之失去载氧功能，造成高铁血红蛋白症；另一方面，亚硝酸盐还可在胃腔中形成强致癌物亚硝胺，可诱发有机体突变，对神经和肾脏有害，具有致畸性和致癌性。亚硝酸盐进入人体的途径主要是通过饮食摄入，除了饮用水、蔬菜、渍酸菜、隔夜炒菜等饮食含有一定量的亚硝酸盐之外，由于它具有抑制肉毒梭菌产生肉毒毒素的作用，赋予肉制品特有的颜色、风味和质地的作用，还被广泛应用于肉制品的生产过程中。
随着近代分析化学的发展和新仪器的应用，亚硝酸盐的测定方法已经相当多样和完善，选择性和灵敏度都在不断提高。其中气相色谱-热能分析法是检测的标准方法，但热能分析仪价格昂贵，应用范围窄，适应性不强，一般实验室都没有配备；同时待测定的样品中目标组分含量低，而其他的成分却十分复杂，而且数量大，干扰作用较多。因此建立方便、易行、选择性好的检测方法非常必要。
氯过氧化物酶（CPO）是从海洋真菌Caldariomyces fumago中分离出来的一种血红素过氧化物酶，其具有多种多样的催化活性，因而被认为是过氧化物酶家族中应用最广泛的酶。目前基于过氧化物酶的亚硝酸盐检测体系还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于氯过氧化物酶法检测食品中亚硝酸盐含量的方法，该方法操作简单、选择性好、适用范围广泛。
解决上述技术问题所采用的技术方案是由下述步骤组成：
1、测定氯过氧化物酶的氧化活性
将5μL8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液、695μL pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入1mL比色皿中，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A1270nm。
2、测定NO2 -存在时氯过氧化物酶的相对氧化活性
将5μL8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液加入1mL比色皿中，再加入1mmol/L的NaNO2水溶液和pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，保持混合液的总体积为1mL，混合液中NO2 -离子的浓度为0.005～0.055mmol/L，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A2270nm，按下述公式（1）计算氯过氧化物酶的相对氧化活性
氯过氧化物酶的相对氧化活性=△A2270nm/△A1270nm （1）
3、确定工作曲线及方程
以NO2 -的浓度为横坐标，氯过氧化物酶的相对氧化活性为纵坐标，由计算机绘制工作曲线，并得出工作曲线的线性回归方程为y=1.0364+55.02x，式中y是氯过氧化物酶的相对氧化活性，x是NO2 -的浓度，相关系数为0.9975。
4、测定样品中亚硝酸盐含量
将5μL8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液加入1mL比色皿中，再加入10～20μL样品浸出液和pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，保持混合液的总体积为1mL，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A2270nm，按公式（1）计算氯过氧化物酶的相对氧化活性，将此值代入线性回归方程，计算样品中亚硝酸盐的含量。
本发明的检测对象是生活中常见的腌辣椒、腌芥菜、榨菜和火腿肠，本发明所采用的的酶法检测，操作简单、选择性好、适用范围广泛。
附图说明
图1是实施例1绘制的工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不仅限于这些实施例。
实施例1
1、测定氯过氧化物酶的氧化活性
将5μL8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液、695μL pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入1mL比色皿中，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A1270nm。
2、测定NO2 -存在时氯过氧化物酶的相对氧化活性
取7个1mL比色皿，每个比色皿中均加入5μL8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液，再分别加入5、10、20、30、40、50、55μL1mmol/L的NaNO2水溶液，然后用pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液补加至7个比色皿中混合液的总体积均为1mL，混合液中NO2 -离子的浓度为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.055mmol/L，分别用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A2270nm，按下述公式（1）计算氯过氧化物酶的相对氧化活性
氯过氧化物酶的相对氧化活性=△A2270nm/△A1270nm （1）
3、确定工作曲线及方程
以NO2 -的浓度为横坐标，氯过氧化物酶的相对氧化活性为纵坐标，由计算机绘制工作曲线，如图1所示，并得出工作曲线的线性回归方程为y=1.0364+55.02x，式中y是氯过氧化物酶的相对氧化活性，x是NO2 -的浓度，相关系数为0.9975。
4、测定腌辣椒中亚硝酸盐含量
将30g腌辣椒用纱布裹好、包扎之后置于200mL去离子水中，放置在摇床中，调节转速为180转/分钟，室温震荡24小时，使其中的亚硝酸盐完全浸出，取出腌辣椒的浸出液。
