CN103451167A - 促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，该方法包括以下步骤：(1)将活化后的毛霉菌接种至固态培养基内培养；(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。本发明同现有技术中的胞内产酶相比较，其生产工艺简单、适合规模化生产，耐热性高、稳定性好、安全稳定无污染，作用pH更适宜人体的体内生物环境。

Description

促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法

技术领域

本发明涉及毛霉培养产酶的制备方法，尤其是一种促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法。

背景技术

乳糖酶，又被称为β-半乳糖苷酶(拉丁文名称：β-Galactosidase)，主要用于乳品工业，可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的葡萄糖和半乳糖；使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。但由于种种原因，大部分人的体内缺少上述乳糖酶，造成很多人患有乳糖不耐症，即人们在饮用牛奶后常会引起对牛奶中的主要碳水化合物——乳糖的消化不良，出现腹涨、肠鸣、急性腹痛甚至腹泻等症状，在中国，根据科研人员的研究结果，成年人饮用牛奶后乳糖吸收不良的发生率高达86.7％，不耐受指数为0.9。而乳糖不耐症的会导致胃肠失调，造成有价值的蛋白质和矿物质损失，甚至影响到婴幼儿的智力发育，故欧洲不少国家常将乳糖酶加入牛奶，供婴儿饮用。

目前国内乳糖酶的产业化生产还存在着很大的问题，乳糖酶并未得到广泛应用，其主要原因是：乳糖酶的单位产量较低，市场销售的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，其提取纯化工艺复杂，成本高；酶的作用温度低，耐热性差，生产过程中很容易染杂菌，适用范围窄。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用毛霉菌株进行胞外产酶的乳糖酶的制备和纯化方法，该方法包括以下步骤：

(1)将活化后的毛霉菌(拉丁文名称：Mucor)接种至固态培养基内培养；

(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；

(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。

步骤(1)中所述的活化后的毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10～15％。

步骤(1)中固态培养基包括：

(1)麸皮、黄豆粉或玉米粉中的一种、两种或三种；

(2)麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种；

(3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一种；

(4)MnSO₄、KH₂PO₄、NaH₂PO₄或CaCl₂中的一种；

(5)水。

更优选的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH₂PO₄、NaH₂PO₄和水，其中麸皮与水的重量比为1∶1.0～2.0，乳糖添加量为0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量为0.04～0.08g/mL，KH₂PO₄添加量为固态培养基总重量的0.05～0.15％，NaH₂PO₄添加量为固态培养基总重量的0.10～0.2％。

上述固态培养基选用已经经过2～3次发酵培养后的固态培养基时，胞外产酶的效果更好。

步骤(1)中的培养条件是：培养温度为30～50℃，培养时间为60～80h，培养过程中每24～36h翻曲一次。

步骤(2)中的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种。

步骤(3)中的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法，层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。

本发明的优点与积极效果在于：

本发明以毛霉菌为出发菌株，在固态培养基内进行培养，通过单因素和正交试验确定了最佳的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH₂PO₄、NaH₂PO₄和水、培养后得到的粗酶液经无机絮凝剂硫酸铝处理后，再经过硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化制得乳糖酶成品，该成品经聚丙烯凝胶酰胺电泳检验后，其最终比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率为44.38％，提纯倍数为35.82，乳糖酶的作用pH为4.5～5.5，在30～60℃有较高的耐受性，在4℃冷藏条件下具有良好的稳定性，同现有技术中的胞内产酶相比较，其生产工艺简单、原料成本低、适合规模化生产，制得的乳糖酶耐热性高、稳定性好、安全稳定无污染，作用pH更适宜人体的体内生物环境。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种促进毛霉产乳糖酶的制备纯化方法包括以下步骤：

(1)将活化后的毛霉菌株接种至固态培养基内培养；

1.用接种环直接取冻存的亮色毛霉菌株DZ251，在LB培养基平板表面划线，于25-32℃培养36-42小时。

2.挑取一个单菌落，转到3～5ml LB培养基中，于25～32℃培养36～42小时。

3.将培养液全部转到100ml LB培养基中培养36～42小时，到OD600＝0.2～0.4。

步骤(1)中的活化后的毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10～15％。

步骤(1)中的固态培养基包括：

①麸皮、黄豆粉或玉米粉中的任意一种；

②麦芽糖、蔗糖或乳糖中的任意一种；

③牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一种；

④MnSO₄、KH₂PO₄、NaH₂PO₄或CaCl₂中的任意一种；

⑤水。

经过单因素和正交试验确定了更优选的固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH₂PO₄、NaH₂PO₄和水，其中麸皮与水的重量比为1∶1.0～2.0，乳糖添加量为0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量为0.04～0.08g/mL，KH₂PO₄添加量为固态培养基总重量的0.05～0.15％，NaH₂PO₄添加量为固态培养基总重量的0.10～0.2％。

