CN110522684A - 一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛹虫草‑绿豆双向液体发酵工艺，包括以下原料比重的配方：1：10‑1:50的绿豆混合液、40‑80g葡萄糖、4‑6g MgSO4和1‑3g KH2PO4，包括以下步骤：S1、配置液体培养基，将料液比为1：10‑1:50的绿豆混合液，在50‑90℃环境下，提取1‑3h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖40‑80g、4‑6g MgSO4、1‑3g KH2PO4混匀，然后加2‑4L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基；S2、发酵培养；S3、收集蛹虫草绿豆发酵液。本发明改善使用传统氮源生产的发酵液的难闻气味，和市售蛹虫草子实体相比，蛹虫草绿豆液体发酵菌丝体的抗氧化和抗炎活性有显著提升。通过绿豆蛹虫草发酵液制备得到的啫喱在0～2h内具有较好的人体保湿功效。

Description

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺

技术领域

本发明涉及蛹虫草-绿豆双向液体发酵技术领域，具体为一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺。

背景技术

目前对于蛹虫草的应用大多为其子实体，并且主要作为一种功效性提取物进行添加和应用。但由于现在野生的蛹虫草资源急剧减少，再加上蛹虫草子实体的人工栽培受到诸多因素的限制(土地、气候、病虫害、生长周期长等)，很难大规模地进行工业化生产以及广泛地民用化使用。因此，人们对蛹虫草保健功效和治疗功效的渴求与蛹虫草子实体保有量的短缺产生了显著的矛盾。

绿豆是一种豆科、蝶形花亚科豇豆属植物，富含蛋白质、糖类、多种微量元素和人体必需维生素，其中蛋白质含量高达19.5％～33.1％，是蛋白质的良好来源之一。中医认为:“绿豆粉具有清热解毒，治痈疽疮肿初起的功能”。它能消除皮肤上的一些炎症，治疗水痘、湿疹等，并能促进伤口的愈合。特别是绿豆的种皮，中医叫做绿豆衣，其消炎效果更佳，对葡萄球菌有抑制作用。此外绿豆也被作为一种天然抗氧化剂，广泛地应用于食品和护肤品中。

申请号为201510126733.4的专利(虫草绿豆)采用膨化的绿豆和蛹虫草进行固体发酵，其生产工艺相对简单，但固体发酵的周期相对较长，而且也不便于进行工业化生产。现在也有一些技术采用液体发酵的手段如申请号为201210254867.0的专利公开了一种含有中药提取物的蛹虫草保健品及其制备方法，把蛹虫草菌作为一种微生物，通过加入适宜其生长的碳源和氮源等营养物质，促进其生长。或是添加一些具有活性的中药进行双向发酵培养，以获更为广泛的功效或是降低中药的毒副作用等。液体发酵的产物包括蛹虫草菌丝体和发酵液，可以直接作为一种原料添加到食品或化妆品中进行应用。此外，其生产的周期远远短于蛹虫草子实体，并且可以通过发酵罐等设备进行大规模的工业化生产。

目前蛹虫草与绿豆进行组合发酵的一些相关技术中，大多是应用于解决食品、保健品方面的技术问题，如CN201210254867.0：涉及一种含有中药提取物的蛹虫草保健品及其制备方法和CN201310229581.1：一种利用固态发酵生产蛹虫草发酵杂粮的方法，但在化妆品方面的应用较少。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，具备气味好闻，提升了蛹虫草绿豆液体发酵菌丝体的抗氧化和抗炎活性，具备良好的保湿功效，进一步促进蛹虫草和绿豆液态发酵产物在化妆品领域中的应用等优点，解决了蛹虫草与绿豆进行组合发酵的一些相关技术在化妆品方面的应用较少的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，其特征在于，包括以下原料比重的配方：1：10-1:50的绿豆混合液、40-80g葡萄糖、4-6gMgSO4和1-3g KH2PO4。

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1：10-1:50的绿豆混合液，在50-90℃环境下，提取1-3h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖40-80g、4-6g MgSO4、1-3g KH2PO4混匀，然后加2-4L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基。

S2、发酵培养

将清洗干净的发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧) 电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d。

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

优选的，所述步骤S2中的发酵罐的容积为5L。

优选的，所述步骤S3中的纱布目数为100目。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，具备以下有益效果：

