CN103285411B - 一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，包括：将聚乳酸羟基乙酸共聚物溶液中加入磁性Fe₃O₄纳米颗粒，得油相，将盐酸阿霉素DOX溶于超纯水中，得到水相，然后将油相和水相混合，超声处理，得到油包水W/O乳液；将W/O乳液加入聚乙烯醇PVA溶液中，均质化，得到水包油包水W/O/W乳液；将W/O/W乳液加入异丙醇水溶液中，搅拌1-4h，离心洗涤，分散在水中，冷冻干燥，即得。本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压；本发明制备得到的物质具有良好的US/MRI成像效果以及良好的药物缓释效果，为新型多功能治疗诊断剂的开发提供了借鉴。

Description

一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法

技术领域

本发明属于载药纳米材料的制备领域，特别涉及一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法。

背景技术

治疗诊断技术指结合了医学诊断和治疗的技术，这些医学诊断如超声（US）、磁共振（MR）、X射线断层扫描（CT）成像技术等；治疗手段包括化疗、放疗、热疗等。这一结合对于癌症的特异性和适应性具有重要意义，而这一结合也催生了对新型的治疗诊断剂的研究。虽然目前只有少数治疗诊断剂研制成功，如Ke等(H.Ke,et a1.Angew.Chem.2011,123,3073–3077.)以PLA制备微囊，并在微囊外部制备金纳米壳，得到很好的US成像造影及热疗效果。但对基于化疗的治疗诊断剂还较少见到研究。可以肯定的是，随着化疗和诊断以互补形式作为癌症诊疗在临床上的广泛应用，基于化疗的治疗诊断剂将成为医学成像研究的热点。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由两种单体——乳酸和羟基乙酸聚合而成，是一种可降解的功能高分子，具有良好的生物相容性。PLGA具无毒、良好的成囊和成膜的性能，可被制备成微球用于医学成像、药物输送、基因治疗等医用工程材料领域。双乳化方法可以制备出空心结构的微球，油溶性以及水溶性的药物或功能颗粒可以在乳化的过程中被引入微球结构中。例如Chiang W.L.等(Chiang W.L.;et a1.Small2012,10,1743.)制备了包裹Fe₃O₄纳米颗粒以及抗癌药物DOX的PLGA空心球，利用磁性纳米颗粒可在特定磁场环境下发热的特性，使包裹的药物可以得到重复可控的释放。

检索国内外有关PLGA微球的治疗诊断剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于包裹磁性Fe₃O₄纳米颗粒及抗癌药物盐酸阿霉素的PLGA空心微球的制备与应用方面的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，该双模态成像造影剂具有良好的US/MRI成像效果及药物缓释效果，为新型多功能治疗诊断剂的开发打下了良好的基础。

本发明的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，包括：

（1）将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA（山东济南岱罡公司）溶液中加入油溶性的磁性Fe₃O₄纳米颗粒（中国科学院苏州纳米所），得油相，将抗癌药盐酸阿霉素DOX（北京华奉联博科技有限公司）溶于超纯水中，得到水相，然后将油相和水相混合，超声处理20-30s，得到油包水W/O乳液；其中PLGA与Fe₃O₄的质量比为2000-125：1；油相和水相的体积比为5-10:1；

（2）将上述W/O乳液加入聚乙烯醇PVA（sigma）溶液中，冰水浴状态下均质化，得到水包油包水W/O/W乳液；其中W/O/W乳液三相（从外到内）体积比为25-100：5-10：1；

（3）将上述W/O/W乳液加入异丙醇水溶液中，搅拌1-4h，使有机溶剂（PLGA溶液的溶剂）挥发并使形成的乳液液滴固化成微球，离心洗涤，分散在水中，冷冻干燥，得到基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球PLGA-Fe₃O₄-DOX。

