CN103402533B - 氨基酸序列或其相应核酸在诊断和预防结核感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有以下特征的基因序列或其片段和相应的肽或共同肽或蛋白在制备用于诊断和预防活性或潜伏性疾病的特异性生物标记物的应用：所述基因序列或片段属于目前被结核分枝杆菌感染的人巨噬细胞中体外或离体诱导、抑制或保守的基因种类。

Description

氨基酸序列或其相应核酸在诊断和预防结核感染中的应用
本发明涉及来自结核分支杆菌的氨基酸序列或其相应核酸在诊断和预防结核感染、诊断试剂盒及其疫苗中的应用。
本发明更具体地涉及，具有以下特征的基因序列或其片段和相应的肽或共同肽或蛋白在制备用于诊断和预防活性或潜伏性疾病的特异性生物标记物的应用：所述基因序列或片段属于目前被结核分枝杆菌感染的人巨噬细胞中体外或离体诱导、抑制或保守的基因种类。
为了保证治疗的特异性、快速和有效，对结核感染和活性疾病发作的实验室诊断是非常重要的。
关于活性结核病，目前的诊断方案是基于显微镜方法、培养物方法和分子方法。关于显微镜方法，需要样品中有高浓度(5-10000/ml)的分枝杆菌才能获得阳性结果，而且灵敏度通常低于60％，同时由于无法区分MTB和非结核分枝杆菌而导致特异性下降。
关于培养物测试，所述应用无法保证在可接受的时间期限内作出医学报告。事实上，由于该细菌在体外生长缓慢，将其菌种置于固体或液体培养基中后(1)，只能在10-24天后观察到MTB菌落。另外，虽然培养物测试具有相当高的敏感性，但产生10-30％几率的假阴性结果，而且成本昂贵。
分子生物学测试具有较高的敏感性和特异性，其敏感性相当于培养物测试，并能快速区分MTB和非结核分枝杆菌。然而，对于含低浓度分枝杆菌的样品，该测试灵敏度较低，但有意义的是那些样品原本在显微镜检测中呈阴性，另外，只有高度专业的实验室可进行该测试，因此成本昂贵。
结核病仍然是全球公共安全的紧迫问题，其在高发国家中要计划有效的诊断和治疗方案缺乏必需的经济来源，而在低发工业国家中几乎无法诊断已感染的人群。
目前，在高发国家中，TB活性诊断是基于MTB显微镜检测(敏感性40-90％)和培养物检测(灵敏度70-90％)，所述培养物检测需要等待2-6周时间。在低发病工业国家中，TB活性诊断是基于显微镜测试和培养物测试，对于无法区分非结核MTB和分枝杆菌的样品或显微镜测试呈阴性的样品，使用分子测试(灵敏度70-90％)。
关于诊断潜伏性的或非活性的结核感染，常规的诊断测试是结核菌素皮肤测试，该测试是一种体外的即经济又快速的诊断测试，在过去的50年里已标准化，该测试使缜密并快速地检测感染成为可能，并使关于结核感染发生率和患病率的基础流行病调查得以实施。从公共安全的角度来看，结核菌素测试使感染率和患病率得以监控，因此获得全球疾病控制，从预防和临床医学的角度来看，可鉴别活性TB携带者的感染性接触，因而可建立抗结核感染的治疗性保护得以建立以预防新病例的发生。因此潜伏性感染诊断是高发国家和低发国家抗结核病的基础要素。
各种细胞和分子免疫文献表明，体外接触MTB或其抗原可产生强烈的以产生大量干扰素-γ(IFN-γ)为特征的细胞介导反应。这说明，鉴定释放IFN-γ的T淋巴细胞或测定细胞因子(作为对分枝杆菌或抗原的应答)本身代表了一种相当于结核菌素检测的诊断已受感染的方法。
关于该问题，近期上市了两款用于结核感染诊断的试剂盒，即QuantiFERON-TBGold和T-SPOT TB，所述试剂盒使用基于MTB基因属于MTB基因组RD1分化区的蛋白质和肽以在T淋巴细胞和循环血液中刺激产生IFN-γ。要在结核病高发国家中大规模使用，试剂盒成本相当高。两款市售试剂盒灵敏度相似，灵敏度和特异性范围分别是70-90％和80-95％。(2).另外，相比于常规的使用结核菌素的测试，在结核高发地区使用这些试剂盒的灵敏度和特异性仍存在争议。事实上，存在一些案例，其中皮肤测试被证明相比Quantiferon甚至更灵敏(3)，还存在两种测试恰好相当的案例。
进行多次穿刺方法或Mantoux皮内注射的仍广为使用的结核菌素皮肤测试的主要限制是操作复杂且特异性不足。事实上，该测试包括第一次和第二次病人随访，分别用来由专业医疗人员注射结核菌素和读取检测结果。对于工作人员，一旦TB-HIV共同感染，会存在由皮内注射器引起的污染风险。关于结核菌素的测试特异性，已知纯化的结核菌素蛋白衍生物(纯化的蛋白衍生物，PPD)在用于抗结核疫苗时显示与牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovisBacillus Calmette-Guerin)(BCG)和各种环境中的非结核分枝杆菌有交叉反应性，显示与Kock杆菌基因组有高度序列同源性。因此，已接种BCG免疫的对象或近期与MTB毒性种类(即如研究实验室命名为H37Rv株(ATCC 27294))接触的对象即使其反应强度比MTB感染对象低，也将显示结核菌素测试阳性。出于该原因，建立了区分MTB反应与抗牛型分枝杆菌(M.bovis)BCG或非结核分枝杆菌免疫产生的反应性的阳性强度限制。
然而，所述强度限制特异性对于接种疫苗中的结核感染或要诊断的广泛接触环境中分枝杆菌的人群是不够的。
关于预防MTB感染，目前唯一可用于结核病预防的疫苗是牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)(ATCC27291)，一种基于无毒性的牛型分枝杆菌(M.bovis)株的疫苗，全球已使用约75年。
因此鉴于上述内容很明显存在以下需求，提供新的基于特异性肽的诊断试剂盒和疫苗以适用于克服目前现有技术的缺陷。
有若干关于以下方面的研究，使用ELISPOT分析检测适合经刺激产生IFN-γ的血液单核细胞，对存在潜伏感染、或近期接触TB患者、和活性结核病中的MTB蛋白质和肽所产生的外周血淋巴细胞应答的研究。(7-15)ELISPOT技术可以通过使用针对细胞因子(例如IFN-γ)的致敏抗体刺激培养板上的单核血细胞，检测作为对刺激物应答的产生细胞因子T淋巴细胞频率，所述刺激物是一种或多种抗原，所述抗原可以是蛋白质、肽或其它靶分子。
当抗原以肽的形式(8-12个氨基酸的长度)代表表位存在，与主要组织相容性复合物分子(MHC)结合时，T淋巴细胞通过抗原T细胞受体(TCR)识别抗原，所述主要组织相容性复合物分子是一种在所有有核细胞(指I类MHC分子)和抗原递呈细胞(例如树突细胞、巨噬细胞等)(指II类MHC分子)的原生质膜上的受体家族。在人MHC系统中存在各种同种变体：I类MHC分子有HLA-A、HLA-B和HLA-C；HLA-DP、II类MHC分子有HLA-DQ和HLA-DR。每种所述分子表现不同数目的等位基因变体。由于被T细胞TCR识别的抗原库与抗原递呈细胞MHC受体结合衍生自消化的抗原蛋白的肽的能力有关，所以所述肽识别为抗原并因此适于活化抗原性蛋白特异性T淋巴细胞的必需条件是其与MHC受体结合的易感性。
编码HLA分子的基因属于人类基因中最多态性的基因。值得注意的是，因此所述分子的各等位基因产物之间的许多差异是碱基的多样性，这些碱基编码了与抗原肽结合区域有关的氨基酸序列修饰。这些序列多样性决定了HLA分子不同等位变体的结合特性，因而抗原肽库和所述等位基因变体可与T淋巴细胞TCR形成三分子复合物，并活化所述淋巴细胞。
在MTB蛋白抗原识别中，需要指出的是分枝杆菌每个单独表位可与一个或多个HLA等位基因变体结合，但不必与群体中所有的等位基因变体结合。另外，由于非纯合子对象表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ的至少2个等位基因变体和HLA-DR的2至4个变体，所以在包括研究群体的各对象中，在不同同种型的相同或不同等位基因变体中，可识别出不同表位。
因此很明显，适合与群体中每个单独对象所表达的HLA同种型的不同等位基因变体结合的肽是不同的。如上，需要使用一套抗原性肽，该抗原性肽适用于尽可能穷尽地代表研究人群对象中可被T淋巴细胞识别的MTB肽表位库。因此需要指出的是，虽然已对全MTB基因库测序并可获得用于研究，目前用于结核感染诊断的免疫测试的抗原来自培养基中体外生长阶段期间对分枝杆菌生化特性的研究，而非来自离体实验的所述研究。
专利申请US2006/0115847公开了一种用于结核分枝杆菌感染的免疫诊断方法，该方法基于来自由结核分枝杆菌基因组区域编码的蛋白质而非出现在BCG疫苗或最常见的非结核分枝杆菌中的蛋白质表位的组合。所述的专利申请的实验部分显示了各种所测蛋白的结果，然而，对单一肽应答的患者分布并不均一，事实上，如图1所示，数名TB患者对肽不敏感。关于患者对所选肽的应答频率，表6中显示最佳单独测试的肽CFP10在10/15患者中诱导应答，即66.66％应答频率。另外，通过一些肽的组合，如US专利表7显示，得到以下灵敏度结果：潜伏性TB，即PPD+患者，为92％，活性TB为88％，用抗生素治疗的TB患者为90％。
在之前的研究中，本发明的作者鉴定了一组基因，所述基因优先被MTB感染的人巨噬细胞转录，其特征为所述基因属于牛型分枝杆菌(M.bovis)-BCG疫苗种的缺失区域(WO2005/021790)。
本发明的作者现已分析体外原代培养和或来自活性肺TB患者的离体支气管肺泡灌注(BAL)样品中两者的巨噬细胞中由MTB表达的蛋白质。使用申请人研发的软件能分析II类组织相容性分子与全MTB基因组肽的结合能力，选出了一些从免疫学角度来看被证明显著有效的蛋白质。总的来说，该研究比较了三种不同生长环境中的结核分枝杆菌的基因表达：合成培养基培养(Sauton′s)、被结核分枝杆菌体外感染的衍生自单核细胞的人巨噬细胞(MDM)，来自肺TB感染患者在接受抗生素治疗前的支气管肺泡灌注(BAL)样品的肺泡巨噬细胞(AM)。
因此从得到的9个基因组中，根据组合标准(表达调节、免疫原性、分枝杆菌复合物特异性等)，选择在先的100种蛋白质。从这100种蛋白质中再选择30种蛋白质为一组，在TB患者全血液的免疫测试中获得对所述蛋白质的阳性应答(见表1)。
之后从以下4组对象中选择：抗生素治疗前的肺TB(n＝13)、近期接触的健康接触(TB患者家属)PPD+(n＝8)；长期TB患者接触的健康接触(医院工作者的职业暴露)PPD+(n＝5)；接种BCG疫苗的阴性对照，PPD-(n＝4)，设计、合成并测试在先的43种肽。
然后选出6种灵敏度和特异性最强的肽(见表2)，并用扩充的对象样品重复该实验(见表3-5和图1-7)。
对使用所述的6种肽和一种属于ESAT6的肽，即出现于上述两种市售试剂盒中的高度免疫原性蛋白质(见图8)，所得的结果进行比较。
总得来说，所有选择的肽表现出T细胞反应性。尤其是，肽#3(本发明的SEQ ID NO：71)表现出较高的灵敏度，即使不比衍生自对照肽的多表位ESAT-6蛋白质高，也与之相当。值得注意的是，在估测小组中(即通过估算每条肽的事后(ex-post)总数据)，6种多表位肽被约75％的活性TB对象识别(在该系列中，结果与Quantiferon-TB gold in-Tube相当，如表4所示)。所述数据与同时在相同孔使用所述6种肽对患者小组进行测试而获得的结果完美相似(示于表5)。
肽的最佳诊断灵敏度与最佳特异性相关。事实上，所表现出的肽应答限于活性TB对象、近期接触和接触医护人员(示于表4和图9)。值得注意的是，虽然数据必需得到较大对象数目的支持，但并没有检测到来自接种牛型分枝杆菌BCG抗结核疫苗对照对象的肽应答，甚至没有来自Quantiferon-TB gold in-Tube阳性的3个对象的肽应答。
另外，所述肽能提高市售测试的灵敏度，即目前用于结核感染诊断的金参照标准(图10)。当估测组和直接测试组在相同孔中进行时，6种所选的肽使Quantiferon-TB goldin-Tube在活性TB对象中分别得到75％至89％(+14％)和71％至83％(+13％)的提高(参见表4和表5)。
