CN102796083A

CN102796083A - 杂螺环酮n-苯基吲哚类化合物、其制备方法及在心血管疾病防治等医药领域的应用

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Publication number: CN102796083A
Application number: CN2012102788053A
Authority: CN
Inventors: 陈志龙; 袁伟东; 达雅静; 乜永艳; 郄骊; 李福民; 叶颖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-08-07
Also published as: CN102796083B

Abstract

本发明公开了一类杂螺环酮N-苯基吲哚类化合物、其制备方法及在心血管疾病防治等医药领域的应用。该化合物是由杂螺环、吲哚、苯环与四氮唑有机地连接起来而成，是血管紧张素II的AT1型受体阻滞剂，该化合物可用于预防或治疗高血压、冠心病、心脑肾血管疾病、偏头痛、肺动脉高压等疾病。

Description

杂螺环酮N-苯基吲哚类化合物、其制备方法及在心血管疾病防治等医药领域的应用

技术领域

本发明涉及医药化学领域，具体地说涉及一类具有预防和治疗高血压及其他心脑肾血管疾病、偏头痛、肺动脉高压等疾病的药物。

背景技术

肾素-血管紧张素系统(RAS)是调节血压和电解质平衡的重要因素。由肝脏分泌的血管紧张素原，在肾素的作用下，转化为血管紧张素I(Ang I)。Ang I在血管紧张素转化酶(ACE)作用下生成血管紧张素II(AngII)。AngII的受体主要有AngII1型受体(AT₁受体)、Ang II2型受体(AT₂受体)两种受体亚型。目前认为AngII的生理作用主要是由AT₁受体介导的。当AngII和AT₁受体作用时，导致心血管收缩加强、心肌血管平滑肌肥厚、肾钠重吸收增加；当AngII和AT₂受体作用时，使细胞增殖下降、血浆精氨酸加压素(AVP)水平下降、对收缩血管物质的反应下降。

1970年Marshall等人合成了第一个受体拮抗剂非肽类化合物沙拉新(Sarala-sin：Sarl-Ala8-Ang II)，它与Ang II的结构十分相似，其对离体组织有专属性拮抗作用。但在临床实际应用中，由于存在口服无效，代谢不稳定，并具有部分AngII激动作用而受到限制。1982年，日本武田制药公司在研究咪唑乙酸类化合物的利尿降压作用时，首先发现S-8307能够抑制Ang II诱发的兔动脉收缩和升压效应，虽然活性较弱，但属于Ang II受体专一性拮抗剂，且没有Saralasin的激动效应。80年代末期，Dupont公司(Med.Rev.1992，12：149-158)和Smithkline Beecham(Drugs of the fixture.1992，17：575-593)公司的研究人员，利用假定的AngII活性构象的两种不同分子模型，将Ang II的C-末端区域与S-8307排列比较，对S-8307进行了系列的结构修饰，以增强与受体的亲和力，结果分别得到了两种不同结构类型的、都具有较高活性的化合物Dup-753(Losartan)和SK&F-108566(Eprosartan)，Losartan于1994年在瑞典上市(Drugs of the Future.1997，22：1079-1085)，Eprosartan于1997年在德国上市(Drugs of the future.1996，21(8)：794-798)。

非肽类AngII受体拮抗剂以其与AngII受体亲和力强、选择性高、口服有效、作用时间长等优点而被看好，是一类很有前途的降压药。1997年7月，伊贝沙坦(Irbesartan)上市。商品名为Avapro。伊贝沙坦口服后不需要通过生物转化成活性形式。伊贝沙坦吸收完全、迅速，其平均生物利用度为60～80％。服用后1.5～2h出现血药浓度峰值，不受食物的影响。伊贝沙坦的消除半衰期为11～15h。

发明内容

本发明以伊贝沙坦为先导化合物，将其结构中的一个苯环改成吲哚，并且改变杂螺环上脂肪链的长度。从而期望所制备的化合物，能够增强与AT₁受体的结合能力，提高结合的选择性，减缓在体内的代谢速度，降低开环的降解速度，并延长药物的作用时间，成为高效的、高选择性的、长效的降压新药。为此我们设计合成了一类杂螺环酮N-苯基吲哚化合物(系列I和系列II)，并提供了该类化合物的制备方法。该类化合物的结构为：