所述步骤（1）中PLGA的分子量Mw为20000-40000。

所述步骤（1）中PLGA溶液的溶剂为CH₂Cl₂，PLGA溶液的浓度为0.0500mg/L；盐酸阿霉素DOX的浓度为20mg/mL。

所述步骤（1）中用细胞破碎仪超声处理20-30s。。

所述步骤（2）中PVA的分子量Mw为20000。

所述步骤（2）中PVA溶液溶剂为水，质量百分浓度为2%-5%。

所述步骤（2）中均质化为均质机剪切，转速为9500rpm，时间为5-10min。

所述步骤（3）中异丙醇溶液体积百分浓度为2%，体积为80-200mL。

所述步骤（3）中离心洗涤为：离心转速为3000-3500rpm，离心3-5min，弃去上清液，离心残留物用超纯水水洗，重复3-5次至离心液澄清无色。

所述步骤（3）中冷冻干燥温度为-50～-80℃，时间为12-20h。

所述步骤（3）中所得的PLGA-Fe₃O₄-DOX用于US/MRI双模态成像及药物缓释的治疗诊断。所述步骤（3）中所制得PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球中Fe₃O₄经电感耦合等离子体发射光谱仪测定含量为0.2%；所制得PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球中DOX经紫外-可见吸收光谱测定含量为0.8%。

本发明中使用均质机对乳液液滴进行高速剪切，使乳液液滴尺寸分布均一。两步乳化过程中均使用冰水浴给乳液降温，以降低液滴的自由运动，也有助于保持液滴的尺寸均一性。

本发明中两步乳化后将乳液转入较大体积的异丙醇溶液中，进一步降低乳液液滴之间的相互碰撞，减小液滴之间的汇聚。异丙醇与所使用的有机溶剂CH₂Cl₂相混溶，与PLGA不相溶，从而可以促进PLGA微球的固化，巧妙地结合了溶剂挥发与相分离两种制备固化微球的技术。

本发明中制备的微球为空心微囊和空心微泡的混合物，抗癌药物盐酸阿霉素的引入，促使了微球进一步形成微囊，微囊化更有助于超声成像效果的增强。

使用SEM（扫描电子显微镜）、CLSM（激光共聚焦显微镜）、动态光散射仪、MTT细胞毒性实验、US成像及MRI成像表征本发明获得的具有双模态造影功能、药物缓释功能的PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球治疗诊断剂的结果分别如下：

（1）动态光散射仪粒径、电势测试结果

动态光散射仪测试结果显示PLGA微球粒径较均匀，直径为1947nm，表面电势为-19mv。参见说明书附图2。

（2）SEM测试结果

SEM测试结果显示了PLGA微球的外形、尺寸及尺寸分布，参见说明书附图3。PLGA微球为球形结构，尺寸分布较窄，具有良好的单分散性。包裹了磁性Fe₃O₄纳米颗粒的微球的平均直径尺寸在0.8-1μm之间，可以清晰地看到微球的囊状结构。

（3）CLSM测试结果

CLSM测试结果进一步显示了PLGA微球的空心结构，且呈现球状与囊状两种结构，参见说明书附图4。经油溶性染色剂细胞膜绿色荧光探针染色后，微球壳层PLGA呈绿色荧光，显示微球为球形空心结构；DOX为红色荧光，红绿荧光叠加成黄色荧光，显示DOX均匀吸附在壳层PLGA上。

（4）US成像测试结果

取超纯水、未包裹DOX的PLGA-Fe₃O₄空心微球和PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球做体外超声测试，两种微球材料的浓度均为5mg/mL。与水相比两种微球材料均具有良好的超声成像效果，参见说明书附图5a。其中包裹了DOX的微球超声造影效果好于未包裹DOX的微球，超声造影图灰度值也更高，参见说明书附图5b。

（5）MR成像体外测试结果

取PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球配制铁浓度为0.0375，0.075，0.15，0.3，0.6mM的溶液各1mL。用医用3T MR测试仪测试各个样品的T2弛豫时间并得出1/T₂的值与铁浓度的线性关系。测试结果显示材料具备良好的MR造影效果，参见附图6a。材料的各个浓度样品的T2弛豫时间倒数1/T2的值与铁浓度的线性关系良好，材料的纵向驰豫率（r2）为33.26mM^-1s^-1，参见附图6b。