因此本发明的一个具体目的是将来自结核分枝杆菌且包含至少一个T细胞表位的至少6种与ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7相关的肽，作为检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试的生物标记物的应用，所述肽选自下组：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ IDNO：86)或SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。根据本发明的一个实施方式，所述肽是以下6种肽：ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)和GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)。根据本发明另一个实施方式，所述肽是以下6种肽：：ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)和GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：86)。根据本发明的一个实施方式，所述肽是以下9种肽：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)和SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
本发明还涉及一种将来自结核分枝杆菌且包含至少一个T细胞表位的至少一种与ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7相关的肽作为检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试的生物标记物的应用，所述肽选自下组：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ IDNO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)或SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。具体地，所述至少一种肽可以是LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)或TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)。
本发明的另一个目的是一种用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的方法，
所述方法包括：至少在6种与ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7相关的肽的存在下，在足以刺激淋巴细胞产生效应分子的条件下孵育包含来自所述对象淋巴细胞的血液样品一段时间，所述肽来自结核分枝杆菌且包含至少一个T细胞表位，
其中所述效应分子的存在或水平指示存在来自被分枝杆菌种感染或以前接触过分枝杆菌种的对象的淋巴细胞，
所述至少6种肽选自下组：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ IDNO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)或SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
根据本发明所述方法的一个实施方式，所述肽是以下6种肽：ELMARAAVLGSAH(SEQID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ IDNO：71)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)和GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)。根据本发明所述方法的另一个实施方式，所述肽是以下6种肽：ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)和GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：86)。根据另一个实施方式，所述肽是以下所有的9种肽：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)和SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
本发明的一个目的是一种用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的方法，
所述方法包括：在至少一种，与ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7有关的肽的存在下，在足以刺激淋巴细胞产生效应分子的条件下孵育包含来自所述对象淋巴细胞的血液样品一段时间，所述肽来自结核分枝杆菌且包含至少一个T细胞表位，
其中所述效应分子的存在或水平指示存在来自被分枝杆菌种感染或以前接触过分枝杆菌种的对象的淋巴细胞，
所述至少一种肽选自下组：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ IDNO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)或SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。例如，所述至少一种肽可以是LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)或TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)。
本发明另一目的是一种用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括：与ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7一起孵育包含来自所述对象淋巴细胞的血液样品，并测定所述淋巴细胞的干扰素-γ释放，所述方法具有以下特征：实施所述孵育进一步需要存在选自下组的至少6种肽：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)或SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)，
其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于使用ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7时的灵敏度和/或选择性。根据本发明的一个实施方式，所述肽是以下6种肽：ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)和GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)。根据另一实施方式，所述肽是以下6种肽：ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)和GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)。根据另一个实施方式，所述肽是以下所有的9种肽：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)和SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
本发明还涉及一种用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括，与ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7一起孵育包含来自所述对象淋巴细胞的血液样品，并测定所述淋巴细胞的干扰素-γ释放，所述方法具有以下特征：实施所述孵育进一步需要存在选自下组的至少一种肽：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)，ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)或SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)，
其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于使用ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7时的灵敏度和/或选择性。所述至少一种肽可以是LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)或TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)。
本发明的另一目的是一种将选自下列的至少一种生物标记物：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)如(i)或(ii)中所述蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；
在对象(即人或非人类的动物对象)中检测分枝杆菌感染的体外测试的应用。
所述分枝杆菌种可选自：结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、非洲分枝杆菌(M.Africanum)、卡氏分枝杆菌(M.Canetti)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)、鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.aviumparatuberculosis)、鸟分枝杆菌森林土壤亚种(M.avium