CN103435605B

CN103435605B - 一种吗啉类四氮唑化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103435605B
Application number: CN201310291214.4A
Authority: CN
Inventors: 陈志龙; 郑慧玲; 朱伟波; 吴丹; 达雅静; 严懿嘉; 万娜; 张莉君; 叶颖; 鲍晓璐
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN103435605A

Abstract

本发明涉及一种吗啉类四氮唑化合物及其制备方法和应用，化合物的结构式为：制备方法包括：由苯甲酰基保护的溴甲基吲哚与(R,S)-2,6-二甲基吗啉，通过亲核取代反应得到含有吗啉环、甲基吲哚、苯甲酰基三部分结构的化合物；然后在碱性条件下水解脱去保护基，得到只含有吗啉环和甲基吲哚结构的化合物；该化合物与邻氟苯腈在碳酸钾和DMF存在的条件下，反应生成含有邻氰基苯结构的产物。本发明能更好的抑制AngII与AT₁受体结合，有明显的降压作用，最大降压值达到42mmHg，且有效降压时间可维持24小时以上，合成路线短，原料易得，反应收率较高，具有发展为高效、长效、价廉的降压新药开发前景。

Description

一种吗啉类四氮唑化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于心血管疾病防治药物及其制备和应用领域，特别涉及一种吗啉类四氮唑化合物及其制备方法和应用。

背景技术

肾素-血管紧张素系统（RAS）在调节人体血压、维持水电解质平衡和高血压病的发病中起着重要作用。血管紧张素原在循环或局部肾素作用下形成血管紧张素I（AngI），AngI可被血管紧张素转化酶（ACE）在内皮细胞内转化为血管紧张素II（AngII），AngII是RAS的主要介质，在维持心血管的自身稳定方面起着重要的作用。目前已知的AngII受体有AT₁、AT₂、AT₃和AT₄四种亚型。研究表明：AngII的主要生理药理作用是通过G蛋白偶联的AT₁受体起作用的。AT₁受体主要分布在人体的肾脏、心脏、血管平滑肌细胞、肾上腺皮质、脑、血小板及胎盘，其介导的功能有：血管收缩、增加钠潴留、抑制血管紧张素原分泌、增加内皮素分泌、增加加压素释放、促进心肌肥大、心肌纤维化、增加心肌收缩力、诱发心律失常等。

AT₁受体拮抗剂通过与组织的AT₁受体结合，完全阻断AngII直接收缩血管（包括非ACE途径生成的AngII）的作用，降低外周血管阻力；通过抑制醛固酮的分泌，减少肾小管的水钠重吸收，使血压下降；通过抑制AngII的促血管平滑肌细胞、心肌细胞的增殖作用，防止血管壁增厚和心肌肥厚；此外，还可以改善原发性高血压病患者的胰岛素敏感性，降低血浆去甲肾上腺素水平，降低交感神经兴奋性。研究证明：AT₁受体拮抗剂对其他受体、酶、离子通道以及激肽系统均无影响，对RAS更具有特异性和选择性。

由于AT₁受体拮抗剂的独特的抗高血压作用，近年来陆续开发了一系列高效的AT₁受体拮抗剂药物，美国FDA也相继批准氯沙坦（losartan）、缬沙坦（valsartan）、伊贝沙坦（irbesartan）、坎地沙坦（Candesartan）、替米沙坦（telmixartan）等应用于临床。

氯沙坦于1994年在瑞典上市，成为第一个用于临床的ARB类药物。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂大多是对氯沙坦结构的改造，如Candesartan（J.Med.Chem.1993,36，15:2182-2195），Pomisartan(中国药科大学学报,2005,36，2:99-101)、TAK-536（J.Med.Chem.1996,39，26:5228-5235）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种吗啉类四氮唑化合物及其制备方法和应用，该化合物与已上市药物氯沙坦相比，能更好的抑制AngII与AT₁受体结合，有明显的降压作用，最大降压值达到42mmHg，且有效降压时间可维持24小时以上，合成路线短，原料易得，反应收率较高，具有发展为高效、长效、价廉的降压新药开发前景。

本发明的一种吗啉类四氮唑化合物，所述化合物的结构式为：

本发明的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将2～4mmol(R,S)-2,6-二甲基吗啉和3～5mmol的碱溶于14～16mL有机溶剂中，氮气保护下，于50～60℃搅拌30～60min，冷却到室温，滴加8-11mL含有3～5mmolI₁的无水THF溶液，加热搅拌后减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得I₂；

（2）将2～3mmolI₂溶于9～10mL有机溶剂中，加入1～3mol/L的碱溶液，搅拌回流加热3～4小时，减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得I₃；