（6）MR成像体内测试结果

取PLGA-Fe₃O₄-DOX微球30mg溶解在0.3mL的生理盐水中配制铁浓度为0.78mM的溶液，尾静脉注射至小鼠体内。用医用3T MR测试仪测试小鼠MRI成像。时间节点分别为注射前，及注射后0.5，2，4，12h。参见说明书附图7，注射后小鼠肝脏MR成像效果随时间延长而进一步显著增强，在4h处达到最好的成像效果，而在12h后肝脏MR信号明显变弱，成像效果变差，说明材料已经开始被小鼠代谢。以上结果说明Fe₃O₄纳米颗粒的存在赋予了小鼠体内肝脏MR造影效果。

（7）体外药物释放测试结果

以pH7.4的PBS缓冲液和pH5.6的乙酸-乙酸钠缓冲液做为药物释放缓冲液测得PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球的体外DOX释放。测试结果表明制备的材料的具有良好的药物缓释效果，72小时后药物达到58%的释放率，且酸性环境下释放稍快。参见说明书附图8。

（8）MTT测试结果

PLGA空心微球的体外MTT毒性测试结果表明制备的材料具有较高的细胞毒性，包裹的药物DOX能有效杀死KB细胞，药效与自由DOX相近，参见说明书附图9。而不含DOX的PLGA-Fe₃O₄微球则和PBS对照组相近，不具有细胞毒性。

本发明方法制备的包裹磁性Fe₃O₄纳米颗粒的PLGA空心微球，其微球尺寸分布较窄，具有良好的分散性。体外超声成像测试结果表明，超声灰度值较好，灰度值随磁性Fe₃O₄纳米颗粒含量的增加而增强。磁共振成像测试结果表明，磁性Fe₃O₄纳米颗粒显著地缩短T₂弛豫时间，显示信号减弱，表明其具有良好的MR成像性能。

以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为基材，制备了功能化的PLGA微球US/MRI双模态成像载药造影剂。

本发明涉及了三个基本原理：

（1）双乳化法制备的微球固化前为W/O/W乳滴结构，最内层水相经冷冻干燥后全部挥发使微球为空心结构，是制备超声造影剂的基础，US测试结果表明包裹了磁性Fe₃O₄纳米颗粒的PLGA空心微球可以作为一种充满希望的US造影剂。

（2）双乳化法可引入油溶性的功能纳米颗粒，使制备的微球具有多功能。油溶性磁性Fe₃O₄纳米颗粒可分散在油相溶剂中而进入微球壳层。磁性Fe₃O₄纳米颗粒的引入赋予微球MR成像效果。MR测试结果表明，该材料有较高的T₂弛豫率及较好的成像对比度。说明包裹了磁性Fe₃O₄纳米颗粒的PLGA微球可以作为一种充满希望的T₂造影剂。

（3）双乳化法可引入水溶性的药物分子，使制备的微球具有多功能。水溶性药物可在第一步乳化过程中放入乳滴从而被PLGA吸附在微球壳层，从而使制备的微球具有药物输送的功能。

制备US/MR双模态成像及载药治疗诊断剂的关键要素就是找到一个合适的载体平台以负载不同的造影元素和药物分子，形成多功能复合体。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由两种单体——乳酸和羟基乙酸聚合而成，是一种可降解的功能高分子，具无毒、良好的成囊和成膜的性能，具有良好的生物相容性。可被制备成微球用于医学成像、药物输送、基因治疗等医用工程材料领域。双乳化方法可以制备出空心结构的微球，油溶性以及水溶性的药物或功能颗粒可以在乳化的过程中加入到微球结构中。油溶性磁性Fe₃O₄纳米颗粒可以在乳化过程中加入到乳滴体系中，最终包裹在空心球的壳层，使微球具有MR成像功能。水溶性的盐酸阿霉素DOX具有较高的抗肿瘤活性，可以在乳化过程中加入到乳滴体系中，微球固化时被吸附在PLGA壳层中，使药物得到输送，降低其对正常细胞的毒害作用。