silvaticum)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(M.avium″hominissuis″)、哥伦比亚分枝杆菌(M.colombiense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、爱尔兰分枝杆菌(M.hiberniae)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、土分枝杆菌(M.terrae)、次要分枝杆菌(M.triviale)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、假石氏分枝杆菌(M.pseudoshottsii)、石氏分枝杆菌(M.shottsii)、三重分枝杆菌(M.triplex)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、佛罗伦萨分枝杆菌(M.florentinum)、慢生黄分枝杆菌(M.lentiflavum)、沼泽分枝杆菌(M.palustre)、库比尔分枝杆菌(M.kubicae)、副瘰疬分枝杆菌(M.parascrofulaceum)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、中庸分枝杆菌(M.interjectum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、布氏分枝杆菌(M.branderi)、库氏分枝杆菌(M.cookii)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、波希米亚高地分枝杆菌(M.bohemicum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、斯氏分支杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、弥漫型麻风分枝杆菌(M.lepromatosis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、波特尼亚分枝杆菌(M.botniense)、混兽分枝杆菌(M.chimaera)、出众分枝杆菌(M.conspicuum)、安科纳分枝杆菌(M.doricum)、鼻疽分枝杆菌(M.farcinogenes)、柏林半岛分枝杆菌(M.heckeshornense)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、湖泊分枝杆菌(M.lacus)、海分枝杆菌(M.marinum)、慕尼黑分枝杆菌(M.monacense)、蒙特医学中心分枝杆菌(M.montefiorense)、壁分枝杆菌(M.murale)、内布拉斯加分枝杆菌(M.nebraskense)、萨斯喀彻温分枝杆菌(M.saskatchewanense)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、夏氏分枝杆菌(M.shimoidei)、托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、中间分枝杆菌(M.intermedium)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、博氏分枝杆菌(M.bolletii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、偶发分枝杆菌解乙酰胺亚种(M.fortuitum subsp.acetamidolyticum)、波氏分枝杆菌(M.boenickei)、外来分枝杆菌(M.peregrinum)、猪分枝杆菌(M.porcinum)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)、血液分枝杆菌(M.septicum)、新奥尔良分枝杆菌(M.neworleansense)、休斯敦分枝杆菌(M.houstonense)、产黏液分枝杆菌(M.mucogenicum)、马德里分枝杆菌(M.mageritense)、布里斯班分枝杆菌(M.brisbanense)、美容品分枝杆菌(M.cosmeticum)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、霍氏分枝杆菌(M.hodleri)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、腓特烈斯堡分枝杆菌(M.frederiksbergense)、金色分枝杆菌(M.aurum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、千田分枝杆菌(M.chitae)、诡诈分枝杆菌(M.fallax)、汇合分枝杆菌(M.confluentis)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、马达加斯加分枝杆菌(M.madagascariense)、草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、古德分枝杆菌(M.goodii)、沃氏分枝杆菌(M.wolinskyi)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、加的斯分枝杆菌(M.gadium)、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、大府分枝杆菌(M.obuense)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、田野分枝杆菌(M.agri)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、蜂房分枝杆菌(M.alvei)、临床病例所分枝杆菌(M.arupense)、冬分枝杆菌(M.brumae)、加那利群岛分枝杆菌(M.canariasense)、楚布医院分枝杆菌(M.chubuense)、康赛医院分枝杆菌(M.conceptionense)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、象分枝杆菌(M.elephantis)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、黑森分枝杆菌(M.hassiacum)、荷尔斯泰因分枝杆菌(M.holsaticum)、免疫应答分枝杆菌(M.immunogenum)、马赛分枝杆菌(M.massiliense)、盛罔分枝杆菌(M.moriokaense)、耐冷分枝杆菌(M.psychrotolerans)、食芘分枝杆菌(M.pyrenivorans)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、灰尘分枝杆菌(M.pulveris)、奥尔胡斯海港分枝杆菌(M.arosiense)、欧巴涅分枝杆菌(M.aubagnense)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、氯酚红分枝杆菌(M.chlorophenolicum)、食荧蒽分枝杆菌(M.fluoroanthenivorans)、熊本分枝杆菌(M.kumamotonense)、新城分枝杆菌(M.novocastrense)、帕尔马分枝杆菌(M.parmense)、弗卡分枝杆菌(M.phocaicum)、海绵分枝杆菌(M.poriferae)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、首尔分枝杆菌(M.seoulense)和东海分枝杆菌(M.tokaiense)。
优选的，分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
根据上述应用，所述如(i)或(ii)中所述的肽片段包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、AVIVRSELLTQYL(SEQ IDNO：22)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)、SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
上述应用还可包括选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD的一种或多种分枝杆菌蛋白质或其肽片段或其衍生的化学类似物的应用。
本发明的另一目的是一种将选自下列的至少一种生物标记物：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)如(i)或(ii)中所述蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；以及
(iv)一种选自下列的来自分枝杆菌的蛋白质或其肽片段或其衍生的化学类似物；
(a)ESAT；
(b)CFP10；
(c)TB7.7；和
(d)PPD；
在对象(即人或非人类的动物对象)中检测分枝杆菌感染的体外测试中的应用。
所述分枝杆菌种可选自：结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、非洲分枝杆菌(M.Africanum)、卡氏分枝杆菌(M.Canetti)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)、鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.aviumparatuberculosis)、鸟分枝杆菌森林土壤亚种(M.avium silvaticum)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(M.avium″hominissuis″)、哥伦比亚分枝杆菌(M.colombiense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、爱尔兰分枝杆菌(M.hiberniae)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、土分枝杆菌(M.terrae)、次要分枝杆菌(M.triviale)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、假石氏分枝杆菌(M.pseudoshottsii)、石氏分枝杆菌(M.shottsii)、三重分枝杆菌(M.triplex)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、佛罗伦萨分枝杆菌(M.florentinum)、慢生黄分枝杆菌(M.lentiflavum)、沼泽分枝杆菌(M.palustre)、库比尔分枝杆菌(M.kubicae)、副瘰疬分枝杆菌(M.parascrofulaceum)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、中庸分枝杆菌(M.interjectum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、布氏分枝杆菌(M.branderi)、库氏分枝杆菌(M.cookii)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、波希米亚高地分枝杆菌(M.bohemicum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、斯氏分支杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、弥漫型麻风分枝杆菌(M.lepromatosis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、波特尼亚分枝杆菌(M.botniense)、混兽分枝杆菌(M.chimaera)、出众分枝杆菌(M.conspicuum)、安科纳分枝杆菌(M.doricum)、鼻疽分枝杆菌(M.farcinogenes)、柏林半岛分枝杆菌(M.heckeshornense)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、湖泊分枝杆菌(M.lacus)、海分枝杆菌(M.marinum)、慕尼黑分枝杆菌(M.monacense)、蒙特医学中心分枝杆菌(M.montefiorense)、壁分枝杆菌(M.murale)、内布拉斯加分枝杆菌(M.nebraskense)、萨斯喀彻温分枝杆菌(M.saskatchewanense)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、夏氏分枝杆菌(M.shimoidei)、托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、中间分枝杆菌(M.intermedium)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、博氏分枝杆菌(M.bolletii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、偶发分枝杆菌解乙酰胺亚种(M.fortuitum