上述固态培养基选用已经经过2～3次发酵培养后的固态培养基时，胞外产酶的效果更好，可提高40～55％的乳糖酶产量。

步骤(1)中的培养条件是：培养温度为30～50℃，培养时间为60～80h，培养过程中每24～36h翻曲一次，可提高乳糖酶的产量，通过适当翻曲可以使物料接种和温度保持均匀，有利于原料的利用，同时翻曲也可以延迟孢子出现的时间，使菌丝分泌更多的酶类。

(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；

步骤(2)中的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种，其不仅絮凝效果好，而且酶的回收率也高。

絮凝率的测定方法是：

取100mL乳糖酶粗酶液置于500mL烧杯中，室温和自然pH条件下，加入硫酸铝，快速混匀1min，2～3min后再慢速混匀1min，静置60min，空白不添加絮凝剂。取上层液稀释一定倍数，在620nm处以蒸馏水为参比测定吸光度OD值。絮凝率(FR)计算如下：

絮凝液过滤速率的测定方法是：

过滤5min后记录体积，换算成单位时间内的体积(mL/min)，作为衡量过滤速率(Fv)的指标。

步骤(2)中的过滤方法是：发酵液絮凝处理60min后，用9cm锥形漏斗、12cm滤纸进行过滤，滤液直接滴入量筒内。

(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。

步骤(3)中的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法，层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。

硫酸铵分级沉淀法的过程是：

将硫酸铵烘干研细，取200mL上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其浓度达20％，4℃静置2h，离心(7000r/min、15min、4℃)，沉淀溶于0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，测酶活。上清液继续加入硫酸铵粉末至浓度达40％，静置离心，沉淀溶于缓冲液，测酶活。取上清液加入硫酸铵使其浓度分别达60％、80％和90％，操作同上。

Sephadex G-100凝胶层析纯化的过程是：

1.Sephadex G-100的预处理

取2.5g Sephadex G-100，至于烧杯中，加入蒸馏水，轻轻搅拌，弃去悬浮颗粒，如此反复洗涤几次后，加入过量0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，室温下溶胀72h。

2.装柱

取直径1.0cm，长50cm的层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5～7cm的0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，然后缓慢加入溶胀好的凝胶，注意使柱中无气泡，打开出样阀。凝胶缓缓下沉，继续加入，用玻璃棒轻轻搅拌，使柱中无界限。待凝胶柱装好后，在凝胶表面放一层滤纸，避免上样时破坏胶面。用缓冲液平衡层析柱，并打开恒流泵控制流速为1mL/5min。

3.上样

将柱的上端打开，用吸管将凝胶上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱凝胶表面。拧开下端的螺旋夹，使样品进入凝胶中，快要进完时，加1mL～2mL缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。

4.洗脱、收集

当样品完全进入凝胶后，用0.005M、pH 6.28的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱速度为1mL/5min，并收集。

DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化的过程是：

1.DEAE-纤维素-52膨胀活化

称取3.0g DEAE-纤维素-52，撒于约45mL0.5mol/L NaOH溶液中，浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤(布氏漏斗加两层滤纸)，以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5mol/LHCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。

2.平衡

将DEAE-纤维素-52放入0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中(即起始缓冲液)，静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH与加入的磷酸缓冲液的pH相近时为止。

3.装柱、上样

装柱、上样过程同Sephadex G-100凝胶装柱过程。

4.洗脱、收集

用含0.15、0.25、0.35、0.45、0.55mol/LNaCl的0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，并收集。

酶活的检定方法是：

1.ONP标准曲线的制备

用已知浓度的ONP(邻硝基苯酚)溶液做标准曲线，根据ONP的浓度c对应的OD值，利用最小二乘法建立回归方程：

OD＝51648c+0.0079

OD＝420nm吸光值

c：ONPG浓度μmol/rnL

相关系数R＝0.9908；c的测定范围为0～0.15μmol/mL

邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为易溶于水的无色化合物，β-D-半乳糖苷酶催化ONPG水解生成邻硝基苯酚(ONP)，ONP在碱性溶液中呈黄色，在420nm有最大吸收峰。

(1)取1mL粗酶液于EP管中，10000r/min离心10min。取上清液0.5mL，与0.5mL反应缓冲液混合。

(2)加入0.2mL ONPG溶液，反应10min。

(3)加入0.5mL饱和碳酸钠溶液终止反应。补水至3.5mL。

(4)用紫外可见分光光度计在420nm处测定OD值。

(5)酶活力定义为：在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量定义为一个酶活单位。

$E=\frac{\mathrm{OD}-0.0079}{5.1648T}\×V\×N$

E是粗酶液中乳糖酶的酶活力，T是反应时间，V是反应体系体积，N是稀释倍数。由于是固态发酵乳糖酶，最后的酶活力单位要变为U/g曲(Y)

$Y=\frac{\mathrm{Ev}}{m}$

E是粗酶液中乳糖酶活力，V是粗酶液的总体积，m是麸皮的质量

(6)因为OD值与酶活成正比，即酶活越高，反应的越多，相应的OD值也越高，所以可以用OD值来间接反应酶活。

实施例

本实施例中涉及的仪器设备包括J-25型高速冷冻离心机、DL201型恒温自动干燥箱、BS-2F恒温振荡培养箱、HZQ-F160全温振荡培养箱、磁力搅拌器、JA2003电子天平、DZKW-C型水浴锅、蒸气消毒器、Delta 320 pH计。

