CN101062046A - 一种皂苷类成分的医学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了柴胡皂苷a(saikosaponin a)在制备治疗肝纤维化药物的用途。药理试验证明，从中药柴胡中提取分离的柴胡皂苷a可以明显抑制肝纤维化的发生和发展，可用于制备抗肝纤维化、防治肝硬化的药物。

Description

一种皂苷类成分的医学用途
技术领域
本发明涉及从中药中提取有效成分，经药理试验证明可显著抑制肝纤维化的发生和发展，更具体指从中药柴胡中提取分离获得有效成分柴胡皂苷a(saikosaponin a)，它可在制备抗肝纤维化药物中应用。
背景技术
肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，表现为细胞外基质(ECM)大量合成、分泌，而降解绝对或相对不足，使ECM在肝脏内弥漫沉积。其起始于肝细胞(HC)坏死，随之是炎症反应、纤维生成介质释放，肝星状细胞(FSC)激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理过程，是影响预后的重要因素。
过去的20年间，肝纤维化的研究取得了长足进展，证实肝纤维化与一定程度的肝硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法，包括化学药、生物制剂、中药与基因疗法等，但是理想的临床治疗手段仍然缺乏(刘平.加强抗肝纤维化作用机制的研究.中华肝病杂志，2005，8(13)：561)。目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激活相关的环节，主要是：减轻肝损伤；抑制星状细胞激活，减少细胞外基质产生；调节细胞因子紊乱，促进活化肝星状细胞凋亡。
柴胡性味苦、凉，入肝胆经，具有和解表里、疏肝、升阳功能。现代药理研究表明柴胡具有抗炎、免疫调节、抗纤维化及保肝等多种药理活性。中药复方治疗肝纤维化已进行了大量的实验与临床研究，与柴胡配伍的中药复方在抗肝纤维化的中药治疗中应用极为广泛(韩涛等.柴胡合剂对实验性肝纤维化学的防治作用.天津医药，1999，27(9)：48-49；赵进军.小柴胡汤治疗肝纤维化的研究进展.中西医结合肝病杂志，2001，3(11)：188-189；王胜春，赵辉萍等.柴胡与五味子配伍对实验性肝纤维化作用的观察.中成药，2002，4(24)：286-289)。其中小柴胡汤是研究最为深入的中药经典方剂。小柴胡汤是《伤寒论》中和解少阳的代表方剂。新近日本学者经深入研究发现，本方可直接抑制肝纤维化的形成，通过抗炎、稳定肝细胞膜、减轻肝脂质过氧化反应、促进肝细胞再生及免疫调节等途径呈现良好的保肝作用。
柴胡中的主要化学成分是柴胡根挥发油、柴胡皂苷、多糖及黄酮类。其中柴胡皂苷的抗炎、保肝、镇痛、增强免疫机能等效应，已为临床及实验研究所证实。据文献报道，柴胡皂苷a有抑制肿瘤细胞增殖的活性(Wen-Sheng Wu，et al，2001.Involvement of p-15 and p-16Gene Expression in Saikosaponin A and TPA-induced Growth inhibition of HepG2 Cells.Biochemical and Biophyhysical Reasearch Communications.285，183-187)；具有对抗小鼠戊四氮致痫作用(谢炜.动态观察柴胡皂苷A对实验性癫痫小鼠痫性发作的影响.广东药学院学报，2006，1(22)：65-67)。关于柴胡皂甙a抗纤维化的药理活性，对纤维细胞增殖的干预作用尚未见报道及专利公开。
发明内容
本发明目的是从柴胡中寻找一种能抗肝纤维化又采用化学方法从柴胡中分离出皂苷类有效成分-柴胡皂苷a，克服常规多味汤药存在的不足之处。采用化学方法从中药柴胡(Bupleurum chinese DC)中分离出皂苷类有效成分——柴胡皂苷a，经药理试验，使该化合物在制备抗肝纤维化药物中应用。
该化合物柴胡皂苷a经药理实验证明其能抗肝纤维化，又能克服常规多味汤药存在的不足之处，给药途经方便。
本发明柴胡皂苷a的结构式如下：
Figure A20061002613800041
分子式为C42H68O13，分子量为780，化学名为3β，16β，23-三羟基-13，28-环氧基齐墩果烷-11-烯3-O-β-D-葡萄糖-(1→3)-β-D-岩藻糖苷。
它可通过以下方法制备：取柴胡药材，粉碎，以60--90％乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩回收乙醇，石油醚脱脂后加0.5-10倍去离子水稀释，用AB-8型树脂吸附，用1-8个柱体积去离子水洗脱后，用30--90％乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇并浓缩，经硅胶柱色谱分离，得目标化合物柴胡皂苷a(saikosaponin a)。
本发明采用上述方法提取获得的柴胡皂苷a首先进行了药理试验。
成纤维细胞增殖并合成大量细胞外基质(ECM)，是肝纤维化发生的重要环节。活化的肝星状细胞(HSC)具有成纤维细胞特性，NIH/3T3细胞是研究药物抗肝纤维化活性常用的细胞模型。本研究以NIH/3T3成纤维细胞为靶细胞，观察发明药物对其增殖的影响。用MTT法检测的抑制细胞增殖的试验结果表明，本发明药物对NIH/3T3的细胞增殖有显著的抑制活性。
根据药理试验结果证明柴胡皂苷a具有抗肝纤维化作用，并以柴胡皂苷a作为有效成分，根据制剂的需要配制各种制剂包括胶囊、片剂、冲剂、注射剂等。
附图说明
图1是柴胡皂苷a对NIH/3T3细胞形态学的影响。