系列I 系列II

其中R为正丙基(a)，正丁基(b)，正戊基(c)，正己基(d)。该类化合物包括：

2-丙基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(Ia)

2-丙基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IIa)

2-丁基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(Ib)

2-丁基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IIb)

2-戊基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(Ic)

2-戊基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IIc)

2-己基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(Id)

2-己基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4- 酮(IId)

本发明提供的杂螺环酮N-苯基吲哚类化合物，可以通过下述方法制备：由苯甲酰基保护的溴甲基吲哚与正烷基杂螺环酮，通过亲核取代反应得到含有杂螺环酮、甲基吲哚、苯甲酰基三部分结构的化合物。然后在碱性条件下水解脱去保护基，得到含有杂螺环酮和甲基吲哚结构的化合物。该化合物与邻氟苯腈在碳酸钾和DMF存在的条件下，反应生成含有邻氰基苯基结构的化合物。然后与三丁基氯化锡、叠氮化钠反应，生成杂螺环酮N-苯基吲哚类化合物。

本领域技术人员根据上述描述可以合成该类化合物。

初步的研究表明：受体结合实验中，该类化合物对AngII与AT₁受体的结合均有一定的抑制作用，其中化合物Ib，Ic，IIb，IIc与AT₁受体的特异性结合能力强于已上市药物伊贝沙坦，而化合物IIb的IC₅₀值及Ki值远小于阳性对照药伊贝沙坦，结果表明该化合物与AT₁受体有很高的特异性结合能力，提示化合物IIb在动物体内可能会有高效的降压活性。其余的化合物Ia，Id，IIa，IId与AT₁受体的特异性结合能力则略弱于伊贝沙坦，也具备进一步研究的价值。在动物体内的降压活性评价中，该类化合物对SHR大鼠的血压均有一定程度的降低作用。其中，活性最好的化合物IIb最大降压值达到55mmHg，降压持续时间长达10小时以上，与阳性对照药伊贝沙坦相比有明显的显著性差异，说明化合物IIb有望成为具有高效、长效、平稳降压特点的抗高血压候选新药，非常值得关注和研究。而化合物Ib，Ic，IIc的最大降压值和降压持续时间也明显优于伊贝沙坦，也值得进一步研究。

附图说明

图1显示了化合物IIb对¹²⁵I-AngII与AT₁受体结合的抑制曲线。

图2显示了化合物IIb对SHR大鼠MAP的影响

具体实施方式

[实施例1]

该化合物：2-丁基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(化合物I b)的制备方法具体包括以下步骤：

步骤1：合成2-丁基-3-[(1-苯酰基-1H-吲哚-4-基)甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(化合物Ib₃)

丁基杂螺环酮(化合物Ib₁)是参照文献(J Med Chem，1993，36：4230-4238)所制备。(4-(溴甲基)-1H-吲哚-1-基)(苯基)甲基酮(化合物Ib₂)是参照文献(J Med Chem，1993，36，3371-3380)所制备。将丁基杂螺环酮(800mg，3.48m mol)和60％的NaH(293mg，7.33m mol)溶于15mL无水THF中。氮气保护下，于50℃搅拌30min。冷却到室温，缓慢滴加10mL含有(4-(溴甲基)-1H-吲哚-1-基)(苯基)甲基酮(1000mg，3.18m mol)的无水THF溶液。然后加热搅拌3h。将反应液倒入15mL冰水中。用乙酸乙酯萃取三次(20mL×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗一次(30mL)。加入无水硫酸镁干燥，抽滤旋干。柱层析分离，石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。得淡黄色液体0.93g，产率90.4％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.35(1H，d，J＝8.52Hz，N-C2-H)，7.73(2H，m，Ph-H)，7.61(1H，m，Ph-H)，7.54(2H，m，Ph-H)，7.52(1H，s，Ph-H)，7.38(1H，s，Ph-H)，7.34(1H，d，J＝3.8Hz，Ph-H)，6.65(1H，s，Ph-H)，4.79(2H，s，N-CH₂-Ph)，2.04～1.68(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，0.83～2.50(9H，m，CH₂CH₂CH₂CH₃)；MS(ESI)m/z：428.4[M+1]⁺。