（3）将2～3mmolI₃、3～5mmol有机溶剂以及5～6mmol的碱混合搅拌加热回流4～5h，减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得I₄；

（4）将2～3mmolI₄溶于20～30mL有机溶剂中，加入10～16mmol试剂A和10～14mmol试剂B，N₂保护下，搅拌回流加热26～30小时，减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得。

所述步骤（1）和（2）中的有机溶剂为甲醇或CH₂Cl₂，但又不限于这些溶剂，碱为NaOH，但又不限于这些碱。

所述步骤（3）中的有机溶剂为DMF、乙酸乙酯或邻氟苯腈，但又不限于这些溶剂，碱为K₂CO₃，但又不限于这些碱。

所述步骤（3）中的有机溶剂为DMF、乙酸乙酯或CH₂Cl₂，但又不限于这些溶剂，试剂A为NaN₃，试剂B为Bu₃SnCl，但又不限于这种试剂。

所述步骤（1）和（3）中柱层析分离中填充剂为硅胶，洗脱剂为体积比2:1～5:1的石油醚和乙酸乙酯。

所述步骤（2）中柱层析分离中填充剂为硅胶，洗脱剂为体积比200:1～300:1的二氯甲烷和甲醇。

所述步骤（4）中柱层析分离中填充剂为硅胶，洗脱剂为体积比20:1～100:1的二氯甲烷和甲醇。

本发明的一种吗啉类四氮唑化合物应用于制备预防和治疗高血压、冠心病、心脑肾血管疾病、偏头痛、肺动脉高压的药物。

本发明提供的吗啉类四氮唑化合物可以通过以下方法制备：由苯甲酰基保护的溴甲基吲哚与(R,S)-2,6-二甲基吗啉，通过亲核取代反应得到含有吗啉环、甲基吲哚、苯甲酰基三部分结构的化合物。然后在碱性条件下水解脱去保护基，得到只含有吗啉环和甲基吲哚结构的化合物。该化合物与邻氟苯腈在碳酸钾和DMF存在的条件下，反应生成含有邻氰基苯结构的产物。其再在氮气保护的条件下，与叠氮化钠和三丁基氯化锡于DMF中反应生成四氮唑化合物。

有益效果

本发明与已上市药物氯沙坦相比，能更好的抑制AngII与AT₁受体结合，有明显的降压作用，最大降压值达到42mmHg，且有效降压时间可维持24小时以上，合成路线短，原料易得，反应收率较高，具有发展为高效、长效、价廉的降压新药开发前景。

附图说明

图1为化合物I对¹²⁵I-AngII与AT₁受体结合的抑制曲线；

图2为化合物I对SHR大鼠MAP的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

合成顺式-4-（（1-（2-（1H-四氮唑-5-基）苯基）-1H-吲哚-4-基）甲基）-2,6-二甲基吗啉的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将(R,S)-2,6-二甲基吗啉(343mg,2.98mmol)和60％的NaOH(85.8mg,3.57mmol)溶于15mL无水THF中，氮气保护下，于50℃搅拌30min。冷却到室温，缓慢滴加10mL含有I₁(1.03g,3.28mmol)的无水THF溶液；然后加热搅拌3h，将反应液倒入15mL冰水中，用乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗一次(30mL)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，对所得残留物进行柱层析（洗脱液体积比：石油醚：乙酸乙酯=3:1），减压蒸除溶剂得916mg淡黄色固体I₂(88.3%)。MS(ESI)m/z:349.2[M+H]⁺。

(2)将I₂(916mg,2.63mmol)溶于10mL甲醇中，加入2mol/L的NaOH溶液10mL，搅拌回流加热3小时；减压蒸去甲醇，反应液中加入水稀释，用CH₂Cl₂萃取四次(10mL×4)，合并有机相，用饱和食盐水洗一次(20mL)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，对所得残留物进行柱层析（洗脱液体积比：DCM:CH₃OH=250:1)，减压蒸除溶剂得586mg白色固体I₃(91.3%)。MS(ESI)m/z:245.2[M+H]+。

(3)将I₃(586mg,2.40mmol)和邻氟苯腈(430mg,3.59mmol)以及K₂CO₃(666mg,4.78mmol)溶于50mLDMF中，搅拌加热回流4h，反应液中加入乙酸乙酯，用水洗五次(30mL×5)，饱和食盐水洗涤一次(30mL)，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，对所得残留物进行柱层析（洗脱液体积比：PE:EA=3:1），减压蒸除溶剂得690mg淡黄色固体(83.3%)I₄。MS(ESI)m/z:346.2[M+H]⁺。