subsp.acetamidolyticum)、波氏分枝杆菌(M.boenickei)、外来分枝杆菌(M.peregrinum)、猪分枝杆菌(M.porcinum)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)、血液分枝杆菌(M.septicum)、新奥尔良分枝杆菌(M.neworleansense)、休斯敦分枝杆菌(M.houstonense)、产黏液分枝杆菌(M.mucogenicum)、马德里分枝杆菌(M.mageritense)、布里斯班分枝杆菌(M.brisbanense)、美容品分枝杆菌(M.cosmeticum)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、霍氏分枝杆菌(M.hodleri)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、腓特烈斯堡分枝杆菌(M.frederiksbergense)、金色分枝杆菌(M.aurum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、千田分枝杆菌(M.chitae)、诡诈分枝杆菌(M.fallax)、汇合分枝杆菌(M.confluentis)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、马达加斯加分枝杆菌(M.madagascariense)、草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、古德分枝杆菌(M.goodii)、沃氏分枝杆菌(M.wolinskyi)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、加的斯分枝杆菌(M.gadium)、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、大府分枝杆菌(M.obuense)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、田野分枝杆菌(M.agri)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、蜂房分枝杆菌(M.alvei)、临床病例所分枝杆菌(M.arupense)、冬分枝杆菌(M.brumae)、加那利群岛分枝杆菌(M.canariasense)、楚布医院分枝杆菌(M.chubuense)、康赛医院分枝杆菌(M.conceptionense)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、象分枝杆菌(M.elephantis)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、黑森分枝杆菌(M.hassiacum)、荷尔斯泰因分枝杆菌(M.holsaticum)、免疫应答分枝杆菌(M.immunogenum)、马赛分枝杆菌(M.massiliense)、盛罔分枝杆菌(M.moriokaense)、耐冷分枝杆菌(M.psychrotolerans)、食芘分枝杆菌(M.pyrenivorans)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、灰尘分枝杆菌(M.pulveris)、奥尔胡斯海港分枝杆菌(M.arosiense)、欧巴涅分枝杆菌(M.aubagnense)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、氯酚红分枝杆菌(M.chlorophenolicum)、食荧蒽分枝杆菌(M.fluoroanthenivorans)、熊本分枝杆菌(M.kumamotonense)、新城分枝杆菌(M.novocastrense)、帕尔马分枝杆菌(M.parmense)、弗卡分枝杆菌(M.phocaicum)、海绵分枝杆菌(M.poriferae)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、首尔分枝杆菌(M.seoulense)和东海分枝杆菌(M.tokaiense)。优选的，分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
根据上述应用，如(iii)中所述的肽片段可包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)、SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
本发明的另一目的是一种将编码选自下列生物标记物的至少一种核酸分子：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)一种如(i)或(ii)中所述的蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；
在对象(即人或非人类的动物对象)中检测分枝杆菌感染的体外测试中的应用。
所述分枝杆菌种选自：结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、非洲分枝杆菌(M.Africanum)、卡氏分枝杆菌(M.Canetti)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)、鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.aviumparatuberculosis)、鸟分枝杆菌森林土壤亚种(M.avium silvaticum)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(M.avium″hominissuis″)、哥伦比亚分枝杆菌(M.colombiense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、爱尔兰分枝杆菌(M.hiberniae)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、土分枝杆菌(M.terrae)、次要分枝杆菌(M.triviale)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、假石氏分枝杆菌(M.pseudoshottsii)、石氏分枝杆菌(M.shottsii)、三重分枝杆菌(M.triplex)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、佛罗伦萨分枝杆菌(M.florentinum)、慢生黄分枝杆菌(M.lentiflavum)、沼泽分枝杆菌(M.palustre)、库比尔分枝杆菌(M.kubicae)、副瘰疬分枝杆菌(M.parascrofulaceum)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、中庸分枝杆菌(M.interjectum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、布氏分枝杆菌(M.branderi)、库氏分枝杆菌(M.cookii)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、波希米亚高地分枝杆菌(M.bohemicum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、斯氏分支杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、弥漫型麻风分枝杆菌(M.lepromatosis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、波特尼亚分枝杆菌(M.botniense)、混兽分枝杆菌(M.chimaera)、出众分枝杆菌(M.conspicuum)、安科纳分枝杆菌(M.doricum)、鼻疽分枝杆菌(M.farcinogenes)、柏林半岛分枝杆菌(M.heckeshornense)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、湖泊分枝杆菌(M.lacus)、海分枝杆菌(M.marinum)、慕尼黑分枝杆菌(M.monacense)、蒙特医学中心分枝杆菌(M.montefiorense)、壁分枝杆菌(M.murale)、内布拉斯加分枝杆菌(M.nebraskense)、萨斯喀彻温分枝杆菌(M.saskatchewanense)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、夏氏分枝杆菌(M.shimoidei)、托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、中间分枝杆菌(M.intermedium)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、博氏分枝杆菌(M.bolletii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、偶发分枝杆菌解乙酰胺亚种(M.fortuitum