步骤2：2-丁基-3-[(1H-吲哚-4-基)甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(化合物I b4)

将2-丁基-3-[(1-苯酰基-1H-吲哚-4-基)甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(1.31g，2.97mmol)溶于20mL甲醇中，加入2mol/L的NaOH溶液7.71mL。搅拌回流加热4h。减压蒸去甲醇。用CH₂Cl₂萃取四次(10mL×4)，小心乳化。合并有机相，用饱和食盐水洗一次 (30mL)。有机相用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，对所得残留物进行柱层析(洗脱液：石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)，减压蒸除溶剂得0.846g淡黄色液体，产率是84.5％。 ¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.35(1H，s，N-H)，7.47～6.52(5H，m，indo-H)，4.94(2H，s，Ph-CH₂)，2.04～1.68(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，0.83～2.50(9H，m，CH₂CH₂CH₂CH₃)；MS(ESI)m/z：324.2[M+H]⁺。

步骤3：2-(4-((2-丁基-4-氧代-1，3-二氮杂螺环酮[4，4]壬-1-烯-3-基)甲基)-1H-吲哚-1-基)苯腈(化合物Ib₅)

将2-丁基-3-[(1H-吲哚-4-基)甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(1.91g，5.9m mol)，邻氟苯腈(0.96mL，8.83m mol)，K₂CO₃(1.62g，11.73m mol)溶于50mL D MF中，搅拌加热回流4h。反应液中加入乙酸乙酯，用水洗五次(30mL×5)，饱和食盐水洗涤一次(30mL)。加入无水硫酸镁干燥，抽滤旋干。柱层析分离，石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1，得淡黄色液体1.51g，产率60.2％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.85(1H，d，J＝7.72Hz，Ph-H)，7.74(1H，t，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.58(1H，d，J＝8.04Hz，Ph-H)，7.51(1H，t，J＝7.64Hz，Ph-H)，7.43(1H，d，J＝3.2Hz，indo-H)，7.27(1H，d，J＝8.36Hz，Ph-H)，7.19(1H，t，J＝7.44Hz，Ph-H)，6.94(1H，d，J＝7.12Hz，Ph-H)，6.80(1H，d，J＝3.2Hz，indo-H)，5.01(2H，s，P h-CH₂)，2.33(2H，t，J＝7.64Hz，CH ₂CH₂CH₂CH₃)，1.83～2.07(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.52(2H，m，J＝7.64Hz，CH₂CH ₂CH₂CH₃)，1.28(2H，m，J＝7.64Hz，CH₂CH₂CH ₂CH₃)，0.82(3H，t，J＝7.64Hz，CH₂CH₂CH₂CH ₃)。

步骤4：合成2-丁基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(化合物I b)

将2-(4-((2-丁基-4-氧代-1，3-二氮杂螺环酮[4，4]壬-1-烯-3-基)甲基)-1H-吲哚-1-基)苯腈(700mg，1.65m mol)溶于30mL DMF中，加入NaN₃(429mg，6.60m mol)和Bu ₃SnCl(1.15mL，6.60m mol)。N₂保护下，搅拌回流加热6h。补加NaN₃(429mg，6.60m mol)和Bu3SnCl(1.15mL，6.60m mol)，继续搅拌加热回流16h。将反应液倒入30mL冰水中，用6mol/L HCl溶液将pH值调至5。用CH₂Cl₂萃取反应液(50mL)，有机相用水洗5次(30mL×5)，饱和食盐水洗一次(30mL)。加入无水硫酸镁干燥，过滤旋干。柱层析分离，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝50∶1～30∶1，得淡黄色固体370mg，产率42.8％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.86(1H，s，CN₄H)，8.16(1H，d，J＝7.52Hz，Ph-H)，7.69～7.59(2H，m，Ph-H)，7.52(1H，d，J＝7.68Hz，Ph-H)，7.08(1H，d，J＝3.24Hz，indo-H)，6.99(2H，q，J₁＝15Hz，J₂＝8.32Hz，Ph-H)，6.78(1H，J＝6.24Hz，Ph-H)，6.56(1H，d，J＝3.2Hz，indo-H)，4.93(2H，s，Ph-CH₂)，2.18(2H，t，J＝7.64Hz，CH ₂CH₂CH₂CH₃)，2.03～1.73(8H，m，CH₂CH₂CH₂ CH₂)，1.52(2H，m，J＝7.64Hz，CH₂CH ₂CH₂CH₃)，1.15(2H，m，J＝7.64Hz，CH₂CH₂CH ₂CH₃)，0.71(3H，t，J＝7.64Hz，CH₂CH₂CH₂CH ₃)；MS(ESI)m/z：468.1[M+1]⁺。

