CN103432100B - 基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的plga载药空心微囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，包括：将PLGA溶于油相，将盐酸阿霉素DOX溶于超纯水中，得到水相；然后将油相和水相混合，超声处理，得到W/O乳液；将W/O乳液加入PVA溶液中，均质化，得到W/O/W乳液；将W/O/W乳液加入异丙醇水溶液中，磁力搅拌，离心洗涤，得PLGA-DOX微囊；将该微囊分散在水中；转入PEI-PEG-FA聚合物水溶液中，搅拌混合，再离心洗涤，冷冻干燥，即得。本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压；本发明制备得到的材料具有良好的药物缓释性能，肿瘤细胞靶向治疗效果，为多功能靶向药物制剂的开发提供了借鉴。
Description
技术领域
本发明属于载药纳米材料领域，特别涉及一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法。
背景技术
PLGA具有良好的生物相容性、生物降解性、成膜成囊等特性，使其广泛应用于生物医学领域。在我们前期工作中，我们采用双乳化法制备了包裹水溶性抗癌药物DOX的PLGA空心微囊，可用于超声成像、磁共振成像及药物缓释（申请号：201310207836.4），但该法制备的微球系统缺乏对癌组织的特异靶向性，一定程度上限制了其生物医学应用。PLGA为链状聚合物，以往使其具备肿瘤细胞靶向性的改性方式是对其末端基团进行接枝，但改性效率较低。最近，Ke等人(H.Ke,et a1.Angew.Chem.2011,123,3073–3077.)以PLA制备微囊，以静电吸附方法在PLA微囊外层包裹PAH以达到改性及改变电荷的目的。另外，Liang等人（B.Liang et al.Biomaterial.2009,30,4014-4020)以FA和PEG接枝改性PEI使其具备良好的肿瘤细胞靶向性用于胶质瘤的抑制。结合上述方法，在本专利中，我们设计了一种高效的改性方法，先将肿瘤靶向分子叶酸（FA）接枝在聚乙二醇（PEG）上，进而修饰在聚乙烯亚胺（PEI）上，再用静电吸附法将合成的PEI-PEG-FA包裹在PLGA载药空心微囊外部。我们评价了PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊良好的肿瘤细胞（KB）的靶向差异性，及药物缓释性能。制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊有望成为一种新型的靶向载药制剂。
检索国内外有关PLGA微球的药物制剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于PEI-PEG-FA改性的PLGA空心微囊包裹抗癌药物的制备与应用方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，该发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的制备，用于癌细胞的靶向化学治疗，具有很好的实用价值；该发明制备得到的功能化PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有良好的DOX药物负载和缓释效果以及良好的靶向抗肿瘤活性，为新型多功能靶向药剂的开发打下了良好的基础。
本发明的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，包括：
（1）将叶酸FA溶于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS及碳二亚胺EDC活化羧基，再加入氨基聚乙二醇羧酸NH2-PEG-COOH，然后在25-28℃条件下，搅拌反应2-3d，透析，冻干，再复溶于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和碳二亚胺EDC活化羧基，再加入聚乙烯亚胺PEI（Sigma公司），在25-28℃条件下，搅拌反应2-3d，透析，冻干，得到PEI-PEG-FA聚合物；其中投料摩尔比PEI：PEG：FA=1：22：15；
（2）将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA（山东济南岱罡公司）溶于有机溶剂中得到油相；将盐酸阿霉素DOX·HCl（北京华奉联博科技有限公司）溶于超纯水中，得到水相；然后将油相和水相混合，在冰水浴中超声处理20-30s，得到油包水W/O乳液；其中PLGA与DOX·HCl的质量比为100：1；油相和水相的体积比为5-10:1；
（3）将上述W/O乳液加入聚乙烯醇PVA（sigma公司）水溶液中，冰水浴条件下进行均质化，得到水包油包水W/O/W乳液；其中W/O/W乳液三相（从外到内）体积比为25-100：5-10：1；
（4）将上述W/O/W乳液加入异丙醇水溶液中，搅拌1-4h，使有机溶剂（PLGA溶液的溶剂）挥发，并使形成的乳液液滴固化成微球，离心洗涤，得到PLGA-DOX载药空心微囊；其中W/O/W乳液和异丙醇水溶液的体积比为1:50-100；
（5）将上述PLGA-DOX载药空心微囊分散于水中，加入PEI-PEG-FA聚合物水溶液，搅拌15-30min，使聚合物充分静电吸附在微囊表面，离心洗涤，再分散在水中，冷冻干燥，得到基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊（PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊）；其中PLGA-DOX载药空心微囊与PEI-PEG-FA质量比为1-4：1；PLGA-DOX载药空心微囊分散于水中的水的体积、PEI-PEG-FA聚合物水溶液及再次分散的水的体积比为1:50：30。