有益效果

（1）本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球的制备，用于US/MRI双模态成像和癌症的化学治疗，具有很好的实用价值；

（2）本发明制备得到的功能化的基于PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的US/MRI双模态成像治疗诊断剂具有良好的US/MRI成像效果，为新型多功能造影剂的开发打下了良好的基础；

（3）本发明制备得到的功能化的基于PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的US/MRI双模态成像治疗诊断剂具有良好的DOX药物输送及缓释效果以及良好的抗肿瘤活性，为新型多功能治疗诊断剂的开发打下了良好的基础。

附图说明

图1为本发明制备方法简图；

图2为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球粒径（b）及电势图（a）；

图3为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的SEM图片和粒径分布直方图(a)及PLGA-Fe₃O₄微球的SEM图片和粒径分布直方图(b)；

图4为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球经Dio染色的CLMS图片；

图5为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球、不含DOX的PLGA-Fe₃O₄微球以及超纯水的体外超声成像图(a)及图像灰度值图(b)；

图6为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的T₂-权重自旋回波伪彩图(a)和T₂弛豫时间的倒数随铁浓度变化的线性关系图(b)；

图7为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球小鼠体内肝脏MR成像图（时间节点为注射前（0h），以及尾静脉注射后0.5，2，4和12h）；

图8为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的体外药物释放图；药物释放所用缓冲液分别为pH7.4的PBS缓冲液和pH5.6的乙酸盐缓冲液；

图9为本发明制备的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球、不含DOX的PLGA-Fe₃O₄微球以及药物DOX的MTT细胞活力图；KB细胞贴壁后加入不同浓度的上述材料，培养48h后MTT方法检测的细胞存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）用2mL CH₂Cl₂溶解100mg PLGA、0.4mg磁性Fe₃O₄纳米颗粒；用200μL超纯水溶解4mg DOX，将有机相和水相两相混合，冰水浴状态下用细胞破碎仪超声处理30s，形成W/O乳液；

（2）将步骤1的W/O乳液转入10mL5%PVA水溶液中，冰水浴状态下用均质机剪切(9500rpm，5min)使液滴形成尺寸较为均一的W/O/W乳液；

（3）将步骤2的W/O/W乳液倾倒入80mL2%异丙醇水溶液中磁力搅拌1h后，离心（3500rpm，3min），弃去上清液，离心残留物用90mL超纯水水洗。重复上述离心水洗操作三次以上至离心液澄清无色，离心后将离心残留物重新分散于30mL超纯水中，-80°C冰箱冷冻12h后，置于冷冻干燥机冷冻干燥处理，即得功能化的壳层包裹磁性Fe₃O₄纳米颗粒、内层为DOX的PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球治疗诊断剂。

合成过程中对离心液用紫外-可见分光光度计进行表征。由481nm处DOX特征吸收峰画出标准曲线，计算得离心液DOX含量为3.6mg，DOX包裹量为0.4mg，PLGA微球中DOX的百分含量为0.4%。SEM图片（附图3a）表明PLGA微球颗粒直径约1μm，尺寸分布较窄，具有良好的单分散性。进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）测定产物中Fe的含量，结果表明平均PLGA微球中磁性Fe₃O₄纳米颗粒的百分含量为0.2%，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球多功能治疗诊断剂。