subsp.acetamidolyticum)、波氏分枝杆菌(M.boenickei)、外来分枝杆菌(M.peregrinum)、猪分枝杆菌(M.porcinum)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)、血液分枝杆菌(M.septicum)、新奥尔良分枝杆菌(M.neworleansense)、休斯敦分枝杆菌(M.houstonense)、产黏液分枝杆菌(M.mucogenicum)、马德里分枝杆菌(M.mageritense)、布里斯班分枝杆菌(M.brisbanense)、美容品分枝杆菌(M.cosmeticum)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、霍氏分枝杆菌(M.hodleri)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、腓特烈斯堡分枝杆菌(M.frederiksbergense)、金色分枝杆菌(M.aurum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、千田分枝杆菌(M.chitae)、诡诈分枝杆菌(M.fallax)、汇合分枝杆菌(M.confluentis)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、马达加斯加分枝杆菌(M.madagascariense)、草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、古德分枝杆菌(M.goodii)、沃氏分枝杆菌(M.wolinskyi)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、加的斯分枝杆菌(M.gadium)、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、大府分枝杆菌(M.obuense)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、田野分枝杆菌(M.agri)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、蜂房分枝杆菌(M.alvei)、临床病例所分枝杆菌(M.arupense)、冬分枝杆菌(M.brumae)、加那利群岛分枝杆菌(M.canariasense)、楚布医院分枝杆菌(M.chubuense)、康赛医院分枝杆菌(M.conceptionense)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、象分枝杆菌(M.elephantis)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、黑森分枝杆菌(M.hassiacum)、荷尔斯泰因分枝杆菌(M.holsaticum)、免疫应答分枝杆菌(M.immunogenum)、马赛分枝杆菌(M.massiliense)、盛罔分枝杆菌(M.moriokaense)、耐冷分枝杆菌(M.psychrotolerans)、食芘分枝杆菌(M.pyrenivorans)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、灰尘分枝杆菌(M.pulveris)、奥尔胡斯海港分枝杆菌(M.arosiense)、欧巴涅分枝杆菌(M.aubagnense)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、氯酚红分枝杆菌(M.chlorophenolicum)、食荧蒽分枝杆菌(M.fluoroanthenivorans)、熊本分枝杆菌(M.kumamotonense)、新城分枝杆菌(M.novocastrense)、帕尔马分枝杆菌(M.parmense)、弗卡分枝杆菌(M.phocaicum)、海绵分枝杆菌(M.poriferae)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、首尔分枝杆菌(M.seoulense)和东海分枝杆菌(M.tokaiense)。优选的，分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
根据上述应用，如(iii)中所述肽片段可包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)、SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。所述应用还可包括一种编码分枝杆菌蛋白质或其衍生的肽片段的核酸分子的应用，所述分枝杆菌蛋白或其衍生的肽片段选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD或其同源物。
本发明的另一目的是一种来自分枝杆菌种并包含T-细胞表位的经分离的蛋白质，所述蛋白质选自下列：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780。根据本发明所述蛋白质的经分离的肽可包含T-细胞表或其化学类似物。根据本发明所述经分离的肽可包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)、SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。
本发明的另一目的是一种经分离的核酸分子，所述分子编码本发明上述蛋白质或肽。
本发明涉及一种包含上述核酸分子的载体和包含所述载体的经分离的细胞。
发明的另一目的是一种包含容器的试剂盒，所述容器包含上述至少一种蛋白质或至少一种肽或至少一种核酸分子。
本发明涉及一种体外诊断对象中分枝杆菌种感染的方法，所述方法包括，在至少一种选自下列的生物标记物的存在下，在足以刺激淋巴细胞产生效应分子的条件下孵育包含来自所述对象淋巴细胞的血液样品一段时间：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)如(i)或(ii)中所述蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；
其中所述效应分子的存在或水平指示存在来自被分枝杆菌种感染或之前接触过分枝杆菌种的对象的淋巴细胞。对象可以是人或非人类的动物。血液和生物标记物间的孵育可以任选地在肝素的存在下，在所添加的碳水化合物的存在下，在试管中进行。根据本发明的一个实施方式，所述孵育还可在选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD或其混合物的分枝杆菌蛋白质或其肽片段或其衍生的化学类似物的存在下进行。所述分枝杆菌种可选自：结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、非洲分枝杆菌(M.Africanum)、卡氏分枝杆菌(M.Canetti)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)、鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium paratuberculosis)、鸟分枝杆菌森林土壤亚种(M.aviumsilvaticum)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(M.avium″hominissuis″)、哥伦比亚分枝杆菌(M.colombiense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、爱尔兰分枝杆菌(M.hiberniae)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、土分枝杆菌(M.terrae)、次要分枝杆菌(M.triviale)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、假石氏分枝杆菌(M.pseudoshottsii)、石氏分枝杆菌(M.shottsii)、三重分枝杆菌(M.triplex)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、佛罗伦萨分枝杆菌(M.florentinum)、慢生黄分枝杆菌(M.lentiflavum)、沼泽分枝杆菌(M.palustre)、库比尔分枝杆菌(M.kubicae)、副瘰疬分枝杆菌(M.parascrofulaceum)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、中庸分枝杆菌(M.interjectum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、布氏分枝杆菌(M.branderi)、库氏分枝杆菌(M.cookii)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、波希米亚高地分枝杆菌(M.bohemicum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、斯氏分支杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、弥漫型麻风分枝杆菌(M.lepromatosis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、波特尼亚分枝杆菌(M.botniense)、混兽分枝杆菌(M.chimaera)、出众分枝杆菌(M.conspicuum)、安科纳分枝杆菌(M.doricum)、鼻疽分枝杆菌(M.farcinogenes)、柏林半岛分枝杆菌(M.heckeshomense)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、湖泊分枝杆菌(M.lacus)、海分枝杆菌(M.marinum)、慕尼黑分枝杆菌(M.monacense)、蒙特医学中心分枝杆菌(M.montefiorense)、壁分枝杆菌(M.murale)、内布拉斯加分枝杆菌(M.nebraskense)、萨斯喀彻温分枝杆菌(M.saskatchewanense)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、夏氏分枝杆菌(M.shimoidei)、托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、中间分枝杆菌(M.intermedium)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、博氏分枝杆菌(M.bolletii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、偶发分枝杆菌解乙酰胺亚种(M.fortuitum