CN103408660A - 一种抗鼠疫杆菌f1抗原的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体，以及所述抗体在制备鼠疫治疗药物中的应用。本发明公开的抗体具有特异的抗原结合性、低免疫原性以及良好的动物保护功能。

Description

一种抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗鼠疫单抗的基因和基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备鼠疫的新型治疗药物中的应用。

背景技术

鼠疫是一种自然疫源性疾病，可独立在动物中流行，全世界有各种类型的动物自然疫源地，难于彻底消除。我国仍有11个疫源地省区人间鼠疫时有发生，2010年秋在我国西藏爆发了人间鼠疫。另外，鼠疫菌被列为重要的生物战剂和生物恐怖剂，一直受到高度重视。更为重要的是多药抗性鼠疫菌的发现，使得鼠疫的治疗更是雪上加霜。《中华人民共和国传染病防治法》规定鼠疫属于甲类传染病，执行最严格的防控。美国疾病预防控制中心则将鼠疫耶尔森菌归类为易传染、高致死率、可引起公众恐慌和社会动荡，需要进行特别公共卫生准备的A类微生物病原体。近年来随着国际反恐斗争的需要，对鼠疫的防治研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。

目前鼠疫的治疗依靠抗菌素，多种抗生素对鼠疫有效，链霉素被认为是治疗鼠疫最有效的传统药物之一。但是基于新的多药抗性鼠疫菌的出现，1970年世界卫生组织鼠疫专业委员会建议更多的努力研究新的替换药物。因此研制抗生素之外的鼠疫治疗药物迫在眉睫。中和性单克隆抗体被认为是具有应用前景的特异性治疗药物，因为其靶标和作用机制明确，研制相对容易，是目前较为切实可行的办法。研究显示，F1（Fraction1，F1）抗原是位于鼠疫菌体表面荚膜物质，由100kbp的pFra质粒编码，是鼠疫菌的特异性抗原之一。鼠疫感染的免疫保护机制中，F1抗血清在动物体内显示了明显的保护效果，因此体液免疫发挥了非常关键的作用。此提示筛选F1抗原单抗有可能获得具有保护效果的中和性单抗，并用于鼠疫的特异性治疗。

2010年Xiao等报道从非免疫人源噬菌体文库中筛选到1个抗F1Fab和2个抗LcrV的Fab，当其转换成全分子人源抗体后，F1单抗能保护6只小鼠中1只存活，而2株抗LcrV单抗单独使用不具有保护效果，3株单抗协同使用能保护6只小鼠中的5只存活（Xiaodong Xiao etal,PLOS ONE,2010,5(10):1-12.）。此方法的优点是筛选到的单抗序列全人源，体内的免疫原性低，不足之处是因为没有经过初次免疫和加强免疫，获得的单抗亲和力和特异性差，保护效果难获满意，与文献报道的结果相互佐证。另外本文献中的对照单抗F1m在小鼠体内显示了100%的保护活性，其针对的靶抗原是鼠疫假膜抗原F1，但其序列并没有公布，也没有进一步人源化的相关报道。目前随着单抗技术的成熟和发展，制备特异性抗原的单抗并不困难，但筛选并获得具有良好中和活性的单抗并非易事，要求不仅具有好的结合活性，而且要求获得的单抗特异性的结合到抗原特定的表位，才能起到保护效果。2005年尹家祥等报道获得3株抗F1抗原的单克隆抗体，但其保护效果并没提及（尹家祥等，中国地方病学杂志：2005，24(5)）。就现有技术而言，目前还缺乏既具有人体内免疫原性低的优点，又表现出对目标抗原F1具有较高结合活性和良好保护效果的鼠疫抗体。文献报道鼠疫假膜抗原F1和低钙反应蛋白LcrV是重要的保护性抗原，免疫动物可以保护动物在鼠疫菌毒株攻毒时存活，体液免疫在免疫保护中发挥了重要作用（Xiaodong Xiao etal,PLOS ONE,2010,5(10):1-12.）。本发明人制备了针对保护性抗原重组F1和重组LcrV的单抗，从制备的10株单抗中筛选到1株小鼠体内具保护活性的鼠单抗，希望通过人源化改造，降低免疫原性，活性与鼠源单抗一致的保护效果。

因此，本发明的目的就是提供一种具有更高的亲合力和良好保护效果，人源化程度更高，免疫原性较低能够在人体内应用的抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体。

