CN110123766B - IGU-PLGA-NPs纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米工业技术领域,特别涉及一种IGU‑PLGA‑NPs纳米粒子及其制备方法和应用,IGU‑PLGA‑NPs是以PLGA包裹IGU的纳米粒子;制备方法包括以下步骤:步骤1,将PLGA溶于二氯甲烷溶液中,加入IGU水溶液,用探头超声对混合物进行超声处理形成乳剂;步骤2,将步骤1制得的乳剂与聚乙烯醇溶液混合,均匀化,然后加入去离子水,搅拌过夜后,离心,收集纳米粒子;步骤3,将步骤2制得的纳米粒子用双蒸水洗涤后,用EDC(1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N‑羟基‑琥珀酰亚胺;Sigma)和PEI(聚乙烯亚胺)活化,制得IGU‑PLGA‑NPs纳米粒子;该IGU‑PLGA‑NPs可用于制备治疗恶性脑胶质瘤的药物制剂。
Description
技术领域
本发明属于纳米工业技术领域,特别涉及一种IGU-PLGA-NPs纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
脑胶质瘤是(GBM)由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤,年发病率约为3-8人/10万人。对于脑胶质瘤的治疗方式现在主要有手术治疗、术后切除放疗以及替莫唑胺(TMZ)化疗。然而由于脑胶质瘤具有极强的侵袭性和迁移性,术后的复发十分常见,术后五年生存率少于10%。虽然许多候选药物在体外可能表现出重要的活性,但有两个主要原因导致临床结果效果不佳:(1)药物进入大脑比较困难,因为不能通过血液-脑屏障(BBB);(2)90%的切除肿瘤在原发部位2cm以内复发,因为存在耐放化疗的胶质瘤干细胞(GSCs)。
目前已有多种途径来提高胶质瘤患者的脑内药物浓度,例如化学修饰药物和前体药物,暂时阻断血脑屏障,动脉内给药,和受体介导的给药。因此,不断开发先进的方法更有效地治疗脑肿瘤仍然是十分必须的。例如,通过新材料和新药物的设计和组合,可提高局部较高浓度的药物,而不会造成任何系统毒性。
许多不同的纳米载体,如脂质体、聚合物纳米粒子和脂质纳米粒子,作为药物和基因传递载体已经被应用于大脑。聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)NPs具有生物相容性、生物可降解性、胞内吞后缓释等优点,价格低廉,并经食品和药物管理局(FDA)批准。
Iguratimod(IGU),中文名称:艾得辛,一种新型抗炎抗风湿性关节炎药物,可防止产生免疫球蛋白和炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1β-IL-6,IL-8,IL-17)。IGU还能抑制IL-8在肝细胞癌发生中的作用。
发明内容
为了在胶质瘤患者的大脑中获得更高浓度的药物,我们制备了PLGA包裹IGU的纳米粒子(IGU-PLGA-NPs);并将其应用于制备治疗恶性脑胶质瘤的药物制剂。
为解决上述问题,本发明的技术方案如下:
一种IGU-PLGA-NPs纳米粒子,是以PLGA包裹IGU的纳米粒子。
优选地,所述纳米粒子为球形,直径为100~200nm。
一种IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,将PLGA溶于二氯甲烷溶液中,加入IGU水溶液,用探头超声对混合物进行超声处理形成乳剂;
步骤2,将步骤1制得的乳剂与聚乙烯醇溶液混合,均匀化,然后加入去离子水,搅拌过夜后,离心,收集纳米粒子;
步骤3,将步骤2制得的纳米粒子用双蒸水洗涤后,用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺;Sigma)和PEI(聚乙烯亚胺)活化,制得IGU-PLGA-NPs纳米粒子。
优选地,所述步骤1中,PLGA、IGU的添加质量比为100000:6。
优选地,所述步骤1中,PLGA溶于二氯甲烷溶液中,PLGA的浓度为20mg/mL。
优选地,所述步骤1中,超声处理的条件为:在20kHz和30%振幅下对混合物进行超声处理形成乳剂。
优选地,所述步骤2中,聚乙烯醇溶液的质量分数为4%,与乳剂的体积比为1:1。
优选地,所述步骤2中,纳米粒子用双蒸馏水洗涤。
优选地,所述步骤3中,活化条件为:20℃孵育2h。
上述IGU-PLGA-NPs纳米粒子在体外对胶质瘤的抗癌作用,并没有引起任何重要器官毒性;IGU-PLGA-NPs治疗小鼠模型后,完全血细胞(CBC)分析无明显变化;IGU-PLGA-NPs抑制胶质瘤的增殖、迁移以及促进细胞凋亡和细胞周期阻滞;IGU-PLGA-NPs对GSCs的生长、肿瘤球的形成以及CD 133的表达均有一定的抑制作用;IGU-PLGA-NPs能穿过BBB,对TMZ耐药胶质瘤细胞具有抗增殖作用。这些结果表明了IGU-PLGA-NPs具有降低脑肿瘤生长的治疗潜力,因此可用于制备治疗恶性脑胶质瘤的药物制剂。