1.制备孢子悬液

(1)培养好的活化菌种放入无菌室，点燃酒精灯，用75％酒精棉球擦拭双手和桌面，取3～5mL的无菌水加入到活菌培养皿内，在火焰区域内，用灭过菌的涂布器刮下孢子，使之溶于无菌水中。

(2)用移液枪吸取培养皿中的孢子液，移入灭过菌的三角瓶中。取适量无菌水稀释孢子液。在三角瓶中放入若干灭过菌的小玻璃珠，充分振荡，使孢子完全散开。

(3)用血球计数板在显微镜下计量孢子悬液的孢子数，利用无菌水稀释作用使孢子悬液的孢子数在10⁷的数量级

2.固体培养基的制备

(1)将麸皮和蒸馏水1∶1.5混合放入250mL三角瓶中，其中固体物质定量为10g，搅拌均匀，作为基础培养基。

(2)在基础培养基内添加0.06g/mL的乳糖、添加0.06g/mL的蛋白胨、添加固态培养基总重量的0.1％的KH₂PO₄，添加固态培养基总重量的0.15％的NaH₂PO₄。

(3)将三角瓶用报纸包好放入高压灭菌锅灭菌，灭菌条件：121℃，0.1Mpa，17min。

(4)将三角瓶从高压灭菌锅中取出、冷却至常温。

3.菌种接种

(1)进入无菌室，点燃酒精灯，用75％酒精棉球擦拭双手和桌面。解下捆绑在锥型瓶瓶口的绳子，保留纱布，瓶口在离火焰不远处。

(2)用移液枪往三角瓶中接入固体培养基总重量15％的菌悬液，然后用灭过菌的玻璃棒将之搅拌均匀。

4.培养

将已接种的三角瓶放入45℃的恒温培养箱中进行培养，培养72h左右效果最佳。在培养过程中，每隔24h搅拌1次。

5.粗酶液的制备

用8体积的水浸提发酵过的麸皮并匀速搅拌30min。经四层纱布过滤后即得粗酶液。

6.粗酶液的絮凝

粗酶液中加入硫酸铝制备乳糖酶半成品，粗酶液添加量为0.002-0.003g/mL。在30℃下，其絮凝效果最佳。在该条件下，过滤速度为1.52mL/min，絮凝率为88.27％，澄清率为91.46％，酶回收率87.9％。

7.乳糖酶半成品的盐析及纯化

(1)乳糖酶半成品经过硫酸铵分级沉淀法盐析、Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。

8.酶活的检定

乳糖酶成品通过聚丙烯凝胶酰胺电泳检验得到单一条带，达到电泳纯度，最终其比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率为44.38％，提纯倍数为35.82。

乳糖酶成品以邻硝基苯酚为底物的酶学性质为：最适作用pH为4.5～5.5。当pH超过6.0时酶活显著降低；其反应的最适温度为45～60℃。在30～60℃有较高的耐受性，纯酶液在4℃冷藏条件下具有良好的稳定性。

Claims (8)

1.一种促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将活化后的毛霉菌接种至固态培养基内培养；

(2)培养后的粗酶液加入无机絮凝剂沉淀，然后过滤得到半成品；

(3)半成品经盐析和层析纯化后得到乳糖酶成品。

2.根据权利要求1所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活化后的毛霉菌株接种量为固态培养基总重量的10～15％。

3.根据权利要求1或3所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述固态培养基包括：

(1)麸皮、黄豆粉或玉米粉中的一种、两种或三种；

(2)麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种；

(3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一种；

(4)MnSO₄、KH₂PO₄、NaH₂PO₄或CaCl₂中的一种；

(5)水。

4.根据权利要求1所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述固态培养基为麸皮、乳糖、蛋白胨、KH₂PO₄、NaH₂PO₄和水，其中麸皮与水的重量比为1∶1.0～2.0，乳糖添加量为0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量为0.04～0.08g/mL，KH₂PO₄添加量为固态培养基总重量的0.05～0.15％，NaH₂PO₄添加量为固态培养基总重量的0.10～0.2％。

5.根据权利要求5所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：所述固态培养基为经过2～3次发酵培养后的固态培养基。

6.根据权利要求1所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述培养的条件是：培养温度为30～50℃，培养时间为60～80h，培养过程中每24～36h翻曲一次。

7.根据权利要求1所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的无机絮凝剂为明矾、硫酸铝或氯化镁中的一种。

8.根据权利要求1所述的促进毛霉产乳糖酶的制备和纯化方法，其特征在于：步骤(3)中所述的盐析使用的是硫酸铵分级沉淀法，层析纯化包括Sephadex G-100凝胶层析纯化和DEAE-纤维素-52离子交换层析纯化。