将5μL8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液、20μL腌辣椒的浸出液和pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，保持混合液的总体积为1mL，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A2270nm，按公式（1）计算氯过氧化物酶的相对氧化活性，将此值代入线性回归方程，经计算，腌辣椒中亚硝酸盐（以NaNO2计）的含量为0.532mg/kg。
实施例2
按照实施例1的方法测定腌芥菜中亚硝酸盐的含量，经计算腌芥菜中亚硝酸盐（以NaNO2计）的含量为8.280mg/kg。
实施例3
按照实施例1的方法测定榨菜中亚硝酸盐的含量，经计算榨菜中亚硝酸盐（以NaNO2计）的含量为17.000mg/kg。
实施例4
按照实施例1的方法测定火腿肠中亚硝酸盐的含量，经计算火腿肠中亚硝酸盐（以NaNO2计）的含量为18.860mg/kg。
为了证明本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究实验，各种情况如下：
1、本发明方法的加标回收率
取4个50mL的离心管，向其中加入30mL1mmol/L的NaNO2水溶液，再分别向4个离心管中依次加入5、11.25、17.5、23.75mL的4mmol/L的NaNO2水溶液，配制成浓度为1.429、1.818、2.105、2.325mmol/L的待测样品溶液。按照实施例1的方法测定各样品溶液中NO2 -的含量。测定结果见表1。
表1利用本发明测定的加标回收率
| NO2 -原含量（mmol） | NO2 -添加量（mmol） | NO2 -实际含量（mmol） | 测试量（mmol） | 回收率（%） |
| 0.03 | 0.02 | 0.05 | 0.049 | 95 |
| 0.03 | 0.045 | 0.075 | 0.080 | 111.1 |
| 0.03 | 0.07 | 0.1 | 0.110 | 114.3 |
| 0.03 | 0.095 | 0.125 | 0.140 | 115.8 |
由表1可以看出，本发明的加标回收率为95%～115.8%。
2、本发明方法的精密度
用本发明实施例1的测定方法对同一试样测定6次，测定结果见表2。
表2本发明测定法的精密度
3、本发明方法的检出限
分别配制0.5、1.0mmol/L的NaNO2水溶液（即待测样品溶液），按照实施例1的方法测定各待测样品溶液中NO2 -的含量。测定结果见表3。
表3本发明方法的检出限
从表3可以看出，当NO2 -的浓度为0.01mmol/L时，其S值为0.0015，RSD%为15.96，CL为0.0048mmol/L的统计参数比较合理，CL为0.0048mmol/L是本发明的方法检出限。
Claims (1)
1.一种基于氯过氧化物酶法检测亚硝酸盐含量的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)测定氯过氧化物酶的氧化活性
将5μL 8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL 2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液、695μL pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入1mL比色皿中，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A1270nm；
(2)测定NO2 -存在时氯过氧化物酶的相对氧化活性
将5μL 8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL 2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液加入1mL比色皿中，再加入1mmol/L的NaNO2水溶液和pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，保持混合液的总体积为1mL，混合液中NO2 -离子的浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.055mmol/L，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A2270nm，按下述公式(1)计算氯过氧化物酶的相对氧化活性
氯过氧化物酶的相对氧化活性＝△A2270nm/△A1270nm (1)
(3)确定工作曲线及方程
以NO2 -的浓度为横坐标，氯过氧化物酶的相对氧化活性为纵坐标，由计算机绘制工作曲线，并得出工作曲线的线性回归方程为y＝1.0364+55.02x，式中y是氯过氧化物酶的相对氧化活性，x是NO2 -的浓度，相关系数为0.9975；
(4)测定样品中亚硝酸盐含量
将5μL 8μmol/L的氯过氧化物酶水溶液、200μL 2mmol/L的吲哚水溶液、100μL3mmol/L的双氧水溶液加入1mL比色皿中，再加入10～20μL样品浸出液和pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，保持混合液的总体积为1mL，用紫外可见分光光度计在波长270nm处测定30s内其吸光度变化量，记为△A2270nm，按公式(1)计算氯过氧化物酶的相对氧化活性，将此值代入线性回归方程，计算样品中亚硝酸盐的含量。
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