相对于现有技术,本发明的优点如下,
本发明制备的IGU-PLGA-NPs纳米粒子在体外对胶质瘤的抗癌作用,并没有引起任何重要器官毒性;IGU-PLGA-NPs治疗小鼠模型后,完全血细胞(CBC)分析无明显变化;IGU-PLGA-NPs抑制胶质瘤的增殖、迁移以及促进细胞凋亡和细胞周期阻滞;IGU-PLGA-NPs对GSCs的生长、肿瘤球的形成以及CD 133的表达均有一定的抑制作用;IGU-PLGA-NPs能穿过BBB,对TMZ耐药胶质瘤细胞具有抗增殖作用。
本发明的IGU-PLGA-NPs纳米粒子可用于制备治疗恶性脑胶质瘤的药物制剂,提高了药物的释放效率。
附图说明
图1:图1A为Zeta仪测量PLGA的大小分布;图1B为PLGA的Zeta电位图;图1C,D为PLGA和IGU-PLGA-NPs的TEM图;
图2为IGU-PLGA-NPs对脑胶质瘤细胞生长的抑制作用;与对照组(C-E)相比,IGU-PLGA-NPs对U87、U 118和U 251脑胶质瘤细胞的增殖有明显的抑制作用;(***p<0.001,****p<0.0001);
图3为采用Transwell法检测脑胶质瘤细胞迁移情况;与对照组相比,IGU-PLGA-NPs对U87、U118和U251脑胶质瘤细胞的迁移有明显的抑制作用;(***p<0.001,****p<0.0001);
图4为IGU-PLGA-NPs诱导U87和U251细胞凋亡;与对照组相比,IGU-PLGA-NPs对U87、U118和U251脑胶质瘤细胞的凋亡有明显增加;数值表示为平均值±SD;(***p<0.001,****p<0.0001);
图5为IGU和IGU-PLGA-NPs对细胞周期分布的影响;与对照和IGU相比,在治疗48小时后,IGU-PLGA-NPS显著增加了G1期(60%)的细胞数(图5A-D);
图6为IGU-PLGA-NPs抑制GSCs生长图;与对照组相比,治疗组干细胞标记CD 133的表达水平明显降低。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001);
图7为IGU-PLGA-NPs抑制胶质瘤球的形成图;(***p<0.001,****p<0.0001);
图8.为IGU-PLGA-NPs对U251TMZ耐受细胞增殖的影响图;与对照组相比,IGU-PLGA-NPs对U251TMZ耐受细胞的增殖有明显的抑制作用;(**p<0.01);
图9为体内小鼠异种移植模型;IGU-PLGA-NPs明显抑制体内肿瘤的生长(***p<0.001);
图10为IGU-PLGA-NPs对小鼠心脏、肝脏、肾脏、肺和脾脏组织的影响的组织切片图;IGU-PLGA-NPs对上述组织没有明显影响;
图11为IGU-PLGA-NPs对血细胞影响结果图;IGU-PLGA-NPs对血细胞没有明显影响。
具体实施方式
实施例1:
IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法
将100mg PLGA溶于5ml二氯甲烷溶液中,加入30μg/mL IGU水溶液200μL。用探头超声(MicrosonXL 2000,Misonix Inc.,Farmingdale,NY)在20kHz和30%振幅下对混合物进行超声处理形成乳剂。该乳剂与5ml 4%PVA(聚乙烯醇溶液)快速混合,在6000rpm下均匀化30min。然后加入5ml去离子水,在室温下搅拌过夜后,在17000rpm离心15min,收集纳米粒子(NPs)。用双蒸馏水三次洗除NPs中的PVA,滴加EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺;Sigma)和PEI(聚乙烯亚胺)活化,20℃孵育2h,用去离子水洗涤两次,4℃保存,供进一步使用。
IGU-PLGA-NPs的表征
用透射电镜(TEM,JEOL JEM-2100)对PLGA和IGU-PLGA-NPs的形貌进行了表征。用布鲁肯海文仪器公司的PALS Zeta仪测量其大小分布和Zeta电位。
PLGA的平均直径为148±2.5nm(图1A)。Zeta电位分析显示PLGA的负电荷为-2.61Mv(图1B)。TEM图像呈球形,表面光滑,PLGA和IGU-PLGA-NPs平均直径100~200nm(图1C,D)。
IGU-PLGA-NPs对肿瘤抑制作用
1.对脑胶质瘤细胞(U87、U118和U251)增殖的影响
用不同浓度的IGU和IGU-PLGA-NPs处理细胞(图2A,B),用CCK-8法检测了IGU和IGU-PLGA-NPs对胶质瘤细胞生长的影响。4天后,IGU-PLGA-NPs对细胞增殖的抑制作用与IGU和对照组相比有显着性差异(图2C-E)。数据重复三次。此外,我们还用台盼蓝法观察了IGU-PLGA-NPs对胶质瘤细胞生长的影响。U87、U 118和U 251细胞经IGU-PLGA-NPs处理后,存活率明显低于IGU和对照组。