[实施例2]

2-丙基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(I a)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率46.7％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.20(1H，m，N-CH)，7.59-6.70(7H，m，Ph-H)，6.54(1H，m，CH＝C)，4.91(2H，s，N-CH₂)，2.25-2.22(2H，t，J＝7.2Hz，CH ₂CH₂CH₃)，1.86(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.49(2H，m，CH ₂CH₃)，0.85-0.81(3H，t，J＝7.2HZ，-CH3)；MS(ESI)m/z 454.5[M+1]⁺

[实施例3]

2-丙基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IIa)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率45.9％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.05(1H，m，N-CH)，7.59-6.70(7H，m，ph-H)，6.54(1H，m，CH＝C)，4.91(2H，s，N-CH₂)，2.25-2.22(2H，t，J＝7.2Hz，CH ₂CH₂CH₃)，1.96(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.59(2H，m，CH ₂CH₃)，0.85-0.81(3H，t，J＝7.2Hz，-CH3)；MS(ESI)m/z：454.5[M+1]⁺。

[实施例4]

2-丁基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IIb)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率48.5％。¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ16.43(1H，s，CN₄H)，7.91(1H，d，J＝7.68Hz，N-CH)，7.77(1H，m，Ph-H)，7.68(1H，m，Ph-H)，7.62(1H，m，Ph-H)，7.33(1H，s，Ph-H)，7.25(1H，d，J＝3.60Hz，Ph-H)，6.86(2H，m，Ph-H)，6.56(1H，d，J＝3.20Hz，N-C₃-H)，4.69(2H，s，N-CH₂-Ph)，0.73～2.29(17H，m)；MS(ESI)m/z：468.5[M+1]⁺。

[实施例5]

2-戊基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(Ic)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率49.2％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.28-8.26(1H，d，J＝8.4Hz，N-CH)，7.69-6.87(7H，m，ph-H)，6.60(1H，d，J＝3.1Hz，CH＝C)，5.01(2H，s，N-CH₂)，2.29-2.25(2H，t，J＝7.7Hz，CH ₂CH₂CH₂CH₂CH₃)，1.96(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.79(6H，m，CH ₂CH ₂CH ₂CH₃)，0.86-0.83(3H，t，J＝7.4HZ，-CH3)；MS(ESI)m/z：482.6[M+1]⁺。

[实施例6]

2-戊基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(II c)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率50.3％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.39-8.37(1H，d，J＝8.4Hz，N-CH)，7.75-7.08(7H，m，ph-H)，6.68(1H，d，J＝1.9Hz，CH＝C)，4.98(2H，s，N-CH₂)，2.29-2.25(2H，t，J＝7.7Hz，CH ₂CH₂CH₂CH₂CH₃)，1.96(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.79(6H，m，CH ₂CH ₂CH ₂CH₃)，0.90-0.86(3H，t，J＝7.4Hz，-CH3)；MS(ESI)m/z：482.6[M+1]⁺。

[实施例7]