(4)将I₄(690mg,2.00mmol)溶于30mLDMF中，加入NaN₃(784mg,12.04mmol)和Bu₃SnCl(2.1ml,12.04mmol)，N₂保护下，搅拌回流加热26小时。待反应完全后将反应液倒入30mL冰水中，用6mol/LHCl溶液将pH值调至5，用CH₂Cl₂萃取反应液(50mL)，有机相用水洗5次(30mL×5)，饱和食盐水洗一次(30mL)。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，对所得残留物进行柱层析（洗脱液体积比：DCM:CH₃OH=40:1），减压蒸除溶剂得526mg淡黄色固体I(67.8%)。MS(ESI)m/z:389.20844[M+H]+。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.31-8.33(d,¹H,Ph-H),7.61-7.68(m,²H,Ph-H),7.52-7.54(m,¹H,Ph-H),7.33-7.34(d,¹H,N-C₂-H),7.02-7.09(m,²H,Ph-H),6.77-6.78(d,¹H,Ph-H),6.47(d,¹H,N-C₃-H),4.07(t,²H,N-CH₂-Ph),3.27-3.42(d,²H,N-CH₂-C),2.98-3.07(d,²H,N-CH₂-C),2.25(m,²H,O-CH-C),1.27(s,¹H,N-H),1.12(s,³H,CH₃),1.01(s,³H,CH₃).¹³CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:155.65,137.57,136.87,131.60,130.40,129.09,128.94,128.67,125.22,122.10,121.65,110.17,102.08,70.67,59.52,58.38,19.27。

实施例2

化合物受体结合活性实验

受试细胞为SD大鼠血管平滑肌细胞，药品为实施例1的化合物，氯沙坦，¹²⁵I-AngII,[Sar¹-Ile⁸]-AngII。

平滑肌细胞原代培养及鉴定：将SD大鼠用水合氯醛麻醉后，在无菌条件下剪开胸、腹腔，暴露心脏，除去结缔组织，分离主动脉，用PBS缓冲液冲洗直至血管内无残留血液。然后撕去血管外膜至血管光滑透明，用眼科剪将血管剪开，用眼科镊钝性刮去血管内膜，再用眼科剪将血管剪成1-2mm²大小后用胶原酶37℃消化1h，加入DMEM培养液(FBS15%)终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入新鲜的培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，静置培养3天，当细胞密度达到90%时进行消化传代。细胞鉴定：常规消化细胞，将细胞接种于已处理的盖玻片。第2天用PBS缓冲液轻缓洗涤后，加入4%多聚甲醛在室温下固定30min，再用PBS缓冲液洗涤3次，2min/次。然后用1%TritonX-100(PBS配制)室温下渗透细胞10min，增加细胞通透性以便抗体更好地进入细胞。再用3%H₂O₂室温作用10min，PBS洗3次，5min/次。用山羊血清封闭非特异性抗原30min，滴加抗SMC-α-actin抗体(1：200)，放置4℃过夜后用PBS缓冲液洗涤3次，5min/次。次日回收一抗，用PBS洗涤3次，5min/次，以下步骤避光操作，加入二抗(1：200)在室温下孵育1h，PBS缓冲液洗涤3次，5min/次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测。

放射配基受体结合试验:

饱和实验：将定量¹²⁵I-AngII溶解于1mLPBS溶液，再稀释成不同浓度的溶液。取血管平滑肌3-7代用于试验，铺于24孔板(1×10⁵/孔)，贴壁后用于试验。结合反应：总体积为500μL，细胞板每孔依次加入浓度逐渐增加的¹²⁵I-AngII溶液，使其终浓度为0-1.5nM，4℃反应150min，为了扣除非特异性结合，每孔加入未标记的AngII(终浓度为1×10^-6M)和浓度递增的¹²⁵I-AngII溶液(终浓度为0-1.5nM)，4℃反应150min，反应结束后去除多余的反应液，用PBS洗涤3次，加入0.1mol/LNaOH溶液消化细胞10min，将细胞消化液移入塑料管，用γ计数器测量每管内溶液的γ计数。经GraphPadPrism4饱和曲线拟合程序处理得到¹²⁵I-AngII受体结合饱和曲线。每个浓度采用2复孔。

竞争试验：药物溶液：取一定量的化合物溶于1mLDMSO溶液，浓度为10^-2M，再10倍稀释成不同浓度的溶液(1×10^-10M～1×10^-4M)。细胞铺板(1×10⁵/孔)后，每孔加入0.1nM¹²⁵I-AngII以及不同浓度的新化合物(终浓度1×10^-6～1×10^-11mol/L)，总体积为500μL，4℃反应150min，反应结束后去除游离的¹²⁵I-AngII，用PBS洗涤3次，加入0.1mol/LNaOH溶液消化10min，将细胞液移入塑料管，用γ计数器测量每管内溶液的γ计数。经GraphPadPrism4竞争结合曲线拟合程序处理即可得出新型化合物抑制与膜蛋白结合的半抑制常数和IC₅₀值。