发明内容

本发明通过单克隆抗体技术筛选到了对鼠疫杆菌F1抗原具有高度亲合力的单克隆抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸和核苷酸序列，并对所述抗体的重链和轻链恒定区以及可变区改造，最终获得了具有特异的抗原结合性及良好的动物保护功能的单克隆抗体。

本发明首先公开了一种抗鼠疫杆菌F1抗原的嵌合单克隆抗体，全分子嵌合抗体有嵌合重链和嵌合轻链构成，嵌合重链由鼠源重链可变区和人IgG1的恒定区构成；嵌合轻链由鼠源轻链可变区和人Kappa的恒定区构成。所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO2第45-54、69-83、118-132位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO6第44-60、76-82、115-123位氨基酸序列所示。

在一个优选的技术方案中，所述单克隆抗体重链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID NO2第20-44、55-68、84-117、133-143位氨基酸序列所示；重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示；轻链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID NO6第21-43、61-75、83-114、124-133位氨基酸序列所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO8所示。

在另一个优选的技术方案中，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO6所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。

根据本发明的另一个方面，本发明公开了一种含有上述编码单克隆抗体重链或轻链的核苷酸编码序列的表达载体，所述重链表达载体为pcDE-C_H，所述轻链表达载体为pcDK-C_K。

本发明还公开了一种含有上述表达载体的宿主细胞，优选地，所述细胞为CHO-S细胞。

根据本发明的再一个方面，本发明公开了所述抗体在制备鼠疫新型治疗药物中的应用。本发明所述抗体可以制备为药物制剂，所述制剂含有上述的单克隆抗体，以及可药用的载体。优选地，所述药物制剂为注射制剂。

本发明提供的单克隆抗体由于在重链和轻链可变区具有独特的CDR1-3区序列，使所述抗体对鼠疫杆菌具有特异的识别和结合能力。在ELISA检测F1与单抗的结合活性的实验中，系列稀释的单抗256,128,64,32,16,8,4,2ng/ml与包被的重组F1反应,呈现剂量-效应反应,灵敏度为4-8ng/ml,与重组炭疽保护性抗原PA,重组鼠疫V抗原,重组破伤风抗原等没有反应。显示本发明提供的抗鼠疫F1抗原的单克隆抗体具有高度特异的结合活性。

本发明提供的单克隆抗体还显示了在制备鼠疫治疗药物中的用途。在小鼠攻毒模型上抗体的保护效果评价实验中，本发明所提供的鼠源单抗存活达到83%(5/6)，嵌合单抗的存活达到80%（4/5）。该实验显示了本发明提供的单克隆抗体具有良好的动物保护功能，可以应用于制备鼠疫治疗药物。

本发明提供的嵌合抗体较鼠源单抗具有更低的免疫原性，选择在恒河猴体内进行评价，单次静脉给药，鼠源单抗2周，4周，6周的抗体滴度分别为1:80，1:320和1:160，而嵌合单抗在3个时间点没有检测到特异性抗体。

附图说明

图1A嵌合抗体重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）基因的克隆

图1B人IgG1重链恒定区基因（C_H）和人Kappa轻链恒定区基因（C_K）的克隆

图1C嵌合抗体重链基因（H）和轻链基因（L）的克隆

图2pMD-H和pMD-L的酶切鉴定结果

图3pcDE-H的构建流程

图4pcDK-L的构建流程

图5pcDE-H和pcDK-L的酶切鉴定结果

图6高表达细胞克隆的Dot blot检测

图7纯化的嵌合抗体的SDS-PAGE检测

图8纯化的嵌合抗体的western blot检测

图9纯化的嵌合抗体的ELISA检测

图10纯化的嵌合抗体和鼠单抗在小鼠体内对鼠疫毒株的保护试验

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1嵌合抗体的制备

1.鼠源单抗基因的克隆

1.1鼠源单抗的制备

以重组鼠疫荚膜抗原F1为免疫原，采用常规单克隆抗体制备方法获得的1株高亲和力、高特异性的鼠源性抗F1单抗F2H5杂交瘤细胞株，分泌的抗体分子亚型为IgG1亚类，轻链为Kappa亚型。

1.2单抗F2H5轻重链可变区基因的克隆

单抗由可变区和恒定区构成，因为鼠单抗的可变区基因变异大，而恒定区的基因序列非常保守，因此采用5′-RACE方法进行克隆，其基本原理是在未知序列的5′端添加引物序列，与3′端的保守序列进行PCR扩增。获得的鼠源单抗基因可用于构建表达载体，然后转染哺乳动物细胞，获得稳定表达的细胞株，最终获得表达产物。