2-己基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-4-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(I d)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率49.3％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.29-8.26(1H，d，J＝8.4Hz，N-CH)，7.69-6.87(7H，m，ph-H)，6.60(1H，d，J＝3.1Hz，CH＝C)，5.11(2H，s，N-CH₂)，2.32-2.27(2H，t，J＝7.9HZ，CH ₂CH₂CH₂CH₂CH₃)，1.98(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.81(8H，m，CH ₂CH ₂CH ₂CH ₂CH₃)，0.89-0.85(3H，t，J＝7.6HZ，-CH3)；MS(ESI)m/z：496.7[M+1]⁺。

[实施例8]

2-己基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IId)的制备方法：

实验步骤如实施例1所述，产率47.8％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.28-8.27(1H，d，J＝8.2Hz，N-CH)，7.66-6.89(7H，m，ph-H)，6.60(1H，d，J＝3.0HZ，CH＝C)，5.00(2H，s，N-CH₂)，2.31-2.29(2H，t，J＝7.7Hz，CH ₂CH₂CH₂CH₂CH₃)，1.96(8H，m，CH₂CH₂CH₂CH₂)，1.80(8H，m，CH ₂CH ₂CH ₂CH ₂CH₃)，0.88-0.84(3H，t，J＝7.5Hz，-CH3)；MS(ESI)m/z：496.7[M+1]⁺。

[实施例9]化合物受体结合活性实验

受试细胞：SD大鼠血管平滑肌细胞。

药品：实施例1-8的化合物，伊贝沙坦，¹²⁵I-AngII，[Sar¹-Ile⁸]-Ang II。

实验方法：

平滑肌细胞原代培养及鉴定：将SD大鼠用水合氯醛麻醉后，在无菌条件下剪开胸、腹腔，暴露心脏，除去结缔组织，分离主动脉，用PBS缓冲液冲洗直至血管内无残留血液。然后撕去血管外膜至血管光滑透明，用眼科剪将血管剪开，用眼科镊钝性刮去血管内膜，再用眼科剪将血管剪成1-2mm²大小后用胶原酶37℃消化1h，加入DMEM培养液(FBS 15％)终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入新鲜的培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，静置培养3 天，当细胞密度达到90％时进行消化传代。细胞鉴定：常规消化细胞，将细胞接种于已处理的盖玻片。第2天用PBS缓冲液轻缓洗涤后，加入4％多聚甲醛在室温下固定30min，再用PBS缓冲液洗涤3次，2min/次。然后用1％Triton X-100(PBS配制)室温下渗透细胞10min，增加细胞通透性以便抗体更好地进入细胞。再用3％H₂O₂室温作用10min，PBS洗3次，5min/次。用山羊血清封闭非特异性抗原30min，滴加抗SMC-α-actin抗体(1∶200)，放置4℃过夜后用PBS缓冲液洗涤3次，5min/次。次日回收一抗，用PBS洗涤3次，5min/次，以下步骤避光操作，加入二抗(1∶200)在室温下孵育1h，PBS缓冲液洗涤3次，5min/次，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测。

放射配基受体结合试验：

饱和实验：将定量¹²⁵I-Ang II溶解于1mL PBS溶液，再稀释成不同浓度的溶液。取血管平滑肌3-7代用于试验，铺于24孔板(1×10⁵/孔)，贴壁后用于试验。结合反应：总体积为500μL，细胞板每孔依次加入浓度逐渐增加的¹²⁵I-Ang II溶液，使其终浓度为0-1.5nM，4℃反应150min，为了扣除非特异性结合，每孔加入未标记的Ang II(终浓度为1×10^-6M)和浓度递增的 ¹²⁵I-Ang II溶液(终浓度为0-1.5nM)，4℃反应150min，反应结束后去除多余的反应液，用PBS洗涤3次，加入0.1mol/LNaOH溶液消化细胞10min，将细胞消化液移入塑料管，用γ计数器测量每管内溶液的γ计数。经GraphPad Prism4饱和曲线拟合程序处理得到¹²⁵I-Ang II受体结合饱和曲线。每个浓度采用2复孔。

