CN116482361B - 一种检测结核感染状态的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种检测结核感染状态的试剂、试剂盒及应用。通过检测经抗原ESAT‑6和/或抗原Rv1733c SLP刺激后趋化因子IP‑10和/或CXCL‑1的分泌量，实现了对ATB的诊断以及对ATB与LTBI的鉴别诊断。具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度，对于提高治愈率、改善预后、降低传播风险具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种检测结核感染状态的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
结核潜伏感染者（LTBI）数量庞大，有5%-10%的潜伏感染者将会发展为活动性结核病（ATB），鉴别诊断ATB和LTBI对于提高治愈率、改善预后、降低传播风险具有重要的意义。
目前常用于检测结核感染状态的方法有结核菌素皮肤试验（TST试验）和γ-干扰素释放试验（IGRA）。其中国际上广泛应用的IGRA有两种方法：一种是QuantiFERON-TB GoldIn-Tube (QFT-GIT)，即采用酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA) 检测全血中致敏T细胞再次受到结核特异性抗原刺激后释放的IFN-γ水平。另一种是T-SPOT.TB，即采用酶联免疫斑点法 (Enzyme-linked Immunospot Assay, ELISPOT) 测定在结核特异性抗原刺激下，检测外周血单个核细胞 (Peripheral Blood MononuclearCells, PBMC) 中能够释放IFN-γ的T细胞数。
TST试验需在前臂内侧皮内注射结核菌素物质，在皮内注射后48-72小时内读取硬结横径的界限，需要患者反复往返医院，如未在规定时间内读取，可能要进行重复试验。而且卡介苗接种、非结核分枝杆菌感染会增加TST假阳性率，长期应用免疫抑制剂或免疫功能缺陷者则更有可能出现假阴性。另外，我国是个卡介苗接种大国，会影响TST试验的诊断结核的准确性。IGRA通过检测特异性T细胞在结核特异性抗原刺激下分泌γ-干扰素的水平，辅助诊断结核感染状态，虽然其读取结果无需患者亲自前往且不受卡介苗接种状态影响，但IGRA试验无法鉴别ATB和LTBI，在临床诊断ATB时特异性不高。
发明内容
针对现有方法存在的不足，本发明提供了一种检测结核感染状态的试剂、试剂盒及应用。该发明通过检测经抗原ESAT-6和/或抗原Rv1733c SLP刺激后趋化因子IP-10和/或CXCL-1的分泌量，可实现对ATB的诊断以及对ATB与LTBI的鉴别。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测结核感染状态的试剂，所述试剂为检测抗原刺激下趋化因子IP-10和/或CXCL-1分泌量的试剂。
进一步，所述抗原为结核特异性毒力抗原ESAT-6和/或结核潜伏相关抗原Rv1733cSLP。
第二方面，本发明提供了一种检测结核感染状态的试剂盒，所述试剂盒包括前文所述的试剂。
进一步，所述试剂盒还包括前文所述的抗原。
进一步，所述结核特异性毒力抗原ESAT-6为ESAT-6肽段库，含序列如SEQ IDNO.1-17所示的17条肽段；
所述结核潜伏相关抗原Rv1733c SLP为Rv1733c SLP肽段库，含序列如SEQ IDNO.18-31所示的14条肽段。
进一步，所述检测结核感染状态具体为诊断ATB和/或鉴别诊断ATB与LTBI。
第三方面，本发明提供了一种检测抗原ESAT-6和/或抗原Rv1733c SLP刺激下趋化因子IP-10和/或CXCL-1分泌量的方法，包括以下步骤：