操作步骤如下包括A：总RNA的提取；B：RNA的去磷酸化；C：去帽子反应；D：5ˊ-RACE适配子连接；E：反转录反应；F：外引物PCR反应；G：内引物反应；H：琼脂糖凝胶电泳；I：切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定；J：BLAST检索分析序列的正确。具体参考说明书（TaKaRa，D315）。简单描述如下：

A总RNA的提取：取处于对数生长期的F2H5杂交瘤细胞（5×10⁶），采用Trizol一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1%琼脂糖凝胶电泳检测。

B RNA的去磷酸化：使用CIAP（TaKaRa，D315），反应体系50ul，包括总RNA2ul（1ug/ul），NRAse抑制剂1ul（40U/UL），10×缓冲液5ul，CIAP0.6ul（16U/ul），50℃反应1小时。

C去帽子反应：CIAP处理过的RNA7ul，NRAse抑制剂1ul（40U/ul），10×缓冲液1ul，TAP（TaKaRa，D315）1ul，（0.5U/ul），37℃反应1小时。

D5ˊ-RACE适配子连接:连接体系40ul，依次加入CIAP/TAP处理过的RNA5ul，5ˊRACE适配子（15uM）1ul，NRAse的水4ul；65℃反应5分钟后，冰上放置2分钟，然后依次加入NRAse抑制剂1ul（40U/UL），5×连接缓冲液8ul，40%的PEG600020ul，T4RNA连接酶1ul，16℃反应1小时。

E反转录反应：反应体系包括连接后的RNA为6ul，随机引物0.5ul，5×缓冲液2ul，dNTP1ul，NRAse抑制剂0.25ul（40U/uL）,MMLV0.25ul(200U/ul)。混匀，30℃10min，50℃60min，5℃5min。反应产物置于-20℃备用。

F外引物PCR反应：反应体系为Ex Taq聚合酶（5U/μL）0.25μL；10×ExTaq Buffer5μL；dNTP Mixture（各2.5mM）4μL；模板cDNA2.5μL；5′RACE外引物2ul(引物序列5′-CATGGCTACATG CTGACAGCCTA-3′)，特异性外引物2ul(重链引物序列5′-TTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTC-3′；轻链引物序列：5-TTAACACTCATTTCGGTTGAAGCTC-3′)，加灭菌蒸馏水至50μL，混匀，瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件：94℃预变性3分钟，接着94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

G内引物PCR反应：反应体系为Ex Taq聚合酶（5U/μL）0.25μL；10×ExTaq Buffer5μL；dNTP Mixture（各2.5mM）4μL；模板为外引物反应液2.5μL；5′RACE内引物2ul(引物序列5′-CGCGGATCCACAGC CTACTGATGATCAGTCGATG-3′)，特异性内引物2ul(引物序列同外引物)，加灭菌蒸馏水至50μL，混匀，瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件：94℃预变性3分钟，接着94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min。，引物使用内引物外，其余反应液体同外引物PCR反应。

H琼脂糖凝胶电泳：扩增产物H和L经琼脂糖凝胶（1%）电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒（BIO BASIC INC）回收纯化后，凝胶电泳鉴定。

I切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定：将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体lul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水lul，连接缓冲液5u1，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-mouse-V_H和pMD-mouse-V_L。

测序后，对获得的基因序列用Vector NTI软件进行分析，鼠源单抗F2H5重链可变区含有429碱基(SEQ ID NO1)。可变区包括4个框架区(Fragment region，FR)和3个CDR(Complementary determinant region,CDR)，其中1-57位碱基编码信号肽，58-132位碱基编码FR1，133-162碱基编码CDR1；163-204碱基编码FR2，205-249碱基编码CDR2；250-351碱基编码FR3，352-396碱基编碱基码CDR3；397-429碱基编码FR4。

鼠源单抗轻链可变区含有399个碱基(SEQ ID NO5)，其中1-60位碱基编码信号肽，61-129位碱基编码FR1，130-180碱基编码CDR1；181-225位碱基编码FR2；226-246位碱基编码CDR2；247-342碱基编码FR3；343-369碱基编码CDR3；370-399碱基编码FR4。