实施例2

以体外US测试的灰度值来检验实施例1和对比例1合成的两种材料PLGA-Fe₃O₄-DOX微球与PLGA-Fe₃O₄微球的US成像效果。取实例1样品10mg溶解在2mL的PBS缓冲液中配制微球浓度为5mg/mL的溶液，将其装入2mL离心管中。取对比例1样品10mg溶解在2mL的PBS缓冲液中配制微球浓度为5mg/mL的溶液，将其装入2mL离心管中。用医用超声造影仪测试各个样品的超声成像图，用ImageJ软件处理超声成像图得灰度值。附图5(a)为样品的US图片（其中1为PLGA-Fe₃O₄-DOX微球和2为PLGA-Fe₃O₄微球），附图5(b)为样品1，2灰度值数据图。从图5(a)、(b)中可以看出与超纯水相比，相同浓度的PLGA-Fe₃O₄-DOX微球与PLGA-Fe₃O₄微球均具有良好的US成像增强效果，且PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的US图片亮度高，灰度更值大，说明在DOX的存在可能增加微球中空气的体积，从而增强材料的US造影效果。

实施例3

以体外MR测试的T₂值来检验实施例1合成的材料PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的MRI成像效果。取实例1样品46.3mg溶解在2mL的PBS缓冲液中配制铁浓度为0.6mM的溶液，再分别稀释到铁浓度为0.0375，0.075，0.15，0.3，0.6mM的溶液各1mL。用医用3T MR测试仪测试各个样品的T₂弛豫时间并得出1/T₂的值与铁浓度的线性关系。附图6（a）为样品的T₂-权重自旋回波黑白图，附图6（b）为材料的T₂弛豫时间的倒数随铁浓度变化的线性关系图。图6（b）中材料的各个浓度样品的T₂弛豫时间1/T₂的值与铁浓度的线性关系良好，材料的纵向驰豫率（r₂）为33.26mM^-1s^-1，说明Fe₃O₄纳米颗粒的存在增强了材料的MR造影效果。

实施例4

以小鼠体内MR成像测试来检验实施例1合成的材料PLGA-Fe₃O₄-DOX微球的体内MR成像效果。取实例1样品30mg溶解在0.3mL的生理盐水中配制铁浓度为0.78mM的溶液，尾静脉注射至小鼠体内。用医用3T MR测试仪测试小鼠MRI成像。时间节点分别为注射前，及注射后0.5，2，4，12h。附图7为各个时间节点的小鼠肝脏MR成像结果，注射后MR成像效果随时间延长而进一步显著增强，在4h处达到最好的成像效果，而在12h后成像效果变差说明材料已经开始被小鼠代谢。以上结果说明Fe₃O₄纳米颗粒的存在赋予了的小鼠体内肝脏MR造影功能。

实施例5

以pH7.4的PBS缓冲液和pH5.6的乙酸盐缓冲液做为药物释放缓冲液测试PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球的体外DOX释放。取10mg PLGA-Fe₃O₄-DOX空心微球用3mL缓冲液分散后转入透析袋（Mw截留为10000），将透析袋装入25mL容量的玻璃瓶内，并在玻璃瓶内加入7mL相同缓冲液使透析袋内外缓冲液总体积为10mL。将上述玻璃瓶放入37℃恒温摇床，不同时间节点（0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，48，72h）取出3mL缓冲液并补充相同体积相同种类的缓冲液，每个材料浓度做三组平行样检测标准偏差。最终将取出的缓冲液在紫外-可见分光光度计下481nm处测试液体吸光度，并进一步计算缓冲液中药物含量及各时间点药物释放率。结果表明制备的材料具有良好的药物缓释效果，72小时后药物达到58%的释放率，且酸性环境下释放稍快。参见说明书附图8。

实施例6

通过MTT法检测细胞活力来研究PLGA-Fe₃O₄-DOX微球复合物的抗肿瘤活性，用PBS溶液做对照。取人类上皮癌细胞（KB细胞）种于96孔板，种板密度为每孔5×10³个KB细胞。培养过夜后，将PLGA-Fe₃O₄微球、PLGA-Fe₃O₄-DOX微球(微球浓度为6.75,12.5,25,50,100mg/L，DOX浓度为0.05,0.10,0.20,0.40,0.80mg/L)与相同浓度的纯药DOX分别与KB细胞共培养，48h后，将每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL）后再培养4h，然后倒出培养基，加入200μL DMSO，放入摇床慢速摇动15min，用酶标仪在490nm处检测吸光度，每个材料浓度做三组平行样检测标准偏差。