所述步骤（1）中溶剂均为二甲基亚砜中DMSO；产物PEI-PEG-FA分子个数比为1：15：6；PEI分子量为25000，PEG分子量为2000。
所述步骤（2）中PLGA的分子量Mw为20000-40000，PLGA的有机溶剂为二氯甲烷CH2Cl2，PLGA溶液的浓度为0.0500mg/L；DOX·HCl水溶液的浓度为5mg/mL。
所述步骤（2）中超声处理为细胞破碎仪超声处理。
所述步骤（3）中PVA的分子量Mw为20000，PVA溶液的质量百分浓度为2%-5%。
所述步骤（3）中均质化为均质机剪切，转速为9500rpm，时间为5-10min。
所述步骤（4）中离心洗涤为离心转速为3000-3500rpm，离心3-5min，弃去上清液，离心残留物用超纯水水洗，重复3-5次至离心液澄清无色。
所述步骤（5）中PEI-PEG-FA聚合物水溶液的浓度为0.25mg/ml-0.5mg/ml。
所述步骤（5）中冷冻干燥温度为-50～-80℃，时间为12-20h。
所述步骤（5）中所得的基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊用于药物缓释及癌细胞靶向治疗。
所述步骤（5）中所制得PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊中DOX经紫外-可见分光光度计测定含量为0.8%。
本发明中使用均质机对乳液液滴进行高速剪切，使乳液液滴尺寸分布均一。两步乳化过程中均使用冰水浴给乳液降温，以降低液滴的自由运动，也有助于保持液滴的尺寸均一性。
本发明中两步乳化后将乳液转入较大体积的异丙醇溶液中，进一步降低乳液液滴之间的相互碰撞，减小液滴之间的汇聚。异丙醇与所使用的有机溶剂CH2Cl2相混溶，与PLGA不相溶，从而可以促进PLGA微球的固化，巧妙地结合了溶剂挥发与相分离两种制备固化微球的技术。
PLGA为链状大分子，较难进行修饰改性；PEI分子具有较多的氨基，可以通过共价接枝反应与肿瘤细胞靶向分子叶酸结合，再通过静电吸附，将接枝的PEI-PEG-FA吸附在PLGA-DOX微囊表面，成功赋予微囊肿瘤细胞靶向性。
使用SEM（扫描电子显微镜）、CLSM（激光共聚焦显微镜）、动态光散射仪、MTT细胞毒性实验、FCM（流式细胞仪）验证本发明获得的具有药物缓释功能及肿瘤细胞靶向治疗性能的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的结果分别如下：
（1）动态光散射仪粒径、电势测试结果
动态光散射仪测试结果显示PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊粒径较均匀，水合粒径为3019nm，表面电势为-4mv。参见说明书附图2。
（2）SEM测试结果
SEM测试结果显示了PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的外形及尺寸分布，参见说明书附图3。可以清晰地看到PLGA-DOX-PEI-PEG-FA的囊状结构，尺寸分布较窄，具有良好的单分散性。平均直径为2.5μm，参见说明书附图3。
（3）CLSM测试结果
CLSM测试结果进一步证实了PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的核壳结构，参见说明书附图4。经油溶性染色剂异硫氰酸荧光素（FITC）染色后，壳层PLGA-PEI-FA呈绿色荧光；DOX吸附在PLGA囊状内核结构显示为红色荧光。
（4）体外药物释放测试结果
以pH7.4的PBS缓冲液和pH5.6的乙酸-乙酸钠缓冲液做为药物释放缓冲液测得PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的体外DOX释放。测试结果表明制备的材料具有良好的药物缓释效果，72小时后药物达到58%的释放率，且酸性环境下释放稍快。参见说明书附图5。（5）MTT测试结果
将PLGA-PEI-PEG-FA空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊和药物DOX与KB细胞共培养48h后用MTT法检测材料的细胞毒性。PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的体外MTT毒性测试结果表明制备的材料具有较高的细胞毒性，包裹的药物DOX能有效杀死KB细胞，药效与自由DOX相近，参见说明书附图6。不含DOX的PLGA-PEI-PEG-FA空心微囊则和PBS对照组相近，不具有细胞毒性。
（6）MTT靶向测试结果
将PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊和PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊与KB细胞共培养4h后洗去微囊材料，继续培养48h后用MTT方法检测细胞活力，做靶向性分析。结果表明，叶酸接枝的PEI修饰的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有更强的细胞毒性，具有良好的肿瘤细胞靶向性,参见说明书附图7。
（7）FCM测试结果
PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊和PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的FCM测试结果表明，与叶酸接枝修饰的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊共培养的KB细胞具有更高的荧光强度，因而具有更高的细胞吞噬效果，PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有肿瘤细胞的靶向性，参见说明书附图8。
本发明方法制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊，其微囊尺寸分布较窄，具有良好的分散性。微囊能在酸性环境下较快的释放出包裹的抗肿瘤药物DOX；MTT结果表明PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有良好的细胞毒性，能有效杀死肿瘤细胞；MTT靶向性分析及FCM测试结果表明PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有良好的肿留细胞靶向性和癌细胞靶向治疗效果。
以PLGA为基材，制备了功能化的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊靶向药物制剂。
本发明涉及了三个基本原理：
（1）双乳化法制备的微球固化前为W/O/W乳滴结构，最内层水相经冷冻干燥后全部挥发使微囊为空心结构，是后期制备超声造影剂的基础。
（2）双乳化法可引入水溶性的药物分子，使制备的微囊具有多功能。水溶性药物DOX·HCl可在第一步乳化过程中进入乳滴从而被PLGA吸附在微囊核层，从而使制备的微球具有载药功能。
（3）靶向性叶酸分子可以通过乙酰化反应接枝到PEI-PEG聚合物上，再通过静电吸附的方法对制备的微囊进行表面改性，使得制备的微囊具有肿瘤细胞靶向治疗效果，是一种高效率的改性修饰方法。
本发明制备靶向载药制剂的关键要素就是找到一个合适的载体平台以负载药物分子以及靶向分子，形成多功能复合体。PLGA由两种单体——乳酸和羟基乙酸聚合而成，是一种可降解的功能高分子，具无毒、良好的成囊和成膜的性能，具有良好的生物相容性。可被制备成微球用于医学成像、药物输送、基因治疗等领域。双乳化方法可以制备出空心结构的微球，油溶性以及水溶性的药物或功能颗粒可以在乳化的过程中载入到微球中。水溶性的DOX·HCl具有较高的抗肿瘤活性，可以在乳化过程中加入到乳滴体系中，微球固化时被吸附在PLGA壳层中，使药物得到输送，降低其对正常细胞的毒害作用。而PLGA为链状大分子，较难进行修饰改性；PEI分子具有较多的氨基，可以通过共价反应与功能分子进行接枝，再通过静电吸附，将接枝的PEI-PEG-FA吸附在PLGA-DOX微囊表面，成功赋予了微囊的肿瘤细胞靶向性。
有益效果
（1）本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的制备，用于癌细胞的靶向化学治疗，具有很好的实用价值；
（2）本发明制备得到的功能化PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有良好的DOX药物负载和缓释效果以及良好的靶向抗肿瘤活性，为新型多功能靶向药剂的开发打下了良好的基础。
附图说明
图1为本发明制备方法简图；
图2为本发明制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊粒径（a）及电势图（b）；
图3为本发明制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的SEM图片(a)和粒径分布直方图(b)；图4为本发明制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊经FITC染色的CLSM图片；
图5为本发明制备的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的体外药物释放图；药物释放所用缓冲液分别为pH7.4的PBS缓冲液和pH5.6的乙酸盐缓冲液；
图6为本发明制备的PLGA-PEI-PEG-FA空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊以及药物DOX的MTT细胞活力图（KB细胞贴壁后加入不同浓度的上述材料，培养48h后，实施MTT检测）；
图7为PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊与KB细胞共培养4h后洗去材料，继续培养48h后用MTT法检测的MTT细胞活力测试图；
图8为本发明制备的PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的KB细胞FCM荧光强度分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）用2mL CH2Cl2溶解100mg PLGA；用200μL超纯水溶解1mg DOX，将有机相和水相两相混合，冰水浴状态下用细胞破碎仪超声处理30s，形成W/O乳液；
（2）将步骤1的W/O乳液转入10mL5%PVA水溶液中，冰水浴状态下用均质机剪切(9500rpm，5min)使液滴形成尺寸较为均一的W/O/W乳液；
（3）将步骤2的W/O/W乳液倾倒入80mL2%异丙醇水溶液中磁力搅拌1h后，离心（3500rpm，3min），弃去上清液，离心残留物用90mL超纯水水洗。重复上述离心水洗操作三次以上至离心液澄清无色，离心后将离心残留物重新分散于1mL超纯水中；
（4）将步骤3的离心残留物溶液快速加入50ml PEI-PEG-FA聚合物水溶液中，磁力搅拌15min，离心水洗三次以上，再重新分散于30ml超纯水中，-80℃冰箱冷冻12h后，置于冷冻干燥机冷冻干燥处理，即得功能化的壳层具有肿瘤细胞靶向分子叶酸、内层为包裹抗肿瘤药物DOX的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊。