本发明改善使用传统氮源生产的发酵液的难闻气味，和市售蛹虫草子实体相比，蛹虫草绿豆液体发酵菌丝体的抗氧化和抗炎活性有显著提升。通过绿豆蛹虫草发酵液制备得到的啫喱在0～2h内具有较好的人体保湿功效。

附图说明

图1为碳源优化表；

图2为氮源优化表；

图3为碳源添加量的优化表；

图4为绿豆提取液工艺优化单因素实验表；

图5为正交实验因素水平表；

图6为正交实验结果表；

图7为抗炎、抗氧化功效检测实验材料准备表；

图8为抗炎活性检测试剂加样表；

图9为几种不同形式的蛹虫草样品对COX-2酶抑制作用对比表；

图10为抗氧化功效检测试剂加入表；

图11为几种不同形式的蛹虫草样品对DPPH的清除率对比表；

图12为人体保湿功效检测啫喱配方表；

图13为保湿功效检测样品理化性质和虫草素含量检测表；

图14为保湿功效检测4种样品0-4h水分含量变化率检测表；

图15为保湿功效检测4种样品0-4小时水分散失量变化率检测表。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下原料比重的配方：1： 10-1:50的绿豆混合液、40-80g葡萄糖、4-6g MgSO4和1-3g KH2PO4。

实施例一：

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1:30的绿豆混合液，在70℃环境下，提取1.5h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖60g、4.5g MgSO4、1.5g KH2PO4混匀，然后加3L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基。

S2、发酵培养

将清洗干净的5L发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧)电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d。

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经100目纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

实施例二：

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1:10的绿豆混合液，在50℃环境下，提取1h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖40g、4g MgSO4、1g KH2PO4混匀，然后加2L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基。

S2、发酵培养

将清洗干净的5L发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧)电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d。

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经100目纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

实施例三：

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1:20的绿豆混合液，在60℃环境下，提取2h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖50g、5g MgSO4、2g KH2PO4混匀，然后加2.5L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基。

S2、发酵培养

将清洗干净的5L发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧)电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d。

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经100目纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

实施例四：

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1:40的绿豆混合液，在80℃环境下，提取2.5h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖70g、5.5g MgSO4、2.5g KH2PO4混匀，然后加3.5L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基。

S2、发酵培养

将清洗干净的5L发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧)电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d。

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经100目纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

实施例五：

一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1:50的绿豆混合液，在90℃环境下，提取3h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖80g、6g MgSO4、3g KH2PO4混匀，然后加4L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基。

S2、发酵培养

将清洗干净的5L发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧)电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d。

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经100目纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

实验例一：发酵工艺优化实验

1、主要培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA斜面培养基)；

液体种子培养基：蔗糖2g，酵母膏1g，蛋白胨2g，蒸馏水100mL，装于 250ml锥形瓶中，121℃下灭菌20min备用；

初始发酵培养基：葡萄糖3g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.15g，蒸馏水100mL，装于250ml锥形瓶中，121℃下灭菌20min备用。

2、培养流程：

先将斜面PDA培养基，25℃培养，传到第四代，菌呈白色密集菌丝状，布满培养基表面，再将液体种子液培养，于25℃、150r/min的恒温摇床中培养3天，菌丝体呈小米状颗粒状分布，再液体发酵培养(按初始发酵培养基配方，在25℃、150r/min的恒温摇床中培养，接种1ml种子液)。

3、菌丝体生物量的测定

将培养规定时间的液体发酵液放置于6000r/min的离心机中离心15min，得到上清液和沉淀，用新的EP管收集上清液备用，沉淀用蒸馏水洗涤1-3次并离心至颜色无明显变化后放于60℃的恒温干燥箱中烘干至恒重。如下计算菌丝体生物量：

菌丝体生物量(g/L)＝菌丝体干重(g)/发酵液体积(L)。

4、碳源优化

如图1所示，分别用葡萄糖、蔗糖、水溶性淀粉分别与蛋白胨按上述操作进行发酵，碳源和氮源的用量均为3g，发酵时间7天。

结果：水溶性淀粉组长势不佳，而且有较多絮状沉淀产生，蔗糖和葡萄糖的长势较好，而且溶液比较澄清。

5、氮源优化

如图2所示，采用红豆、绿豆、硫酸铵、酵母粉、蛋白胨分别与葡萄糖进行发酵。

绿豆、红豆提取方法：料液比：1:20，80℃，水提加热2h。

结果：红豆组有明显的絮状沉淀产生，硫酸铵、酵母粉组长势不佳，蛋白胨组长势最旺，菌丝体呈絮状分布，但其气味比较难闻，绿豆组培养液为淡黄绿色澄清透明液体，菌丝体具有较好长势，呈小米粒状，气味清香，相比其他氮源，绿豆组在化妆品的配方中具有更好的应用潜力。