subsp.acetamidolyticum)、波氏分枝杆菌(M.boenickei)、外来分枝杆菌(M.peregrinum)、猪分枝杆菌(M.porcinum)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)、血液分枝杆菌(M.septicum)、新奥尔良分枝杆菌(M.neworleansense)、休斯敦分枝杆菌(M.houstonense)、产黏液分枝杆菌(M.mucogenicum)、马德里分枝杆菌(M.mageritense)、布里斯班分枝杆菌(M.brisbanense)、美容品分枝杆菌(M.cosmeticum)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、霍氏分枝杆菌(M.hodleri)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、腓特烈斯堡分枝杆菌(M.frederiksbergense)、金色分枝杆菌(M.aurum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、千田分枝杆菌(M.chitae)、诡诈分枝杆菌(M.fallax)、汇合分枝杆菌(M.confluentis)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、马达加斯加分枝杆菌(M.madagascariense)、草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、古德分枝杆菌(M.goodii)、沃氏分枝杆菌(M.wolinskyi)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、加的斯分枝杆菌(M.gadium)、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、大府分枝杆菌(M.obuense)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、田野分枝杆菌(M.agri)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、蜂房分枝杆菌(M.alvei)、临床病例所分枝杆菌(M.arupense)、冬分枝杆菌(M.brumae)、加那利群岛分枝杆菌(M.canariasense)、楚布医院分枝杆菌(M.chubuense)、康赛医院分枝杆菌(M.conceptionense)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、象分枝杆菌(M.elephantis)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、黑森分枝杆菌(M.hassiacum)、荷尔斯泰因分枝杆菌(M.holsaticum)、免疫应答分枝杆菌(M.immunogenum)、马赛分枝杆菌(M.massiliense)、盛罔分枝杆菌(M.moriokaense)、耐冷分枝杆菌(M.psychrotolerans)、食芘分枝杆菌(M.pyrenivorans)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、灰尘分枝杆菌(M.pulveris)、奥尔胡斯海港分枝杆菌(M.arosiense)、欧巴涅分枝杆菌(M.aubagnense)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、氯酚红分枝杆菌(M.chlorophenolicum)、食荧蒽分枝杆菌(M.fluoroanthenivorans)、熊本分枝杆菌(M.kumamotonense)、新城分枝杆菌(M.novocastrense)、帕尔马分枝杆菌(M.parmense)、弗卡分枝杆菌(M.phocaicum)、海绵分枝杆菌(M.poriferae)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、首尔分枝杆菌(M.seoulense)和东海分枝杆菌(M.tokaiense)。优选的，分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
根据本发明上述应用，如(iii)中所述的肽可包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、LAWITAVVPGLMV(SEQ IDNO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)、SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。所述效应分子可选自干扰素-γ、细胞因子、白介素和TNF-α，优选干扰素-γ。
本发明的另一目的是一种对上述蛋白质和肽特异性的经分离的抗体。
本发明还涉及一种用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括：与ESAT6、CFP10、TB7.7和/或PP中的一种或多种一起，孵育包含来自所述对象淋巴细胞的血液样品，并测定所述淋巴细胞的干扰素-γ释放，所述方法具有以下特征：实施所述孵育还需要存在选自下组的至少一种生物标记物：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)一种如(i)或(ii)中所述蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；
其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于仅使用ESAT6、CFP10、TB7.7和/或PPD中的一种或多种的灵敏度和/或选择性。
另外，本发明还涉及用于治疗或预防分枝杆菌种感染的疫苗，所述疫苗包含选自下述的试剂以及一种或多种药学上可接受的佐剂、载体、赋形剂和/或稀释剂或由选自下述的试剂以及一种或多种药学上可接受的佐剂、载体、赋形剂和/或稀释剂组成：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)一种如(i)或(ii)中所述的蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物。
根据本发明所述疫苗，所述分枝杆菌种选自：结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、非洲分枝杆菌(M.Africanum)、卡氏分枝杆菌(M.Canetti)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)、鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium paratuberculosis)、鸟分枝杆菌森林土壤亚种(M.avium silvaticum)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(M.avium″hominissuis″)、哥伦比亚分枝杆菌(M.colombiense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、爱尔兰分枝杆菌(M.hiberniae)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、土分枝杆菌(M.terrae)、次要分枝杆菌(M.triviale)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、假石氏分枝杆菌(M.pseudoshottsii)、石氏分枝杆菌(M.shottsii)、三重分枝杆菌(M.triplex)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、佛罗伦萨分枝杆菌(M.florentinum)、慢生黄分枝杆菌(M.lentiflavum)、沼泽分枝杆菌(M.palustre)、库比尔分枝杆菌(M.kubicae)、副瘰疬分枝杆菌(M.parascrofulaceum)、海德堡分枝杆菌(M.heidelbergense)、中庸分枝杆菌(M.interjectum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、布氏分枝杆菌(M.branderi)、库氏分枝杆菌(M.cookii)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、波希米亚高地分枝杆菌(M.bohemicum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、斯氏分支杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、弥漫型麻风分枝杆菌(M.lepromatosis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、波特尼亚分枝杆菌(M.botniense)、混兽分枝杆菌(M.chimaera)、出众分枝杆菌(M.conspicuum)、安科纳分枝杆菌(M.doricum)、鼻疽分枝杆菌(M.farcinogenes)、柏林半岛分枝杆菌(M.heckeshomense)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、湖泊分枝杆菌(M.lacus)、海分枝杆菌(M.marinum)、慕尼黑分枝杆菌(M.monacense)、蒙特医学中心分枝杆菌(M.montefiorense)、壁分枝杆菌(M.murale)、内布拉斯加分枝杆菌(M.nebraskense)、萨斯喀彻温分枝杆菌(M.saskatchewanense)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、夏氏分枝杆菌(M.shimoidei)、托斯卡纳分枝杆菌(M.tusciae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、中间分枝杆菌(M.intermedium)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、博氏分枝杆菌(M.bolletii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、偶发分枝杆菌解乙酰胺亚种(M.fortuitum subsp.acetamidolyticum)、波氏分枝杆菌(M.boenickei)、外来分枝杆菌(M.peregrinum)、猪分枝杆菌(M.porcinum)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)、血液分枝杆菌(M.septicum)、新奥尔良分枝杆菌(M.neworleansense)、休斯敦分枝杆菌(M.houstonense)、产黏液分枝杆菌(M.mucogenicum)、马德里分枝杆菌(M.mageritense)、布里斯班分枝杆菌(M.brisbanense)、美容品分枝杆菌(M.cosmeticum)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、霍氏分枝杆菌(M.hodleri)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、腓特烈斯堡分枝杆菌(M.frederiksbergense)、金色分枝杆菌(M.aurum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、千田分枝杆菌(M.chitae)、诡诈分枝杆菌(M.fallax)、汇合分枝杆菌(M.confluentis)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、马达加斯加分枝杆菌(M.madagascariense)、草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、古德分枝杆菌(M.goodii)、沃氏分枝杆菌(M.wolinskyi)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、加的斯分枝杆菌(M.gadium)、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、大府分枝杆菌(M.obuense)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、田野分枝杆菌(M.agri)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、蜂房分枝杆菌(M.alvei)、临床病例所分枝杆菌(M.arupense)、冬分枝杆菌(M.brumae)、加那利群岛分枝杆菌(M.canariasense)、楚布医院分枝杆菌(M.chubuense)、康赛医院分枝杆菌(M.conceptionense)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、象分枝杆菌(M.elephantis)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、黑森分枝杆菌(M.hassiacum)、荷尔斯泰因分枝杆菌(M.holsaticum)、免疫应答分枝杆菌(M.immunogenum)、马赛分枝杆菌(M.massiliense)、盛罔分枝杆菌(M.moriokaense)、耐冷分枝杆菌(M.psychrotolerans)、食芘分枝杆菌(M.pyrenivorans)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、灰尘分枝杆菌(M.pulveris)、奥尔胡斯海港分枝杆菌(M.arosiense)、欧巴涅分枝杆菌(M.aubagnense)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、氯酚红分枝杆菌(M.chlorophenolicum)、食荧蒽分枝杆菌(M.fluoroanthenivorans)、熊本分枝杆菌(M.kumamotonense)、新城分枝杆菌(M.novocastrense)、帕尔马分枝杆菌(M.parmense)、弗卡分枝杆菌(M.phocaicum)、海绵分枝杆菌(M.poriferae)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、首尔分枝杆菌(M.seoulense)和东海分枝杆菌(M.tokaiense)。