实验结果：受试的化合物与血管平滑肌细胞膜AT₁受体有很好的亲和性，比较IC₅₀值与K_i值发现，化合物I能够比氯沙坦更好地与AngII受体选择性相结合（图1）,说明该化合物能很好地拮抗AngII与血管平滑肌细胞膜AT₁受体的结合。

表1.化合物I与AT₁受体的亲和性比较

降压药物活性筛选实验

实验动物：自发性高血压大鼠（SHR）100只健康，各半（雌性未孕），购自中国科学院上海实验动物中心。

受试药品：实施例1的化合物。

阳性对照药：氯沙坦，灌胃剂量为10mg/kg。

实验方法：选用100只自发性高血压大鼠(SHR)模型，分为空白组，阳性对照组，化合物I2个给药组，用小动物无创伤血压换能器经载波放大之后连至MPA－HBBS型清醒自由活动动物血压记录分析系统(上海，奥尔科特)，四肢皮下插入针形电极，连接到交流放大器用于监测标准二导联心电图。股动脉插管法测量清醒大鼠主动脉平均动脉压(MAP)，收缩压(SAP)，舒张压(DAP)，心率(HR)及心电图(ECG)。

试验时将待试化合物配制成浓度为10mg/kg的水溶液。阳性对照药氯沙坦，试验时配制成浓度为10mg/kg的水溶液。

试验前SHR采取股动脉进行手术，过夜恢复。第二天SHR连接多道生理信号系统，在线连续检测检测血压，记录给药前及给药后血压值变化。

数据处理：所有实验数据均以均数±标准差表示，用药后各组间血压比较用完全随机设计的方差分析，如各组总体均数不等，再用多个样本均数间的多重比较，即q检验进行处理。

实验结果：以治疗前后血压差值作为变量，化合物I给药后10h内血压降低值与阳性对照组比较均有显著差异(P<0.05)，降压效果显著，且降压持续时间长于氯沙坦，最大降压值达到42mmHg（图2），且有效降压时间可维持24小时以上。实验证明，化合物对心率均无影响。

结合体外受体实验和动物体内降压实验的结果，化合物I相较于目前已上市的药物氯沙坦，它能更好的拮抗AngII与血管平滑肌细胞膜AT₁受体的结合，降低并维持血压，具有进一步新药研发的价值。

Claims

1.一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2～4mmol(R,S)-2,6-二甲基吗啉和3～5mmol的碱溶于14～16mL有机溶剂中，氮气保护下，于50～60℃搅拌30～60min，冷却到室温，滴加8-11mL含有3～5mmolI₁的无水THF溶液，加热搅拌后减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得I₂；其中，I₁为I₂为

(2)将2～3mmolI₂溶于9～10mL有机溶剂中，加入1～3mol/L的碱溶液，搅拌回流加热3～4小时，减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得I₃；其中，I₃为

(3)将2～3mmolI₃、3～5mmol有机溶剂以及5～6mmol的碱混合搅拌加热回流4～5h，减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得I₄；其中，I₄为

(4)将2～3mmolI₄溶于20～30mL有机溶剂中，加入10～16mmol试剂A和10～14mmol试剂B，N₂保护下，搅拌回流加热26～30小时，减压先除去有机溶剂，萃取，水洗，干燥，过滤，减压除去溶剂，然后进行柱层析分离纯化，即得；其中，试剂A为NaN₃，试剂B为Bu₃SnCl，产物结构为

2.根据权利要求1所述的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的有机溶剂为甲醇或CH₂Cl₂，碱为NaOH。

3.根据权利要求1所述的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的有机溶剂为DMF、乙酸乙酯或邻氟苯腈，碱为K₂CO₃。

4.根据权利要求1所述的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的有机溶剂为DMF、乙酸乙酯或CH₂Cl₂。

5.根据权利要求1所述的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(3)中柱层析分离中填充剂为硅胶，洗脱剂为体积比2:1～5:1的石油醚和乙酸乙酯。

6.根据权利要求1所述的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中柱层析分离中填充剂为硅胶，洗脱剂为体积比200:1～300:1的二氯甲烷和甲醇。

7.根据权利要求1所述的一种吗啉类四氮唑化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中柱层析分离中填充剂为硅胶，洗脱剂为体积比20:1～100:1的二氯甲烷和甲醇。