2.嵌合抗体基因的克隆

鼠源抗体相对于人体，属于异源蛋白应用于人体具有明显的抗宿主抗体反应，因此常采用人源化改造的策略降低免疫原性，简单方便的方法是进行恒定区的人源化，用人的恒定区替换鼠的恒定区，即构建嵌合抗体。

2.1含有恒定区的表达载体的构建

2.1.1含有重链恒定区（IgG1）的表达载体的构建

2.1.1.1构建策略以pcDNA3.1(+)为模板，重链恒定区前两个氨基酸AS的编码序列是GCTAGC，正好是Nhe I的酶切位点。结合分析pcDNA3.1(+)的酶切位点，依次含有Nhe I，Eco RI和Not I。我们希望改造成依次含有Eco RI，Nhe I和Not I位点。首先对pcDNA3.1(+)采用Eco RI单酶切，然后用末端平滑试剂盒进行末端平滑化，通过自连接可以去除EcoRI的酶切位点。

然后在恒定区的5端加入Eco RI的酶切位点，在恒定区的3端加入Not I的酶切位点。

原来人IgG1恒定区中氨基酸序列中AS的编码序列更改为GCTAGC（仍然是编码AS，是Nhe I的酶切位点）。

采用优化的密码子可以提高蛋白的表达，首先采用软件对人IgG1重链恒定区（GenBank登录号:Z17370），按照鼠密码子偏好进行优化，优化后的基因序列委托博迈德进行全基因合成，并克隆到T载体上（命名为pMD-C_H）。

2.1.1.2多克隆位点中Eco RI位点的去除

取1ul pcDNA3.1(+)质粒，Eco RI1ul，Eco RI缓冲液2ul，加水16ul，反应体积20ul，37℃2小时。用BBI胶回收试剂盒回收。回收后的产物用快速末端平滑化试剂盒进行酶切后末端的平滑化（NEB E1201S）。平滑化后的产物用用BBI胶回收试剂盒回收。回收后的产物进行自连接，包括1ul连接酶缓冲液，1ul T4DNA连接酶，8ul回收后产物，16℃连接2小时。取5ul连接产物转化DH5a感受态后，在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上过夜培养，取生长的克隆直接摇菌提取质粒进行酶切鉴定，不能被Eco RI酶切的质粒进行DNA序列测定进一步确认。获得质粒命名为pcDNA3.1(+)-D-E。

2.1.1.3将重链恒定区亚克隆到pcDNA3.1(+)-D-E的多克隆位点中

使用Eco RI和Not I各1ul，pcDNA3.1(+)-D-E8ul或pMD-C_H8ul，缓冲液2ul，总体积20ul，37℃反应2小时，回收后连接。使用BBI公司的回收试剂盒回收，回收后的产物直接连接。取酶切后的载体pcDNA3.1(+)-D-E和C_H片断各4ul，连接酶1ul，缓冲液1ul，总体积10ul。连接2小时后取5ul连接产物转化DH5a感受态后，在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上过夜培养，取生长的克隆直接摇菌提取质粒进行酶切鉴定，能被Eco RI，Nhe I，Not I酶切的质粒进行DNA序列测定进一步确认。获得的载体命名为pcD-E-C_H。

2.1.2含有轻链恒定区（human kappa）的表达载体的构建

2.1.2.1构建策略以pcDNA3.1(+)为模板进行构建，分析轻链恒定区前6个氨基酸RTVAAP的编码序列（CGG ACC GTG GCG GCG CCC）中含有GGCGCC序列，正好是Kas I的酶切位点。结合pcDNA3.1(+)的核苷酸序列分析在Neo基因的编码序列中存在Kas I的酶切位点，可以通过定点突变不改变氨基酸，改变编码序列的方法实现。

然后在恒定区的5端加入Eco RI的酶切位点，在恒定区的3端加入Not I的酶切位点。

采用优化的密码子可以提高蛋白的表达，首先采用软件对人kappa亚型恒定区（GenBank登录号:GI:341915149），按照鼠密码子偏好进行优化，优化后的基因序列委托博迈德进行全基因合成，并克隆到T载体上（命名为pMD-C_K）。

2.1.2.2Kas I酶切位点的定点突变

以pcDNA3.1(+)质粒为模板，采用反向PCR的方法，扩增获得全长的突变后产物，通过自连，转化获得抗性克隆，酶切和测序鉴定获得的产物的正确。使用的引物为：Upper primer：5′-GGtCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGAC-3′；Reverse primer:5′-CTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATC-3′。在Neo基因的上游设立测序引物序列为：5′-GATTCTTCTGACACAACAGTCTCGA-3′。