步骤1，抗原ESAT-6和/或抗原Rv1733c SLP的制备；
步骤2，使用抗原ESAT-6和/或抗原Rv1733c SLP进行刺激；
步骤3，检测趋化因子IP-10和/或CXCL-1的分泌量。
进一步，所述步骤1的具体为：抗原ESAT-6和抗原Rv1733c SLP分别由如上表所示的肽段合成，制备抗原ESAT-6的每条肽段长15个氨基酸，两端重叠10个氨基酸，最终纯度≥95%；制备抗原Rv1733c SLP的每条肽段长28个氨基酸，两端重叠14个氨基酸，最终纯度≥80%。
进一步，所述步骤2的具体过程为：将样本全血与RPMI1640按1:2的体积比混合后，加入抗原ESAT-6和/或抗原Rv1733c SLP，使终浓度为10μg/ml，转移至37℃孵箱孵育16~20h，取上清液，10000 rpm离心2min，获得待检测的抗原刺激后样品。
第四方面，本发明提供了前文所述的试剂或前文所述的抗原在制备检测结核感染状态试剂盒中的应用
与现有技术相比本发明具有以下有点：
本发明通过检测经抗原ESAT-6和/或抗原Rv1733c SLP刺激后趋化因子IP-10和/或CXCL-1的分泌量，实现了对ATB的诊断以及对ATB与LTBI的鉴别诊断。用于诊断ATB时，受试者工作特征曲线下面积（AUC）、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别是0.961、90.0%、93.5%、85.7%、95.6%、13.8、0.11；用于鉴别诊断ATB与LTBI时，AUC、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别是0.932、85.0%、92.0%、89.5%、88.5%、10.63、0.16。具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度，对于提高治愈率、改善预后、降低传播风险具有重要的意义。
附图说明
图1为在没有特异性抗原刺激下的趋化因子分泌情况。
图2为抗原ESAT-6刺激下趋化因子的分泌情况。
图3为抗原Rv1733c SLP刺激下趋化因子的分泌情况。
图4为对活动性结核病的诊断ROC曲线。
图5为对活动性结核病与结核潜伏感染的鉴别诊断ROC曲线。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
为了评估本发明对ATB的诊断以及对ATB与LTBI的鉴别诊断效能，选用2022年2月至4月在北京协和医院和北京胸科医院的66名受试者，包括20名ATB患者（经病原学确证），25名结核病密切接触史的LTBI医务人员，同期住院的发热待查患者11名，以及10名来自于北京协和医学院的健康新生（已通过T-SPOT.TB和胸片排除结核感染）。
具体操作步骤如下：
一、肽段库合成
毒力因子ESAT-6肽段库含17条肽段，每条肽段长15个氨基酸，两端重叠10个氨基酸，潜伏相关抗原Rv1733c SLP肽段库含14条肽段，每条肽段长28个氨基酸，两端重叠14个氨基酸，两组肽段库均由北京中科亚光生物科技有限公司合成，其中ESAT-6的纯度≥95%，Rv1733c SLP肽段库纯度≥80%。详细的肽段序列如下表1所示。
表1 ESAT-6和Rv1733c SLP的肽段序列
二、抗原刺激
1. 采集6ml待测患者新鲜肝素抗凝静脉血，分装0.5ml/孔，共5孔至24孔细胞培养板。
2. 每孔加入RPMI1640 (含10%FBS、2%青霉素-链霉素)，以1：2的体积与全血混匀，分别加入ESAT-6和Rv1733c SLP (终浓度均为10μg/ml) 刺激，无抗原刺激对照加入等体积的RPMI1640，转移至37℃孵箱孵育16~20h。
3. 使用移液器吸取细胞培养板中的上清至1.5ml离心管，10000 rpm离心2min。
4. 离心后收集上清于-20℃冰箱冻存。
三、Luminex平台趋化因子检测
1.实验前准备工作：
将所有试剂恢复至室温.