竞争试验：药物溶液：取一定量的化合物溶于1mL DMSO溶液，浓度为10^-2M，再10倍稀释成不同浓度的溶液(1×10^-10M～1×10^-4M)。细胞铺板(1×10⁵/孔)后，每孔加入0.1nM ¹²⁵I-Ang II以及不同浓度的新化合物(终浓度1×10^-6～1×10^-11mol/L)，总体积为500μL，4℃反应150min，反应结束后去除游离的¹²⁵I-Ang II，用PBS洗涤3次，加入0.1mol/L NaOH溶液消化10min，将细胞液移入塑料管，用γ计数器测量每管内溶液的γ计数。经GraphPad Prism 4竞争结合曲线拟合程序处理即可得出新型化合物抑制与膜蛋白结合的半抑制常数和IC₅₀值。

实验结果：受试的化合物与血管平滑肌细胞膜AT₁受体均有很好的亲和性，亲和比较IC₅₀值与Ki值发现，化合物IIb与伊贝沙坦相比对AngII有更好的抑制作用(图1)，而其余的化合物与伊贝沙坦相比无明显差异，说明该化合物系列中的化合物IIb能很好地抑制Ang II与血管平滑肌细胞膜AT₁受体的结合，值得进一步的研究。

表1.化合物系列与AT₁受体的亲和性比较

[实施例10]降压药物活性筛选实验

实验动物：自发性高血压大鼠(SHR)100只

♀，健康，各半(雌性未孕)，购自中国科学院上海实验动物中心。

受试药品：实施例1-8的化合物。

阳性对照药：伊贝沙坦，临床用量为150mg/kg，设人体重为60kg，换算为大鼠剂量15mg/kg。

最终设定大鼠灌胃剂量为15mg/kg。

实验方法：选用100只自发性高血压大鼠(SHR)模型，分为空白组，阳性对照组，化合物系列Ia、Ib、Ic、Id、IIa、IIb、IIc、IId八个给药组，用小动物无创伤血压换能器经载波放大之后连至MPA-HBBS型清醒自由活动动物血压记录分析系统(上海，奥尔科特)，四肢皮下插入针形电极，连接到交流放大器用于监测标准二导联心电图。股动脉插管法测量清醒大鼠主动脉平均动脉压(MAP)，收缩压(SAP)，舒张压(DAP)，心率(HR)及心电图(ECG)。

试验时将待试化合物配制成浓度为15mg/kg的水溶液。阳性对照药伊贝沙坦，试验时配制成浓度为15mg/kg的水溶液。

试验前SHR采取股动脉进行手术，过夜恢复。第二天SHR连接多道生理信号系统，在线连续检测检测血压，记录给药前及给药后血压值变化。

数据处理：所有实验数据均以均数±标准差

表示，用药后各组间血压比较用完全随机设计的方差分析，如各组总体均数不等，再用多个样本均数间的多重比较，即q检验进行处理。

实验结果：血压测试结果：以治疗前后血压差值作为变量，各组均值比较有显著差异(P＜0.01)，再经多样本均数的q检验证明，化合物I、II系列与空白组比较均有极显著差异(P＜0.01)，且与阳性对照药相比，化合物I、II组给药后10h内血压降低值与阳性对照组比较均有显著差异(P＜0.05)，降压效果显著，且降压持续时间长于伊贝沙坦，其中化合物IIb的降压效果最为显著，最大降压值达到55mmHg，且有效降压时间可维持10小时以上(图2)。实验证明，化合物对心率均无影响。

结合体外受体实验和动物体内降压实验的结果，我们筛选出化合物IIb，相较于目前已上市的药物伊贝沙坦，它能更好的抑制AngII与AT₁受体的结合，持久降低血压，说明化合物IIb有望成为具有高效、长效、平稳降压特点的抗高血压候选新药，值得进一步研究开发。

表2.给药后，化合物系列I对血压的作用比较

注：与空白组比较：*P＜0.01，**P＜0.01；与阳性对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

表3.给药后，化合物系列II对血压的作用比较

注：与空白组比较：*P＜0.01，**P＜0.01；与阳性对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01 。