PCR反应体系：50μl反应体系中含有：10×buffer5ul；dNTP(2mM)4ul；Pyrobest酶0.25ul；正向和反向引物各0.5ul；取0.1ul pcDNA3.1(+)质粒作为模板；用纯水补足到50μl。PCR反应参数：预变性94℃5min；94℃60s，58℃60s，72℃5min20s；25循环。最后72℃5min。

PCR产物回收纯化：PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶并用BBI公司的回收试剂盒回收。

连接：取回收后的产物8ul，T4DNA连接酶1ul，T4DNA连接酶缓冲液1ul，16℃连接2小时。转化DH5a感受态后，在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上过夜培养，取生长的克隆直接摇菌提取质粒进行酶切鉴定，不能被Kas I酶切的质粒进行DNA序列测定进一步确认。获得质粒命名为pcDNA3.1(+)-D-K。

2.1.2.3将轻链恒定区亚克隆到pcDNA3.1(+)-D-K的多克隆位点中

使用Eco RI和Not I各1ul，pcDNA3.1(+)-D-K和pMD-C_K各16ul，加入2ul缓冲液，总体积20ul反应2小时，回收后待连接。使用BBI公司的回收试剂盒回收，回收后的产物直接连接。取酶切后的载体pcDNA3.1(+)-D-K和C_K片断各4ul，连接酶1ul，缓冲液1ul，总体积10ul。连接2小时后取5ul连接产物转化DH5a感受态后，在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上过夜培养，取生长的克隆直接摇菌提取质粒进行酶切鉴定，能被Eco RI，Kas I，Not I酶切的质粒进行DNA序列测定进一步确认。获得的载体命名为pcDK-C_k。

3.人-鼠嵌合抗体基因表达质粒的构建

3.1重链表达质粒的构建

用Eco RI和Nhe I（NEB公司）双酶切pMD-V_H，用胶回收试剂盒（中国，BBI公司）回收V_H片段（长度约0.4kb）连接到用Eco RI和Nhe I双酶切的pcDE-C_H上，转化大肠杆菌DH5α感受态，在100μg/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进行PCR检测（PCR条件同实施例1中的步骤（3）），PCR产物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试剂盒（中国，OMEGA公司）提取质粒，对提取的质粒进行双酶切（Eco RI/Not I）鉴定。表达载体构建流程见图3。

3.2轻链表达质粒的构建

用Eco RI和Kas I（NEB公司）酶切pMD-V_L，用胶回收试剂盒（中国，BBI公司）回收V_L片段（长度约0.4kb）连接到用Eco RI和Kas I双酶切的pcDK-C_K上，转化大肠杆菌DH5α感受态，在100μg/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进行PCR检测（PCR条件同实施例1中的步骤（3）），PCR产物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试剂盒（中国，OMEGA公司）提取质粒，对提取的质粒进行双酶切（Eco RI/Not I）鉴定。表达载体构建流程见图4。

3.3嵌合抗体轻重链表达质粒的构建（3.1和3.2的替代方案）

本领域技术人员知道构建嵌合抗体的重链基因可以通过融合PCR的方法制备，分别PCR扩增重链可变区和重链恒定区的基因，以PCR产物为模板，用可变区的上游引物和恒定区的下游引物，通过融合PCR技术可以获得全长的嵌合抗体重链基因。同样的原理,PCR分别扩增轻链可变区和kappa链恒定区的基因，以PCR产物为模板，用可变区的上游引物和kappa的下游引物，通过融合PCR技术可以获得全长的嵌合抗体轻链基因。

3.3.1寡核苷酸引物设计设计下列引物：①扩增V_L基因上游引物V_Lup：5′-GAATTCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTC-3′；扩增V_L基因下游引物V_L down：5′-CACGCTGGCGCCGCCACGGTCCGTTTTATTTCC AGCTTGGTCCCCCCTC-3′，划线部分为EcoRⅠ的酶切位点。②扩增V_H基因上游引物V_H up：5′-GAATTCCACCATGAACTTCGGGCTCAGCTTG-3′；扩增V_H基因下游引物V_H down：5′-CGCTGGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG-3′，划线部分为Eco RⅠ的酶切位点。③扩增C_K基因所用引物的序列：Hu-C_k-up：5′-CGGACCGTGGCGGCGCCAGCGTG-3′；Hu C_k-down：5′-CCCGCGGCCGCTCATTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTC-3′，划线部分为NotⅠ的酶切位点。④扩增人IgG1亚类C_H基因所用引物的序列：HuC_H1-up：5′-GCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGT-3′；Hu IgG₁down：5′-GCGGCCGCTCATTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAGGC TCTTC-3′，划线部分为NotⅠ的酶切位点。