2.对脑胶质瘤细胞(U87、U118和U251)迁移的影响
用Transwell法检测脑胶质瘤细胞迁移情况(图3)。与对照组相比,IGU-PLGA-NPs对U87、U118和U251脑胶质瘤细胞的迁移有明显的抑制作用。(***p<0.001,****p<0.0001)。
3.对脑胶质瘤细胞(U87、U118和U251)凋亡的影响
与对照组相比,IGU-PLGA-NPs诱导的细胞凋亡明显增加(图4)。数值表示为平均值±SD。(***p<0.001,****p<0.0001)。
4.对脑胶质瘤细胞(U87、U118和U251)周期的影响
采用流式细胞术分析了IGU和IGU-PLGA-NPs对细胞周期分布的影响。与对照和IGU相比,在治疗48小时后,IGU-PLGA-NPS显著增加了G1期(60%)的细胞数(图5A-D)。
5.对脑胶质瘤干细胞(GSCs)增殖的影响
IGU-PLGA-NPs处理组GSCs的增殖明显低于IGU处理组和对照组(图6A-C)。此外,与IGU治疗组和对照组相比,IGU-PLGA-NPs治疗后,肿瘤干细胞标记CD 133的表达也明显降低(图6D,E)。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
6.对GSCs肿瘤球形成能力的影响
与IGU和对照组相比,IGU-PLGA-NPs处理组肿瘤球直径明显减小(图7)。(***p<0.001,****p<0.0001)。
7.对TMZ耐药脑胶质瘤细胞株(U251TMZ-R)生长的影响
用CCK-8法检测了IGU和IGU-PLGA-NPs对耐药胶质瘤细胞生长的影响。细胞用IGU-PLGA-NPs处理(图8)。处理96h后,U251-TMZ耐药细胞与对照相比,IGU-PLGA-NPs对细胞生长有明显抑制作用。(**p<0.01)。
8.对体内肿瘤生长的影响
IGU-PLGA-NPs处理的体内肿瘤的生长速度明显低于PBS(图9A)。IGU-PLGA-NPs处理小鼠的肿瘤生长曲线与对照组相比有相对缓慢的趋势。(***p<0.001)。
9.对体内其他组织毒性影响
研究IGU-PLGA-NPs对小鼠心脏、肝脏、肾脏、肺和脾脏组织的影响。如图10,病理组织学分析显示,所有小鼠治疗后均未见明显的脏器损害形成。此外,IGU-PLGA-NPs对治疗组的红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白无明显影响(图11)。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例,并没有用来限定本发明的保护范围,在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法,所述IGU-PLGA-NPs纳米粒子是以PLGA包裹IGU的纳米粒子,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,将PLGA溶于二氯甲烷溶液中,加入IGU水溶液,用探头超声对混合物进行超声处理形成乳剂;
步骤2,将步骤1制得的乳剂与聚乙烯醇溶液混合,均匀化,然后加入去离子水,搅拌后,离心,收集纳米粒子;
步骤3,将步骤2制得的纳米粒子用EDC、NHS和PEI活化,制得IGU-PLGA-NPs纳米粒子;
所述步骤1中,PLGA、IGU的添加质量比为100000:6;
所述步骤1中,PLGA溶于二氯甲烷溶液中,PLGA的浓度为20mg/mL。
2.如权利要求1所述的IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述步骤1中,超声处理的条件为:在20kHz和30%振幅下对混合物进行超声处理形成乳剂。
3.如权利要求1所述的IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述步骤2中,聚乙烯醇溶液的质量分数为4%,与乳剂的体积比为1:1。
4.如权利要求1所述的IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述步骤2中,纳米粒子用双蒸馏水洗涤。
5.如权利要求1所述的IGU-PLGA-NPs纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述步骤3中,活化条件为:20℃孵育2h。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法制备的IGU-PLGA-NPs纳米粒子在制备治疗恶性脑胶质瘤药物制剂中的应用。
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