优选的，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
本发明所述疫苗可用于人或非人类的动物对象。如(iii)中所述的肽可包含选自下述的氨基酸序列或由选自下述的氨基酸序列组成：TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：24)、AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO：22)、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO：71)、RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO：70)、GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO：13)、ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO：21)、LAWITAVVPGLMV(SEQ ID NO：85)、GEIIFISGRLNG(SEQ ID NO：86)、SALLRRLSTCPPES(SEQ ID NO：87)。因此，本发明涉及用于预防分枝杆菌种感染的上述疫苗。
本发明的另一目的是一种将选自下列的至少一种试剂：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)如(i)或(ii)中所述蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；
在治疗和或预防分枝杆菌种感染中的应用。
本发明还涉及一种体外评估对象获得细胞介导的免疫应答能力的方法，所述方法包括用选自下述的至少一种试剂接触包含T-淋巴细胞的样品，所述T-淋巴细胞对分枝杆菌种或包含其衍生的T-淋巴细胞表位的抗原或蛋白质敏感：
(i)来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的选自下述的蛋白质：Rv0023、Rv0182c、Rv0290、Rv0601c、Rv0647c、Rv0724A、Rv0890c、Rv1251c、Rv1398c、Rv1478、Rv1497、Rv1575、Rv1578c、Rv1899c、Rv2137c、Rv2333c、Rv2548、Rv2557、Rv2816c、Rv2990、Rv3094c、Rv3107c、Rv3188、Rv3239c、Rv3296、Rv3425、Rv3446c、Rv3479、Rv3482c、Rv3780；
(ii)如(i)中所述蛋白质的同源物，所述同源物具有一段在最佳比对后相比于所述蛋白质之一具有至少80％的相似度的氨基酸序列；以及
(iii)如(i)或(ii)中所述蛋白质的肽片段，所述肽片段具有T-细胞表位或其化学类似物；
经一段时间并在充足条件下刺激所述淋巴细胞产生效应分子，其中效应分子的存在或水平指示所述对象获得细胞-介导的免疫应答的能力。
本发明目前只是通过举例而非限定的方式，根据其优选实施方式来说明，可具体参照所附附图，其中：
图1.通过比较四种对象人群，分析作为PPD应答的IFN-γ的产生情况分析，四种对象人群为：a.首次测试肺TB患者；b.健康接触者、接触过TB、PPD阳性；c.健康对照、职业性接触TB、Quantiferon阳性；d.阴性对照、Quantiferon阴性、接种过BCG疫苗。
图2.在4个所测对象组中，分析作为对TAWITAVVPGLMV(SEQ ID NOT24)肽应答的IFN-γ产生情况。
图3.在4个所测对象组中，分析作为对AVIVRSELLTQYL(SEQ ID NO 22)肽应答的IFN-γ产生情况。
图4.在4个所测对象组中，分析作为对GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG(SEQ ID NO71)肽应答的IFN-γ产生情况。
图5.在4个所测对象组中，分析作为对RPVRRVLLFVVPSSGPAP(SEQ ID NO 70)肽应答的IFN-γ产生情况。
图6.在4个所测对象组中，分析作为对GEIIFISGRLNGaa(SEQ ID NO 13)肽应答的IFN-γ产生情况。
图7.在4个所测对象组中，分析作为对ELMARAAVLGSAH(SEQ ID NO 21)肽应答的IFN-γ产生情况。
图8.在4个所测对象组中，分析作为对ESAT6(QQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSL-SEQID NO：84)肽应答的IFN-γ产生情况。
图9.仅使用SEQ ID NO：24、21、71、70、13、22六种肽得到的阳性测试频率。
图10.添加SEQ ID NO：24、21、70、71、13、22肽之后使用Quantiferon TB-plus市售产品所得的测试灵敏度的提高。
图11.在TB+对象、PPD+接触者和HCW对象中，相比使用RD1(ESAT6)多表位肽时得到分别为55％、33％和45.5％的灵敏度，联用1-6种肽时得到的灵敏度为76.3％、62％和66.7％。
实施例1：在体外和离体分析的生物样品中，鉴定被感染的人巨噬细胞中结核分枝杆菌表达的蛋白质
材料和方法
ELISPOT免疫诊断测试
实施用于测试的一般方法需要：96孔板(MAIPS45，Millipore公司，美国，加利福尼亚州，森尼维尔)、初级抗体(IFN-γ涂覆单克隆抗体，M-700A，Pierce-Endogen公司，美国，洛克福德)、生物素化抗体(M-701B，Pierce-Endogen公司)、链霉亲和素-HRP(Pierce-Endogen公司)、底物(ACE显色试剂盒，Sigma公司)、即用浓度的刺激物(肽，PHA和其它抗原)。
根据以下步骤进行ELISPOT测试：
涂覆：使用5μg/mL初级抗体的无菌磷酸缓冲液(PBS)溶液处理96孔板，以100μL/孔递送；涂覆所述板并在4℃孵育20小时；以200μL/孔无菌PBS对所述板洗涤4次，在最终洗涤时通过将板在吸收纸上拍打来去除过量液体。
封闭：添加200μL/孔“封闭溶液”(含10％胎牛血清(FCS)的无菌PBS)以防止非特异性蛋白结合；将板在室温孵育2小时；吸出“封闭溶液”。
细胞制备和孵育
1.通过密度梯度离心(Ficoll-Hypaque，Pharmacia公司；瑞典；乌普萨拉)从静脉血(7ml含EDTA)中分离单核细胞(PBMC)，使用基于滤管的快速分离白细胞的方法(LeucoSepTM，ARNIKA，米兰)。用1×PBS(磷酸缓冲液)洗涤两次，将团块重悬于完全培养基(含25mM HEPES、10％v/v FCS、2mM L-谷氨酸盐、10U/mL盘尼西林/链霉素的RPMI 1640)中以获得100μL中2x105的细胞。
2.与100μL不同的刺激物一起添加100μL/well细胞悬液；
3.培养箱中，37℃、5％CO2条件下，将所述板孵育40小时；
4.移除细胞；
5.以200μL/孔PBS将所述板洗涤4次并用200μL/孔“洗涤缓冲液”(PBS/0.05％吐温20(Sigma公司))洗涤4次；
6.在最终洗涤中，在吸收纸上拍打所述板来去除过量液体。
用生物素化抗体孵育
生物素化抗体经PBS/4％牛血清蛋白(fraction V，Sigma公司)稀释到1μg/ml浓度，以100μl/孔递送。然后将所述板置于培养箱中在37℃、5％CO2条件下孵育100分钟；用“洗涤缓冲液”将所述板洗涤4次。在最终洗涤中，在吸收纸上拍打所述板来去除过量液体。
检测
经“洗涤缓冲液”以1∶1000稀释，以100μl/孔“链霉亲和素-HRP”用于检测。将所述板在室温下孵育30分钟。然后在黑暗中，用“洗涤缓冲液”洗涤4次。在最终洗涤中，在吸收纸上拍打所述板来去除过量液体。递送100μL/孔底物。平行对照中，为了进行酶-底物反应，将已制备的底物100μl与“稀释的链霉亲和素-HRP”孵育数分钟。如果反应成功，所述底物会从淡褐色转变为粉色。
最后在黑暗中将所述板在室温下孵育10-20分钟。弃去底物，用水洗涤所述板来去除过量底物然后空气干燥20小时。
用于经所选肽和蛋白质刺激的全血液样品中鉴定人和动物的IFN-γ的ELISA测试(CMI测试方案)。
结果
作者在体外和离体分析的生物样品中鉴定了被感染的人类巨噬细胞中结核分枝杆菌表达的蛋白组。对三种不同生长环境中表达的结核分枝杆菌基因进行了比较：合成培养基培养(Sauton′s)、被结核分枝杆菌在培养物中感染的衍生自单核细胞的人巨噬细胞(MDM)、来自肺部TB感染患者在抗生素治疗前的支气管肺泡灌注(BAL)样品的肺泡巨噬细胞(AM)。
从如此得到的9组基因中，根据组合标准(免疫原性、结核复合物特异性等)先选出了100种蛋白质。再从这100种蛋白质中选择30种蛋白质作为一组，在TB患者全血液的免疫测试中获得了对所述蛋白质的阳性应答。
表1
调节说明：
A：相对MDM在AM中上调；
B：总在AM和MDM中表达；
C：相对AM在MDM中上调；
D：相对MDM和/或AM在Sauton中上调；
E：相对Sauton’s在MDM和/或AM中上调；
在进一步选择后，从以下4组对象中初步选出43种肽：抗生素治疗前的肺TB(n＝13)、近期接触的健康接触者(TB患者关系人)PPD+(n＝8)、长期接触TB患者的健康接触者(医院工作者的职业接触)PPD+(n＝5)、接种BCG疫苗的阴性对照，PPD-(N＝4)，对其设计及合成。
然后选择6种敏感性和特异性最强的肽(见表2)并使用扩充的对象样品重复所述实验(见表3-4和图1-7)。
表2分别显示了MTB所选基因、选择用于T CD4+细胞试验的肽以及其相应的鉴定号。
表2
表3
表4
表5
使用所述的6种肽和一种属于ESAT6的肽，即出现于上述两种市售试剂盒中的一种高度免疫原性蛋白质，比较所得的结果。
观察到在人巨噬细胞感染过程中和/或来自活性肺泡TB患者的肺巨噬细胞样品中所诱导的MTB基因，结果如下表所示：
总在MDM和AM细胞内复制期间表达的基因：Rv0724A.