3.3.2V_H和V_L基因的PCR扩增用引物V_H-up与V_H-down扩增V_H基因,用引物V_L up与V_Ldown扩增V_L基因。模板分别为pMD-mouse-V_H和pMD-mouse-V_L质粒。PCR反应体积为50μL，包括5μL10×PCR反应缓冲液，100μmol/L dNTP,10μmol/L引物，1U EX Taq DNA聚合酶。PCR反应参数：94℃3min，接着扩增20个循环，每个循环包括94℃30s，55℃30s，72℃30s；最后72℃延伸7min。反应结束后10g/L琼脂糖凝胶电泳分析并回收PCR产物。扩增结果见附图1A,泳道1,2分别为重链和轻链可变区基因,M为核酸分子量标准DL2000。

3.3.3人IgG1亚类C_H和C_K基因的PCR扩增分别以pMD-C_H和pMD-C_K为模板，分别用引物对Hu-Ck-up和Hu Ck-down进行C_K基因的PCR扩增,HuCH1-up和Hu IgG1down进行人IgG1亚类C_H的扩增。PCR反应体系配制及反应条件同上。扩增结果见图1-B，泳道1，2分别为重链和轻链的恒定区，M为核酸分子量标准DL2000。

3.3.4嵌合抗体L、H链基因的扩增将V_L、C_K、V_H和C_H基因的PCR扩增产物纯化，回收后备用。取V_L、C_K的纯化后产物各1μL为模板，引物为V_L up和Hu C_k-down，进行嵌合抗体L链基因的扩增。PCR反应体系配制及反应条件同上。取V_H和IgG1C_H的纯化后产物各1μL为模板，以V_H up和Hu IgG1down为引物进行嵌合抗体H链基因的扩增。PCR反应体系配制及反应条件同上，扩增结果见图1-C，泳道1，2分别为重链和轻链，M为分子量标准DL2000。PCR产物回收后连接到pMD-T载体上,命名为pMD-H和pMD-L。酶切鉴定结果见图2，泳道1，7为核酸分子量标准DL2000，4为核酸分子量标准DL15000。2，3泳道为重链pMD-H的单酶切（EcoRⅠ）和双酶切（EcoRⅠ/NotⅠ）结果。泳道5，6为轻链pMD-L的单酶切（EcoRⅠ）和双酶切（EcoRⅠ/NotⅠ）结果。构建的载体送英骏公司测序进一步确认。

3.3.5嵌合抗体表达质粒的构建EcoRⅠ/NotⅠ双酶切pMD-L、pMD-H、pcDNA3.1（+），切胶回收L片段（长度约0.7kb）、H片段（长度约1.4kb）及pcDNA3.1（+）载体片段。而后分别将L片段及H片段连接到pcDNA3.1（+）载体片段上。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，氨苄青霉素（100μg/mL）筛选，挑选抗性克隆进行PCR鉴定，挑取阳性克隆至3mL LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中，次日用质粒提取试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行双酶切（EcoRⅠ/NotⅠ）鉴定。构建的表达质粒分别命名为pcDK-L和pcDE-H。酶切鉴定结果见图5，泳道1，7为核酸分子量标准DL2000，4为核酸分子量标准DL15000。2，3泳道为重链pcDE-H的单酶切（EcoRⅠ）和双酶切（EcoRⅠ/NotⅠ）结果。泳道5，6为轻链pcDK-L的单酶切（EcoRⅠ）和双酶切（EcoRⅠ/NotⅠ）结果。

4电转及细胞克隆的筛选

从液氮中取CHO-S细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为DMEM/F12+10%FBS，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱（Forma）中培养，长满后传入T75方瓶中。在T75方瓶中长满后，加入3ml胰酶消化30s，吸弃胰酶，用PBS洗细胞两次离心后，取1.5×10⁷细胞用0.5ml PBS（pH7.2）重悬，取10μl鲑精，线性化的表达质粒10μɡ(轻链质粒pcDK-L3.3μɡ和的重链质粒pcDE-H6.7μɡ二者比例为1:2)，加入到准备好的细胞当中，混匀后加入到预冷的2mm电转杯中冰浴，用电转仪160V电击。