6、碳源添加量的优化

如图3所示，对上述比较好的碳源：分别取2g、3g、4g葡萄糖和1g、2g、 3g、4g蔗糖与3g的蛋白胨、和绿豆提取液进行发酵。

结果：当碳源采用2g的葡萄糖时，氮源采用绿豆提取液与传统的蛋白胨相比，菌丝体也能够很好的生长，且菌丝体的分裂更加的均匀，细密。发酵液液更加的澄清透明，同时气味也比蛋白胨培养基好闻,有一股绿豆的清香味。而当碳源采用蔗糖时，蔗糖在添加量较高的时候会有大量沉淀产生，量加少了生长又不是很理想，由此可见，实施例一中的葡萄糖、MgSO4和KH2PO4 的用量最佳。

7、绿豆提取液的工艺优化

以2g葡萄糖为碳源，分别对绿豆提取液的料液比，提取时间，提取温度进行优化。

单因素实验

设置初始提取条件：料液比：1:20,80℃，2h。

如图4所示：

料液比优化：1：10、1：20、1:30、1:40、1:50

提取温度：50、60、70、80、90℃

提取时间：1h、1.5h、2h、2.5h、3h。

测试结果如下：

其中1:10的绿豆提取液十分浑浊，高压灭菌后有大量沉淀干扰。故选定 1：20、1:30、1:40进行进一步正交实验优化。

当提取温度较低的时候，可能是由于绿豆中的营养成分没有充分析出，导致蛹虫草菌的生长缺乏必要的营养，所以生长比较缓慢。而当温度过高，滤液中可能会存在一些水溶性蛋白，经过高压灭菌会产生大量的沉淀。故最终选用60℃、70℃、80℃的提取温度进行正交实验。

在1.5h的时候提取出了绿豆提取液已经能够比较好地满足蛹虫草菌的生长，随着提取时间的加长，对蛹虫草菌的生长促进并不是很明显，故优选1.5h、 2h、3h的提取时间进行正交实验，如图5和图6所示。

结论：从节约能源的角度，当提取时间为1.5h时，蛹虫草已经有比较好的长势，而且滤液也较提取2.5h的绿豆滤液要澄清透明。综合上述理由，最终确定以料液比1:30，提取温度70℃，提取时间1.5h作为绿豆提取液的提取条件，由此可见，实施例一中的绿豆提取液的提取方式最佳。

实验例二：抗炎、抗氧化功效检测

1、实验材料准备如图7所示：

2、实验步骤：

准备样品如下：

绿豆培养蛹虫草菌丝体：将通过绿豆提取液发酵得到的蛹虫草菌液，于 5000r/min，离心15min，去除上清液，取沉淀，用纯水反复清洗2～4次，然后取沉淀进行冻干处理；

蛋白胨培养蛹虫草菌丝体：将通过蛋白胨发酵得到的蛹虫草菌液进行离心和冻干处理，方法同上；

绿豆培养蛹虫草发酵液：将通过绿豆提取液发酵得到的蛹虫草菌液，于 5000r/min，离心15min，取上清液，即得；

蛋白胨培养蛹虫草发酵液：将通过蛋白胨培养得到的蛹虫草菌液，于5000 r/min，离心15min，取上清液，即得；

蛋白胨培养蛹虫草菌丝体：将通过蛋白胨发酵得到的蛹虫草菌液进行离心和冻干处理，方法同上。

蛹虫草子实体：将市售的蛹虫草子实体粉碎，过50目筛备用。

3、抗炎活性检测

先准备样品，将蛹虫草绿豆发酵产物进行冷冻干燥处理，取0.1g冻干样品(以蛋白胨培养的蛹虫草菌丝体和市售的蛹虫草子实体作为对照)，将上述三个样品分别用10ml的水、95％的乙醇做为溶剂，超声1h,离心取上清液，过0.45μm滤膜，作为待测溶液备用，醇溶性样品是用95％乙醇提取蛹虫草后，挥干了溶剂，然后用DMSO复溶；再配置试剂，各工作试液的配制方法，参照试剂盒说明书方法。阳性抑制剂Celecoxib溶液的配制:本试剂盒提供的阳性对照抑制剂Celecoxib浓度为100μM,配制在DMSO中，用DMSO将其稀释为 1μM。各工作液的配制和暂存均需在冰浴上进行，所以要事先准备好碎冰或冰块。