相对Sauton’s培养基培养在MDM和/或AM中诱导的基因：Rv1251c、Rv1478和Rv3479。
两组MTB基因可能在人宿主中的存活上有相同的作用(来自健康的体外感染捐赠者的原代巨噬细胞和TB患者肺泡巨噬细胞)，因此将其设计为MTB细胞内存活生物标记物，其中，MTB毒性定义为仅基于病原体入侵、存活和宿主细胞内复制的能力。
另外，本发明作者设计了一些基因组的肽，所述基因组属于相同的代谢种类，以此找到所述种类的“共有”的蛋白。该研究基于下述假设：不同菌种蛋白产生的相似功能的功能区域是保守的。为了找到这些保守基序，通过使用PSI-BLAST(位点特异性重复的基本局部比对检索工具http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，进行多序列对比(PSSM)。检测到具有较高相似度的带有插入序列的序列后，可以选择适合的蛋白，所述蛋白有助于产生用于后续数据库搜索的数据；如此对于不同的序列位点，有助于产生数据的序列数不同。
多序列比对使由于极度保守而在结构上和功能上重要的残基得以检测，并且所述残基作为整体构成“共有”序列或每种MTB蛋白功能组的序列。
因此，代谢功能组(例如调节蛋白、涉及脂类代谢的蛋白等)的蛋白(人巨噬细胞中诱导或阻抑)被检测为感染期间由结核分枝杆菌“调节的“蛋白，该蛋白被分析用于检索保守序列。使用“PSI-BLAST”序列多样性比对，可从中得到用于肽合成的最佳“共有”序列。
合成衍生自所选蛋白的肽，并通过ELISPOT技术和TB诊断高敏感性ELISA试验，Quantiferon TB-Plus和Quantiferon CMI，使用针对产生IFN-γ的细胞的检测系统，将所述肽用于MTB特异性T CD4+淋巴细胞的检测和定量分析。该技术使得T细胞产生被检测的细胞因子(例如IFN-γ)的频率得以定量分析，其中T细胞产生特定细胞因子的频率响应特异性抗原刺激物，表明在编码该肽的感染因子(MTB)出现时，所处理对象的免疫系统已经产生对所述肽的免疫应答。第二种技术使得特定T淋巴细胞作为对所选抗原的应答而产生的IFN-γ总产量得以定量分析。
虽然本测试并不证明诱导产生抗MTB感染的保护力的能力，但在MTB感染对象或患活性结核病的对象中检测出存在特异性和差异性识别这些肽的淋巴细胞的存在，是其免疫原性的指征，是疫苗和诊断测试证明有效的必不可少的细微特征。另外，单独使用或与其他分枝杆菌抗原共同使用这些肽，可提供一种灵敏和特异的TB诊断测试，并且使市售测试(即目前结核诊断的参考金标准)的灵敏度得到提升(见图10)。当在相同孔中进行一组评估和直接测试时，所选的6种肽并没有降低测试特异性，而是使Quantiferon TB gold in-tube对活性TB的对象产生的应答分别得到从75％至89％(+14％)和71％至83％(+13％)的提高。
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Claims (42)

1.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的以下6种肽在制备在检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试中使用的生物标记物的应用：TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL。
2.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的至少一种肽在制备在检测对象中结核分枝杆菌感染的体外测试中使用的生物标记物的应用，所述肽选自下组：TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa或AVIVRSELLTQYL。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肽是TAWITAVVPGLMV。
4.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的以下6种肽在制备用于体外诊断对象中受结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL。
5.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与选自下组的至少一种来自结核分枝杆菌且各包含至少一个T细胞表位的肽在制备用于体外诊断对象中受结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa或AVIVRSELLTQYL。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肽是TAWITAVVPGLMV。
7.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7以及以下6种肽在制备用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL，
其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于使用ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7时的灵敏度和/或选择性。
8.ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7与选自下组的至少一种肽在制备用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用：TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa或AVIVRSELLTQYL，
其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于使用ESAT6和CFP10以及任选的TB7.7时的灵敏度和/或选择性。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肽是TAWITAVVPGLMV。
10.来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物在制备在对象中检测结核分枝杆菌的体外测试中使用的试剂中的应用，所述混合物由TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL组成。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
12.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述对象是人。
13.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述对象是非人类的动物。
14.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用还包括选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD的一种或多种分枝杆菌蛋白质的应用。
15.来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物以及选自下列的来自分枝杆菌的蛋白质：
(a)ESAT；
(b)CFP10；
(c)TB7.7；和
(d)PPD；
在制备在对象中检测结核分枝杆菌的体外测试中使用的试剂中的应用，所述混合物由TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL组成。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述对象是人。
18.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述对象是非人类的动物。
19.编码来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的核酸分子的混合物在制备在对象中检测结核分枝杆菌的体外测试中使用的试剂中的应用，所述混合物由编码TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL的核酸分子组成。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述对象是人。
22.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述对象是非人类的动物。
23.如权利要求19至22中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用还包括编码分枝杆菌蛋白质的核酸分子的应用，所述分枝杆菌蛋白选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD。
24.一种来自分枝杆菌种并包含T-细胞表位的经分离的蛋白质的混合物，所述混合物由TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL组成。
25.如权利要求24所述蛋白质的经分离的肽的混合物，所述肽包含T-细胞表位。
26.经分离的核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求24所述蛋白质的混合物或如权利要求25所述肽的混合物。
27.包含如权利要求26所述核酸分子的载体。
28.包含如权利要求27所述载体的经分离的细胞。
29.一种包含容器的试剂盒，所述容器包含如权利要求24所述蛋白的混合物或如权利要求25所述肽的混合物或如权利要求26所述核酸分子。
30.来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物在制备体外诊断对象中分枝杆菌种感染的试剂盒中的应用，所述混合物由TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL组成，经一段时间并在充足条件下刺激淋巴细胞产生效应分子，其中效应分子的存在或水平指示存在来自被分枝杆菌种感染或之前接触过分枝杆菌种的对象的淋巴细胞。
31.如权利要求30所述应用，其特征在于，血液和蛋白质间的孵育在试管中进行。
32.如权利要求30或31所述应用，其特征在于，孵育需要在肝素的存在下进行。
33.如权利要求30或31所述应用，其特征在于，孵育在所添加的碳水化合物的存在下进行。
34.如权利要求30所述应用，其特征在于，孵育在选自ESAT6、CFP10、TB7.7和PPD或其混合物的分枝杆菌蛋白质的存在下进行。
35.如权利要求30所述应用，其特征在于，所述分枝杆菌种是结核分枝杆菌。
36.如权利要求30所述的应用，其特征在于所述对象是人。
37.如权利要求30所述的应用，其特征在于所述对象是非人类的动物。
38.如权利要求30所述应用，其特征在于，所述效应分子选自干扰素-γ、细胞因子、白介素和TNF-α。
39.如权利要求30所述应用，其特征在于，所述效应分子是干扰素-γ。
40.对权利要求24所述蛋白质或权利要求25所述肽有特异性的经分离的抗体的混合物。
41.ESAT6、CFP10、TB7.7和/或PPD中的一种或多种以及来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物在制备用于体外诊断对象中结核分枝杆菌感染的试剂盒中的应用，所述混合物由TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL组成，其中结核分枝杆菌检测的灵敏度和/或选择性水平高于仅使用ESAT6、CFP10、TB7.7和/或PPD中的一种或多种的灵敏度和/或选择性。
42.来自分枝杆菌种或相关微生物并包含至少一个T-细胞表位的蛋白质的混合物在制备用于体外评估对象获得细胞介导的免疫应答能力的试剂盒中的应用，所述混合物由TAWITAVVPGLMV、ELMARAAVLGSAH、RPVRRVLLFVVPSSGPAP、GSVRQLPSVLKPPLITLRTLTLSG、GEIIFISGRLNGaa和AVIVRSELLTQYL组成，经一段时间并在充足条件下刺激淋巴细胞产生效应分子，其中效应分子的存在或水平指示所述对象获得细胞-介导的免疫应答的能力。
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