电转后的细胞分成两份置于直径10cm的塑料培养皿中，分别加入10ml的含有10%FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。次日换新鲜的10ml的含有10%FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。待细胞长至50～60%满时，加入1.8mg/ml的G418，隔天换液，洗掉死细胞，G418浓度始终维持在1.8mg/ml，直至细胞不再死亡，克隆形成。将形成的克隆转移至96孔板中，用含有10%FBS、无双抗的DMEM/F12培养基，G418浓度为0.6mg/ml，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。Dot blot检测克隆的表达量。高表达克隆的筛选见图6，克隆2H3，2G6，2G8，2G11表达量高，选择2H3进一步研究。

5.发酵和嵌合抗体的纯化，Western blot检测与抗原F1的特异结合

从液氮中取出2H3工程细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为DMEM/F12+10%FBS，长满后传入T75方瓶中，置于5%CO₂细胞培养箱（Forma）中悬浮培养。

在T75方瓶中长满后，用胰酶消化，换自制悬浮培养基重悬，开始悬浮培养，每天监测细胞密度及状态，根据细胞密度及状态补加培养基，不断增加培养体积。当培养体积达到30ml时，将其转入150ml摇瓶中，摇瓶置于37℃的培养箱内，转动速度为100rpm。继续增加培养体积，使细胞密度维持在2-3×10⁶/ml。当培养体积达到150ml时，将其转入3L摇瓶中，摇瓶置于37℃的培养箱内，转动速度为100rpm。继续增加培养体积，使细胞密度维持在2-4×10⁶/ml。

发酵完毕，使用Mab select sure介质进行纯化，装填的层析柱体积为40ml，结合容量为30～50mg/ml。平衡缓冲液20mM PBS，pH7.2；洗涤缓冲液0.1M甘氨酸缓冲液pH4.6；洗脱缓冲液0.1M甘氨酸缓冲液pH3.0；再生缓冲液0.1M甘氨酸缓冲液pH2.7。纯化后的抗体见图7,1,2泳道分别为氧化型和还原型抗体分子,M为分子量标准。

取适量F1抗原进行SDS-PAGE，电泳后转移到硝酸纤维素膜上，用50G/L的脱脂奶粉做封闭液将膜37℃封闭1H，加1:20 000纯化后嵌合抗体，37℃，1H孵育；洗膜3次后以1:1 000稀释的HRP标记的羊抗人IGG F_C抗体37℃孵育1H，洗膜3次后，化学发光法显色。

免疫印迹结果见图8，说明重组F1能被单抗特异性识别。

6.嵌合单抗N端氨基酸序列测定

取纯化的嵌合抗体500ug与2×SDS-PAGE(含有巯基乙醇)缓冲液混合，上样到胶孔中(每孔50ug),电泳结束后，进行染色和脱色。送军事医学科学院仪器中心进行N端氨基酸序列测定。

