背景技术
肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程,表现为细胞外基质(ECM)大量合成、分泌,而降解绝对或相对不足,使ECM在肝脏内弥漫沉积。其起始于肝细胞(HC)坏死,随之是炎症反应、纤维生成介质释放,肝星状细胞(FSC)激活,最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理过程,是影响预后的重要因素。
过去的20年间,肝纤维化的研究取得了长足进展,证实肝纤维化与一定程度的肝硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法,包括化学药、生物制剂、中药与基因疗法等,但是理想的临床治疗手段仍然缺乏(刘平.加强抗肝纤维化作用机制的研究.中华肝病杂志,2005,8(13):561)。目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激活相关的环节,主要是:减轻肝损伤;抑制星状细胞激活,减少细胞外基质产生;调节细胞因子紊乱,促进活化肝星状细胞凋亡。
本发明涉及的化合物Lycojaponicumin B是一个2012年发表(Wang,X.J.et al.,2012.Lycojaponicumins A-C,Three Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Lycopodium japonicum.OrganicLetters14(10),2614-2617.)的新骨架化合物,该化合物拥有全新的骨架类型,对于本发明涉及的Lycojaponicumin B在制备抑制肝脏成纤维细胞增殖药物中的用途属于首次公开,由于骨架类型属于全新的骨架类型,而且其对于肝脏成纤维细胞增殖抑制活性强得意想不到,不存在由其他化合物给出任何启示的可能,具备突出的实质性特点,同时用于抗肝脏成纤维细胞增殖显然具有显著的进步。
发明内容
化合物Lycojaponicumin B经药理试验证明其能抗肝纤维化。
本发明Lycojaponicumin B的结构式如式(I)所示:
本发明对Lycojaponicumin B抑制肝脏成纤维细胞增殖作用进行了药理试验。
成纤维细胞增殖并合成大量细胞外基质(ECM),是肝纤维化发生的重要环节。活化的肝星状细胞(HSC)具有成纤维细胞特征,NIH/3T3细胞是研究药物抗肝纤维化活性常用的细胞模型。本研究以NIH/3T3成纤维细胞为靶细胞,观察发明药物对其增殖的影响。用MTT法检测的抑制细胞增殖的试验结果表明,本发明药物对NIH/3T3的细胞增殖有显著的抑制活性。
根据药理试验结果证明Lycojaponicumin B具有抗肝纤维化作用。
本发明涉及的Lycojaponicumin B在制备抑制肝脏成纤维细胞增殖药物中的用途属于首次公开,由于骨架类型属于全新的骨架类型,而且其对于肝脏成纤维细胞增殖抑制活性强得意想不到,不存在由其他化合物给出任何启示的可能,具备突出的实质性特点,同时用于抗肝脏成纤维细胞增殖显然具有显著的进步。
具体实施方式
本发明所涉及化合物Lycojaponicumin B的制备方法参见文献(Wang,X.J.et al.,2012.Lycojaponicumins A-C,Three Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Lycopodium japonicum.OrganicLetters14(10),2614-2617.)。
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明,但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制,而是由权利要求加以限定。
实施例1:本发明所涉及化合物Lycojaponicumin B片剂的制备:
取20克化合物Lycojaponicumin B,加入制备片剂的常规辅料180克,混匀,常规压片机制成1000片。
实施例2:本发明所涉及化合物Lycojaponicumin B胶囊剂的制备:
取20克化合物Lycojaponicumin B,加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克,混匀,装胶囊制成1000片。
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。
实验例1:本发明药物对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用
一、实验方法:
NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海细胞所细胞库。
将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25%胰酶消化,洗涤,离心后,用DMEM培养液(含10%FCS)制成1×104cell/ml的细胞悬液,台盼蓝染色鉴定存活率大于95%,按每孔100ul加入96孔板中,在37℃、5%CO2培养24h同步处理后,弃上清,加入含有不同稀释浓度药物的DMEM培养液(含10%FCS)200ul,培养48h,每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液,加入150ulDMSO,振荡10分钟,使结晶溶解,酶标仪490nm处读取OD值,结果以OD490表示。
二、实验结果:
1、形态学观察
NIH/3T3在用药前伸展良好,折光性较弱,有方向性,呈放射状,细胞增殖的速度快;而加药物24h后,成纤维细胞数目减少,形状变得不规则,突起变短,细胞排列混乱,细胞内代谢产物增多。
MTT法检测本发明药物对NIH/3T3细胞增殖的抑制作用
表1:MTT法检测本发明药物对NIH/3T3增殖的抑制作用
注:*,与细胞阴性对照P<0.05;**,与细胞阴性对照P<0.01
结果:本发明药物在10ug/ml-40ug/ml的浓度范围内对成纤维细胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的细胞增殖有显著的抑制作用。表明本发明药物体外对纤维细胞的增殖有显著抑制作用。
实验例2:本发明药物对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的成纤维细胞增殖的抑制作用
TGF-β1是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子,在细胞中加入TGF-β110ng/ml刺激细胞增殖,在检测药物对TGF-β1诱导的细胞增殖的抑制作用,以分析判断本发明药物的作用机理。
表2:MTT法检测本发明药物对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用
注:*,与细胞+TGF对照P<0.05;**,与细胞+TGF对照P<0.01
结果:本发明药物在10-40ug/ml两个浓度区间内对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β1的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作用。表明本发明药物体外对纤维细胞增殖的抑制作用可能是通过干预TGF信号通路实现的。
结论:Lycojaponicumin B对成纤维细胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的细胞增殖有显著的抑制作用;Lycojaponicumin B对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β1的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作用。Lycojaponicumin B可以用来制备抗肝纤维化药物。