检测步骤如下：

a、使用96孔黑板设置对照孔和样品孔，并按照下表依次加入样品和各溶液。加入待测样品后，混匀，37℃孵育10分钟。为获得更加可靠的检测结果，建议每个样品至少应该进行2个重复孔的检测。试剂加样如图8所示。

b.各孔加入COX-2Probe 5μL；

c.各孔快速加入COX-2Substrate工作液5μL，混匀；

d.37℃避光孵育5min后进行荧光测定。激发波长560nm，发射波长590nm。

e.计算

计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU100％酶活性对照、RFU阳性抑制剂对照、RFU样品，Relative Fluorescence Unit。每个样品的抑制百分率计算公式如下：

抑制率(％)＝(RFU100％酶活性对照-RFU样品)/(RFU100％酶活性对照 -RFU空白对照)×100％。

计算结果如图9所示。结论：蛹虫草绿豆发酵的菌丝体与蛋白胨作为氮源培养的蛹虫草菌丝体，以及市售的蛹虫草子实体相比，对cox-2酶的抑制作用要更为显著，而且其水提产物的效果更好，可能与蛹虫草和绿豆中的一些具有抗炎功效物质，如虫草素，多糖或多肽类等有关。

4、抗氧化功效检检测

通过检测样品对DPPH自由基的清除作用来测定其抗氧化活性。

(1)样品处理

分别取0.1g蛹虫草蛋白胨培养的菌丝体、绿豆培养的菌丝体和市售蛹虫草子实体，分别用10ml的水，混匀，于70℃水浴提取2h，离心，取上清液，过0.45μm滤膜，作为待测液备用。发酵液为分离了菌丝体的发酵液原液。

(2)工作试剂的配制

DPPH工作试液的配制：精密称取20mg DPPH粉末，加入无水乙醇溶解，并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10-4mol/L，0-4℃下避光保存，现配现用。

阳性对照(维生素C溶液)配制:精密称取25mg维生素C粉末，加入蒸馏水溶解，并定容于250mL容量瓶中，其浓度为2×10-4mol/L，0-4℃下避光保存，现配现用。

(3)样品制备

①取1mL的待测液与1mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A管)；

②取1mL的无水乙醇与1mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(B管)；

③取1mL的无水乙醇与1mL的待测液混匀(C管)；

④避光反应30min后，将反应后的溶液，在避光条件下，吸取200μL 于96孔板，然后于517nm下测A、B、C管吸光度值，各试剂的加入方法，参照图10，检测结果如图11所示。

清除率计算公式为：清除率(％)＝[(B+C)-A]/B

结论：液体发酵培养的菌丝体较蛹虫草子实体具有更好的抗氧化活性，虽然绿豆发酵液的抗氧化活性不如蛋白胨，这可能与这两种氮源在培养基中的初始添加量有关，但最终得到的菌丝体这间的抗氧化效果并没有明显差异。

实验例三：人体保湿功效检测

蛹虫草子实体提取液的制备：称取10g蛹虫草子实体，按1:20料液比， 70℃水提1.5h，过滤，收集滤液；

制备啫喱：

测试样品分组：

1号实验组：蛹虫草绿豆发酵液啫喱

2号实验组：蛹虫草提取液啫喱

3号阳性对照：5％的甘油水溶液

4号空白对照：啫喱基质配方(将发酵液用去离子水代替)

啫喱配方如图12所示。

制作步骤：

1、在称重过的250ml烧杯中称取去离子水，用称量纸称取U20，将其均匀撒在水中。静置约5min(注意：不要搅拌，自然分散润湿)，分散浸润至白色粉末完全润湿。

2、在浸润后体系中，依次称取丁二醇、甘油，搅拌加热升温至80-85℃，搅拌5-10min，转速35-40转/min，搅拌均匀后降温。体系中有絮状物属正常现象。

3、用50ml烧杯依次称取B相EDTA-2Na、发酵液、去离子水，搅拌5-10min，转速35-40转/min搅拌溶解至透明(可适当加热，加快溶解，温度55-60℃) 待用。