预期的重链氨基酸序列为:EVMLV ESGGG LVKPG,测定的氨基酸序列为:EVMLVESGGG LVKPG,符合预期。

预期的轻链氨基酸序列为:DIVMS QSPSS LPVSV,测定的氨基酸序列:DIVMS QSPSS LPVSV,符合预期。

实施例2从腹水中制备鼠源性单克隆抗体及与抗原的结合活性分析

在接种瘤株前7-10d，每只小鼠腹腔注射石蜡油0.5ml，并用棉球充分轻揉小鼠腹部，使石蜡油在小鼠腹腔中充分扩散。准备杂交瘤细胞,复苏后并观察其生长状况，选择那些细胞形态和活性好的培养物，当其处于对数生长期时，用RPMI l640轻轻吹下，离心后除去培养液中的牛血清，悬浮于生理盐水中，注人小鼠腹腔。每只小鼠注人的细胞量l0⁵–l0⁶。接种瘤株后8-10d，可有腹水集聚表现，当腹部明显胀大时，开始采集腹水。将4mL腹水经12000r/min离心,去除脂类杂质或沉淀物,用等体积的起始缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH8.0)稀释样品。将样品上载到层析柱后,用5倍柱体积的起始缓冲液洗涤层析柱。用10倍柱体积的0.1mol/L的甘氨酸-盐酸(pH2.7)洗脱,承接洗脱液的容器中预先注入约为洗脱液1/10体积的1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)。重组F1稀释成2μg/ml，100ul/孔包被酶联板，4℃过夜，次日用封闭液（20mM PB，0.15MNaCl，5%的奶粉）37℃封闭1h后洗板，加入系列稀释的样品后37℃孵育1h洗板，加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗鼠Fc（Sigma，A0170）37℃孵育1h后洗板，OPD显色，酶标仪测OD₄₅₀。系列稀释的单抗256,128,64,32,16,8,4,2ng/ml与包被的重组F1反应,呈现剂量-效应反应,灵敏度为4-8ng/ml,与重组炭疽保护性抗原PA,重组鼠疫V抗原,重组破伤风抗原等不发生反应。结果显示本发明提供的抗鼠疫F1抗原的鼠源单克隆抗体具有高度特异的结合活性。

实施例3.ELISA检测嵌合抗体与F1的结合活性

重组F1稀释成2μg/ml，100ul/孔包被酶联板，4℃过夜，次日用封闭液（20mM PB，0.15M NaCl，5%的奶粉）37℃封闭1h后洗板，加入系列稀释的样品后37℃孵育1h洗板，加入1:1 000稀释的HRP标记的羊抗人Fc（Sigma，A0170）37℃孵育1h后洗板，OPD显色，酶标仪测OD₄₅₀。见图9。系列稀释的单抗256,128,64,32,16,8,4,2ng/ml与包被的重组F1反应,呈现剂量-效应反应,灵敏度为4-8ng/ml,与重组炭疽保护性抗原PA,重组鼠疫V抗原,重组破伤风抗原等不发生反应(图中未展示)。显示本发明提供的抗鼠疫F1抗原的单克隆抗体具有高度特异的结合活性。

实施例4.小鼠体内对鼠疫毒株攻击的保护效果

使用体重20～25克的BALB/c小鼠，先腹腔静脉注射嵌合单抗或鼠单抗（注射用生理盐水定容到100μl,浓度1mg/ml）,用20mM PBS作为对照；然后皮下注射36最小致死剂量(minimum lethal dose,MLD)的鼠疫强毒株，观察小鼠存活情况，观察时间为25天。结果鼠源单抗的保护率为83.33%(5/6),嵌合抗体的保护率为80%(4/5),对照组的6只小鼠全部死亡。两种单抗显示一致的保护效果，见图10。

实施例5.免疫原性考察

异源的重组蛋白给与人体不可避免会产生免疫原性，嵌合抗体较鼠源单抗应该具有更低的免疫原性。因为不可能在人体内进行试验，因此选择与人类最接近的动物类人猿体内进行考察。每组2只恒河猴，分别静脉注射鼠源单抗和嵌合单抗8mg，于2周、4周、6周检测产生抗体的滴度。用100ul2ug/ml鼠单抗或嵌合抗体包被酶联板，4℃过夜，用含有3%的BSA封闭1小时，封闭后加入系列稀释的猴血清(1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560.1:5120),最后用1:10000稀释的羊抗猴IgG（Santa Cruze,sc-2458），显色。鼠源单抗组，2周后平均抗体滴度达到1:80，4周平均抗体滴度达到1:320，6周平均抗体滴度达到1:160。而嵌合单抗的抗体滴度在2周、4周、6周3个时间点均低于1:20，说明鼠源单抗相比较嵌合单抗，在类人猿中具有较强的免疫原性，从而显示嵌合抗体具有更低的免疫原性。

Claims (10)

1.一种抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ IDNO2第45-54、69-83、118-132位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO6第44-60、76-82、115-123位氨基酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID NO2第20-44、55-68、84-117、133-143位氨基酸序列所示；重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示；轻链可变区的FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ IDNO6第21-43、61-75、83-114、124-133位氨基酸序列所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO6所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。

4.一种编码权利要求3所述单克隆抗体的重链或轻链的核苷酸序列，其特征在于，所述重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；所述轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示。

5.一种含有权利要求4所述核苷酸序列的表达载体，其特征在于，所述重链表达载体为pcDE-C_H，所述轻链表达载体为pcDK-C_K。

6.一种含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为CHO-S细胞。

8.权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体在制备鼠疫治疗药物中的应用。

9.一种药物制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体，以及可药用的载体。

10.根据权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射制剂。

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