（5）相同方法制备未包裹DOX的PLGA-PEI-PEG-FA空心微囊，即步骤1中水相不加DOX·HCl。
合成过程中对离心液用紫外-可见分光光度计进行表征。由481nm处DOX·HCl特征吸收峰画出标准曲线，计算得离心液DOX含量为0.68mg，DOX包裹量为0.32mg，PLGA微球中DOX的百分含量为0.8%。SEM图片（附图3a）表明PLGA微球颗粒直径约2.5μm，尺寸分布较窄，具有良好的单分散性。CLSM图片（附图4）表明PEI-PEG-FA外部壳层结构及PLGA-DOX内层囊状空心结构。这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊。
实施例2
以pH7.4的PBS缓冲液和pH5.6的乙酸盐缓冲液做为药物释放缓冲液测试PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊的体外DOX释放。取10mg PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊用3mL缓冲液分散后转入透析袋（Mw截留为10000），将透析袋装入25mL容量的玻璃瓶内，并在玻璃瓶内加入7mL相同缓冲液使透析袋内外缓冲液总体积为10mL。将上述玻璃瓶放入37℃恒温摇床，不同时间节点（0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，48，72h）取出3mL缓冲液并补充相同体积相同种类的缓冲液，每个材料浓度做三组平行样检测标准偏差。最终将取出的缓冲液在紫外-可见分光光度计下481nm处测试液体吸光度，并进一步计算缓冲液中药物含量及各时间点药物释放率。结果表明制备的材料具有良好的药物缓释效果，72小时后药物达到58%的释放率，且酸性环境下释放稍快。参见说明书附图5。
实施例3
通过MTT法检测细胞活力来研究PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊复合物的抗肿瘤活性，用PBS溶液做对照。取人类上皮癌细胞（KB细胞）种于96孔板，种板密度为每孔5×103个KB细胞。培养过夜后，将PLGA-PEI-PEG-FA空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊(微球浓度为3.375,6.75,12.5,25,50,100mg/L，DOX浓度为0.025,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80mg/L)与相同浓度的纯药DOX分别与KB细胞共培养，48h后，将每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL）后再培养4h，然后倒出培养基，加入200μL DMSO，放入摇床慢速摇动15min，用酶标仪在490nm处检测吸光度，每个材料浓度做三组平行样检测标准偏差。
PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊体外MTT法测试结果显示，随着载药微囊材料PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊和纯药DOX浓度的增加，细胞存活率下降，表明制备的材料具有抗肿瘤活性，包裹的药物DOX能有效杀死KB细胞，药效与自由DOX相近，参见说明书附图6。
实施例4
通过MTT法检测细胞活力来研究PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊复合物的靶向抗肿瘤活性，用PBS溶液做对照。取人类上皮癌细胞（KB细胞）种于96孔板，种板密度为每孔5×103个KB细胞。培养过夜后，将PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊(微球浓度为12.5,25mg/L，DOX浓度为0.10,0.20mg/L)分别与KB细胞共培养，4h后洗去材料。继续培养48h后，将每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL）后再培养4h，然后倒出培养基，加入200μL DMSO，放入摇床慢速摇动15min，用酶标仪在490nm处检测吸光度，每个材料浓度做三组平行样检测标准偏差。
PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊体外MTT法测试结果显示，叶酸接枝修饰的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊具有更高抗肿瘤毒性，证实了材料的靶向抗肿瘤活性。参见说明书附图7。
实施例5
通过FCM法检测细胞荧光强度来研究PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊复合物的肿瘤细胞靶向性，用PBS溶液做对照。取人类上皮癌细胞（KB细胞）种于24孔板，种板密度为每孔1×105个KB细胞。培养过夜后，将PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊、PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊(微球浓度为12.5,25mg/L，DOX浓度为0.10,0.20mg/L)分别与KB细胞共培养，4h后洗去材料，并用0.1ml胰酶将细胞消化后分散在0.5ml PBS溶液中，冰浴使细胞降低活力。用流式细胞仪（FCM）检测细胞荧光强度。每个材料浓度做三组平行样检测标准偏差。
PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊FCM法靶向性测试结果显示，叶酸接枝修饰的PLGA-DOX-PEI-PEG-FA空心微囊共培养的KB细胞具有更高的荧光强度，说明有叶酸靶向分子的材料能被肿瘤细胞特异地结合。参见说明书附图8。
对比例1
（1）用2mL CH2Cl2溶解100mg PLGA；用200μL超纯水溶解1mg DOX，将有机相和水相两相混合，冰水浴状态下用细胞破碎仪超声处理30s，形成W/O乳液；
（2）将步骤1的W/O乳液转入10mL5%PVA水溶液中，冰水浴状态下用均质机剪切(9500rpm，5min)使液滴形成尺寸较为均一的W/O/W乳液；
（3）将步骤2的W/O/W乳液倾倒入80mL2%异丙醇水溶液中磁力搅拌1h后，离心（3500rpm，3min），弃去上清液，离心残留物用90mL超纯水水洗。重复上述离心水洗操作三次以上至离心液澄清无色，离心后将离心残留物重新分散于1mL超纯水中
（4）将步骤3的离心残留物溶液快速加入50ml PEI-mPEG聚合物水溶液中，磁力搅拌15min，离心水洗三次以上，再重新分散于30ml超纯水中，-80℃冰箱冷冻12h后，置于冷冻干燥机冷冻干燥处理，即得功能化的壳层与实施例1结构相同但壳层无肿瘤细胞靶向分子叶酸、内层为包裹抗肿瘤药物DOX的PLGA-DOX-PEI-mPEG空心微囊。
（5）相同方法制备未包裹DOX的PLGA-PEI-mPEG空心微囊，即步骤1中水相不加DOX·HCl。
Claims (10)
1.一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，包括：
(1)将叶酸FA溶于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS及碳二亚胺EDC，再加入氨基聚乙二醇羧酸NH2-PEG-COOH，然后在25-28℃条件下，搅拌反应2-3d，透析，冻干，再复溶于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和碳二亚胺EDC，再加入聚乙烯亚胺PEI，在25-28℃条件下，搅拌反应2-3d，透析，冻干，得到PEI-PEG-FA聚合物；其中投料摩尔比PEI：PEG：FA＝1：22：15；
(2)将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA溶于有机溶剂中得到油相；将盐酸阿霉素DOX·HCl溶于超纯水中，得到水相；然后将油相和水相混合，在冰水浴中超声处理20-30s，得到油包水W/O乳液；其中PLGA与DOX·HCl的质量比为100：1；油相和水相的体积比为5-10:1；
(3)将上述W/O乳液加入聚乙烯醇PVA水溶液中，冰水浴条件下进行均质化，得到水包油包水W/O/W乳液；其中W/O/W乳液三相体积比为25-100：5-10：1；
(4)将上述W/O/W乳液加入异丙醇水溶液中，搅拌1-4h，离心洗涤，得到PLGA-DOX载药空心微囊；其中W/O/W乳液和异丙醇水溶液的体积比为1:50-100；
(5)将上述PLGA-DOX载药空心微囊分散于水中，加入PEI-PEG-FA聚合物水溶液，搅拌15-30min，离心洗涤，分散在水中，冷冻干燥，得到基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊；其中PLGA-DOX载药空心微囊与PEI-PEG-FA质量比为1-4：1。
2.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶剂均为二甲基亚砜中DMSO；产物PEI-PEG-FA分子个数比为1：15：6；PEI分子量为25000，PEG分子量为2000。
3.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中PLGA的分子量Mw为20000-40000，PLGA的有机溶剂为二氯甲烷CH2Cl2，PLGA溶液的浓度为0.0500mg/L；DOX·HCl水溶液的浓度为5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中超声处理为细胞破碎仪超声处理。
5.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中PVA的分子量Mw为20000，PVA溶液的质量百分浓度为2％-5％。
6.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中均质化为均质机剪切，转速为9500rpm，时间为5-10min。
7.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中离心洗涤为离心转速为3000-3500rpm，离心3-5min，弃去上清液，离心残留物用超纯水水洗，重复3-5次至离心液澄清无色。
8.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中PEI-PEG-FA聚合物水溶液的浓度为0.25mg/ml-0.5mg/ml。
9.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中冷冻干燥温度为-50～-80℃，时间为12-20h。
10.根据权利要求1所述的一种基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中所得的基于聚乙二醇及叶酸接枝的聚乙烯亚胺改性的PLGA载药空心微囊用于药物缓释及癌细胞靶向治疗。
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