4、A相降温至45℃，搅拌混合均匀后加入NaOH(10％)中和(用量为U20 的2.5倍)，(注意：边搅拌边加，不能过快)，加入待用溶液B相，搅拌形成透明啫喱。加入MTI搅拌混合均匀。

5、降至室温后称量，装入已经灭菌的样品瓶。

实验方法与步骤

1、理化性质检测和虫草素含量检测

发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，检测其理化指标(PH、电导率、固含量)和虫草素含量。

2、保湿功效检测

由图13与图14和单因素方差对各样品之间的显著性差异进行分析可知，样品1(蛹虫草绿豆发酵液啫喱)在0.5h时对皮肤水分含量的提升显著高于 3，4号样品(*P<0.05)，而与2号样品无显著差异；在1h时，样品1(蛹虫草绿豆发酵液啫喱)对皮肤水分含量的提升显著高于4号样品(*P<0.05)，而与2、3号样品无显著差异；在2h时，各样品对对皮肤水分含量的变化率无显著差异；在4h时，样品1(蛹虫草绿豆发酵液啫喱)对皮肤水分含量的提升显著高于4号样品(*P<0.05)，而与2、3号样品无显著差异。

结果：由图15和单因素方差对各样品之间的显著性差异进行分析可知，样品1(蛹虫草绿豆发酵液啫喱)在0.5h时，样品1对皮肤水分散失量的减少作用显著高于2，3号样品(*P<0.05)，而与4号样品无显著差异；在1、2 h时，各样品对皮肤水分散失量减少的作用无显著差异；在4h时，样品1对皮肤水分含量的提升显著高于3号样品(*P<0.05)，而与2、4号样品无显著差异

结论：蛹虫草绿豆发酵液啫喱在0～2h内具有较好的人体保湿功效。

本发明的有益效果是：本发明改善使用传统氮源生产的发酵液的难闻气味，和市售蛹虫草子实体相比，蛹虫草绿豆液体发酵菌丝体的抗氧化和抗炎活性有显著提升。通过绿豆蛹虫草发酵液制备得到的啫喱在0～2h内具有较好的人体保湿功效。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，其特征在于，包括以下原料比重的配方：1：10-1:50的绿豆混合液、40-80g葡萄糖、4-6g MgSO4和1-3g KH2PO4。

2.一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配置液体培养基

将料液比为1：10-1:50的绿豆混合液，在50-90℃环境下，提取1-3h，过滤，取滤液，得到绿豆提取液，再称取葡萄糖40-80g、4-6g MgSO4、1-3g KH2PO4混匀，然后加2-4L绿豆提取液溶解，添加适量消泡剂，辅助超声，搅拌3分钟促进培养基溶解，得到液体培养基；

S2、发酵培养

将清洗干净的发酵罐灭菌，同时检测设备的气密性，并对pH、DO(溶氧)电极进行标定，标定结束后，将液体培养基转移至发酵罐中，插好电极，摘除导线，电极头用锡箔纸包扎，连接好管路，排气口用8层纱布包好，其他部分用弹簧夹夹紧，并检查连接是否可靠，随后将发酵罐放入立式高压蒸汽灭菌锅中，121℃，0.15Mpa，灭菌20min，灭菌结束后，连接好发酵罐的电极电缆，水路气路，设置发酵条件为：发酵温度为28℃、转速150r/min，通气量3.0L/min,自动控制模式，待温度降低到指定发酵温度时，进行火焰接种，按3％的添加量加入种子液，发酵培养7d；

S3、收集蛹虫草绿豆发酵液

在所述步骤S3发酵结束后，将发酵罐整体进行高压灭菌，然后将发酵得到的发酵液先经纱布进行初滤，然后过0.45μm滤板进行二次过滤，得到发酵液，然后将发酵液进行二次灭菌处理，并添加适量防腐剂，即得到蛹虫草绿豆发酵液。

3.根据权利要求2所述的一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，其特征在于，所述步骤S2中的发酵罐的容积为5L。

4.根据权利要求2所述的一种蛹虫草-绿豆双向液体发酵工艺，其特征在于，所述步骤S3中的纱布目数为100目。