Claims

1.一类杂螺环酮N-苯基吲哚化合物系列I和系列II，其结构为：

系列I 系列II

其中R为C₃-C₆的烷基链

2.根据权利要求1所述的杂螺环酮N-苯基吲哚化合物系列I和系列II，其特征在于R为正丙基(a)，正丁基(b)，正戊基(c)，正己基(d)。该类化合物包括：

2-己基-3-[[1-[2-(1H-四氮唑-5-基)苯基]-1H-吲哚-5-基]甲基]-1，3-二氮杂螺环[4，4]壬-1-烯-4-酮(IId)

3.根据权利要求1所述的杂螺环酮N-苯基吲哚化合物系列I和系列II的制备方法包括以下步骤(以系列I为例来说明)：

1)化合物I₃的合成

化合物I₁制备参照文献(J Med Chem，1993，36：4230-4238)。化合物I₂制备参照文献(J MedChem，1993，36，3371-3380)。将1～25m mol的化合物I₁和1～2m mol的强碱弱酸盐，溶于1～50mmol的有机溶剂中，然后在50℃下，搅拌30分钟。之后加入1～25m mol的I₂，升温至回流，继续反应6个小时。反应结束后，减压先除去有机溶剂，然后乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去溶剂，对所得残留物进行柱层析分离纯化。

2)化合物I₄的合成

将1～3m mol的I₃溶于1～10m mol有机溶剂中，加入1～3mol/L的碱溶液。搅拌回流1～4小时。反应结束后，减压先除去有机溶剂，CH₂Cl₂萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去溶剂，对所得残留物进行柱层析分离纯化。

3)化合物I₅的合成

将1～6m mol的I₄，1～8m mol的邻氟苯腈，1～11m mol的强碱弱酸盐，加入到1～10m mol有机溶剂中，搅拌回流1～6小时。反应液用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去溶剂，对所得残留物进行柱层析分离纯化。

4)化合物I的合成

将1～3m mol的I₅溶于1～10m mol有机溶剂中，加入1～6m mol的NaN₃，1～6m mol的Bu₃SnCl。N₂保护下，搅拌回流加热24h。将反应液倒入10mL冰水中，用1～3mol/L酸性溶液将pH值调至3～6.CH₂Cl₂萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压除去溶剂，对所得残留物进行柱层析分离纯化。

4.根据权利要求3所述的杂螺环酮N-苯基吲哚化合物I的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所用的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，4-二氧六环、乙二醇、甲醇、丙酮、THF，但又不限于这些溶剂；碱是碳酸钾、碳酸钠，还可以是NaH，但又不限于这些碱。柱层析分离中的填充剂为硅胶，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯或石油醚与二氯甲烷的混合溶剂，混合比例范围为1∶1～5∶1。

5.根据权利要求3所述的杂螺环酮N-苯基吲哚化合物I的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，4-二氧六环、乙二醇、甲醇，但又不限于这些溶剂；无机碱是氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂，但又不限于这些无机碱；柱层析分离中的填充剂为硅胶，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯或石油醚与二氯甲烷的混合溶剂，混合比例范围为1∶1～5∶1。

6.根据权利要求3所述的杂螺环酮N-苯基吲哚化合物I的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，所用的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，4-二氧六环、乙二醇、甲醇，但又不限于这些溶剂；碱是碳酸钾、碳酸钠，但又不限于这些碱。柱层析分离中的填充剂为硅胶，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯或石油醚与二氯甲烷的混合溶剂，混合比例范围为1∶1～5∶1。

7.根据权利要求3所述的杂螺环酮N-苯基吲哚化合物I的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，所用的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，4-二氧六环、乙二醇、甲醇，但又不限于这些溶剂；无机酸是盐酸、硫酸，但又不限于这些酸。柱层析分离中的填充剂为硅胶，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯或石油醚与二氯甲烷的混合溶剂，混合比例范围为1∶1～5∶1。

8.权利要求杂螺环酮N-苯基吲哚化合物系列I和系列II，将由N-苯基吲哚、四氮唑、杂螺环酮有机的联接而成，是血管紧张素II的AT₁型受体的拮抗剂。该化合物是用于预防和治疗高血压、冠心病、心脑肾血管疾病、偏头痛、肺动脉高压等疾病的药物。