图2是本发明药物对NIH/3T3增殖的抑制作用。
图3是本发明药物对TGF诱导的NIH/3T3增殖的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。
实施例1.本发明药物的制备
取柴胡药材10Kg，粉碎，以70％乙醇渗漉提取，提取液减压回收乙醇并浓缩(-0.2--0.9Mpa)，石油醚脱脂后加3倍去离子水稀释，用AB-8型树脂吸附，用2个柱体积去离子水洗脱后，用70％乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇并浓缩(-0.2--0.9Mpa)，经硅胶柱色谱(200-300目)，先以氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)，再以乙酸乙酯-乙醇-水(18∶2∶1)为洗脱体系进行洗脱，分离，以甲醇重结晶，得目标化合物柴胡皂苷a(saikosaponin a)。
实施例2：本发明药物对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用
实验方法：
NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海细胞所细胞库。
将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25％胰酶消化，洗涤，离心后，用DMEM培养液(含10％FCS)制成1×104cell/ml的细胞悬液，台盼蓝染色鉴定存活率大于95％，按每孔100μl加入96孔板中，在37℃、5％CO2培养24h同步处理后，弃上清，加入含有不同稀释浓度药物的DMEM培养液(含10％FCS)200ul，培养48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液，加入150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶溶解，酶标仪490nm处读取OD值，结果以OD490表示。
柴胡皂苷a的配制：
1mg柴胡皂苷a加入DMSO100ul混悬，再加入900ul灭菌双蒸水，配制成1mg/ml母液。工作浓度分别用培液系列稀释成1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，即分别为40ug/ml、20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml。
实验结果：
形态学观察
NIH/3T3在用药前伸展良好，折光性较弱，有方向性，呈放射状，细胞增殖的速度快；而加药物24h后，成纤维细胞数目减少，形状变得不规则，突起变短，细胞排列混乱，细胞内代谢产物增多。
MTT法检测本发明药物对NIH/3T3细胞增殖的抑制作用
表1：MTT法检测本发明药物对NIH/3T3增殖的抑制作用
  药物   OD490
  发明药物40ug/ml发明药物20ug/ml发明药物10ug/ml发明药物5ug/ml细胞阴性对照   0.40±0.03**0.43±0.11**0.53±0.09**0.57±0.02*0.98±0.10
注：*：与细胞阴性对照p＜0.05；**：与细胞阴性对照p＜0.01
结果：本发明药物在5ug/ml-40ug/ml的浓度范围内对成纤维细胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的细胞增殖有显著的抑制作用。表明本发明药物体外对纤维细胞的增殖有显著抑制作用。
实施例3：本发明药物对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的成纤维细胞增殖的抑制作用
TGF-β1是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子，在细胞中加入TGF-β110ng/ml刺激细胞增殖，再检测药物对TGF-β1诱导的细胞增殖的抑制作用，以分析判断本发明药物的作用机理。
表2：MTT法检测本发明药物对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用
  药物   OD490
  发明药物40ug/ml发明药物20ug/ml发明药物10ug/ml发明药物5ug/ml细胞阴性对照细胞+TGF   0.236±0.08**0.336±0.04*0.558±0.050.499±0.030.549±0.120.649±0.03
注：*：与细胞+TGF比较p＜0.05；**：与细胞+TGF比较p＜0.01
结果：本发明药物在20-40ug/ml两个浓度区间内对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-β1的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作用。表明本发明药物对纤维细胞增殖的抑制作用可能是通过干预TGF信号通路实现的。

Claims (2)

1.一种结构式如下的柴胡皂苷a的用途，用于制备预防或治疗肝纤维化药物。
Figure A2006100261380002C1
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于以柴胡皂苷a作为有效成分配以辅助剂制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或注射剂。
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