PLGA-Fe₃O₄-DOX微球体外MTT法测试结果显示，随着材料PLGA-Fe₃O₄-DOX微球和纯药DOX浓度的增加，细胞存活率下降，表明制备的材料具有较高的抗肿瘤活性，包裹的药物DOX能有效杀死KB细胞，药效与自由DOX相近；而不含DOX的PLGA-Fe3O4微球则和PBS对照组相近，不具有细胞毒性。参见说明书附图9。

对比例1

（1）用2mL CH₂Cl₂溶解100mg PLGA、0.4mg磁性Fe₃O₄纳米颗粒，将有机相和200μL水相两相混合，冰水浴状态下用细胞破碎仪超声处理30s，形成W/O乳液；

（2）将步骤1的W/O乳液转入10mL5%PVA水溶液中，冰水浴状态下用均质机剪切(9500rpm，5min)使液滴形成尺寸较为均一的W/O/W乳液；

（3）将步骤2的W/O/W乳液倾倒入80mL2%异丙醇水溶液中磁力搅拌1.5h后，离心（3500rpm，3min），弃去上清液，离心残留物用90mL超纯水水洗。重复上述离心水洗操作三次以上至离心液澄清无色，离心后将离心残留物重新分散于30mL超纯水中，-80°C冰箱冷冻12h后至置于冷冻干燥机冷冻干燥处理，即得功能化的壳层包裹磁性Fe₃O₄纳米颗粒的PLGA-Fe₃O₄聚合物空心微球。

SEM图片（附图3b）表明PLGA-Fe₃O₄微球颗粒直径约0.83μm，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）测定产物中Fe的含量，结果表明平均PLGA微球中磁性Fe₃O₄纳米颗粒的百分含量为0.2%，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的PLGA-Fe₃O₄微球。

Claims (8)

1.一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，包括： 

(1)将聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA溶液中加入油溶性的磁性Fe₃O₄纳米颗粒，得油相，将盐酸阿霉素DOX溶于超纯水中，得到水相，然后将油相和水相混合，将该油水混合物放于冰水浴状态下超声处理，得到油包水W/O乳液；其中PLGA与Fe₃O₄的质量比为2000-125：1；油相和水相的体积比为5-10:1；其中PLGA的分子量Mw为20000-40000； 

(2)将上述W/O乳液加入聚乙烯醇PVA溶液中，冰水浴状态下均质化，得到水包油包水W/O/W乳液；其中W/O/W乳液三相体积比为25-100：5-10：1；其中PVA的分子量Mw为20000，PVA溶液溶剂为水，质量百分浓度为2％-5％； 

(3)将上述W/O/W乳液加入异丙醇水溶液中，搅拌1-4h，离心洗涤，分散在水中，冷冻干燥，得到基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球PLGA-Fe₃O₄-DOX。 

2.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PLGA溶液的溶剂为CH₂Cl₂，PLGA溶液的浓度为0.0500mg/L；盐酸阿霉素DOX的浓度为20mg/mL。 

3.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中超声处理为细胞破碎仪超声处理20-30s。 

4.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中均质化为均质机剪切，转速为9500rpm，时间为5-10min。 

5.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中异丙醇溶液体积百分浓度为2％，体积为80-200mL。 

6.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中离心洗涤为：离心转速为3000-3500rpm，离心3-5min，弃去上清液，离心残留物用超纯水水洗，重复3-5次至离心液澄清无色。 

7.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中冷冻干燥温度为-50～-80℃，时间为12-20h。 

8.根据权利要求1所述的一种基于聚乳酸羟基乙酸共聚物的磁性载药空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所得的PLGA-Fe₃O₄-DOX用于US/MRI双模态成像及药物缓释的治疗诊断。