洗液的准备：将25X Wash Buffer以去离子水稀释至1 X。
标准品的制备：混合标准品 (A\B\C)：保证标准品粉末在瓶底，根据试剂盒说明书将标准品A以RD21稀释液稀释至0.275ml，标准品B稀释至0.225ml，标准品C稀释至0.225ml。稀释后将标准品瓶子轻轻上下颠倒以及转动，确保无粉末残留，静置15-20min，将每种标准品的100μl与校准稀释剂RD6-52混合为标准1管，标准1管的最终体积将为1000μl(3种标准品+700μlRD6-52)。
标准品稀释：将200μl的校准品稀释剂RD6-52注入标记为2-7的6个试管中。标准品1稀释3倍至试管2，试管3-7同上。在下一次转移之前彻底混合各个试管。标准1作为高标准。校准品稀释剂RD6-52作为空白对照。
2.实验步骤
（1）黑色不透光96孔板，加样前用1x Wash Buffer洗板一次，200μl/孔，振荡器上振荡10分钟。
（2）倒掉孔内液体，并倒扣在吸水纸上轻拍，吸取多余液体。
（3）将50μlRD6-52血清基质加入空白孔。
（4）将50μl制备好的标准品按浓度由低到高加入标准品孔。
（5）将50μl样本加入到样本孔。
（6）振荡器上重悬混合微球，每孔加入50μl。每加几孔，再重悬一次，以免微球下沉。
（7）以封板膜密封96孔板，外包铝箔纸以避光，在800rpm的水平摇床孵育2小时。
（8）将96孔板放置于磁力分离板上，静置2分钟，使磁性微球被吸附于孔的底部。
（9）弃去孔内液体，去除磁力分离板。
（10）96孔板每孔加入1x Wash Buffer 100μl，静置1min后，放置磁力架上静置2min后去除磁力分离板。
（11）重复第9、10步，共清洗3次。
（12）加入Biotin标记的检测抗体50μl/孔，室温800rpm的水平摇床振荡孵育1小时。
（13）重复第8-10步，共清洗3次。
（14）加入PE标记的链霉亲和素50μl/孔，室温800rpm的水平摇床振荡孵育30min。
（15）重复第8-10步，共清洗3次。
（16）加入缓冲洗涤液100μl/孔，摇床孵育2分钟，重悬微球。
（17）Luminex 200仪器上进行检测。
四、结果分析
图1为趋化因子CXCL-1和IP-10在未刺激下的分泌量，可以看出：在没有特异性抗原的刺激下，CXCL-1的分泌量既无法区分出结核感染，又无法鉴别出ATB与LTBI；IP-10的分泌量在结核感染人群（ATB与LTBI）与健康人群间均存在差异（p＜0.05），但ATB患者中的IP-10的分泌量与发热患者相比没有差异，提示IP-10的分泌可能在感染性疾病中普遍存在。
图2为趋化因子CXCL-1和IP-10在ESAT-6刺激下的分泌量，可以看出：在ESAT-6的刺激下，CXCL-1的分泌量不仅在ATB与健康人群中存在显著差异（p＜0.05），同时在ATB与发热患者中也存在显著差异，而且ATB与LTBI之间也存在显著差异，提示CXCL-1在ESAT-6刺激下具有同时区分ATB和鉴别ATB与LTBI的潜能。IP-10的分泌量虽然在结核感染（ATB与LTBI）与健康人群中均存在显著差异（p＜0.05），但与发热患者相比没有差异，而且分泌量在ATB与LTBI人群中没有差异。
图3为趋化因子CXCL-1和IP-10在Rv1733c SLP刺激下的分泌量，可以看出：在Rv1733c SLP的刺激下，CXCL-1的分泌量不仅在ATB与健康人群中存在显著差异（p＜0.05），同时在ATB与发热患者中也存在显著差异（p＜0.05），而且ATB与LTBI之间也存在显著差异，提示CXCL-1在Rv1733c SLP刺激下具有同时区分ATB和鉴别诊断ATB与LTBI的潜能。IP-10的分泌量不仅在结核感染人群（ATB与LTBI）与健康人群中存在显著差异（p＜0.05），同时在结核感染人群与发热患者中也存在显著差异（p＜0.05），提示IP-10在Rv1733c SLP刺激下具有区分ATB的潜能，但在ATB与LTBI人群中的分泌量没有差异。
综合以上结果可得：可通过联合ESAT-6和Rv1733c SLP两种结核特异性抗原，并检测IP-10和CXCL-1两种趋化因子的分泌量，实现ATB的诊断以及ATB和LTBI的鉴别诊断。
五、诊断效能评价
为了进一步证明上述结论，本发明还进行了诊断效能评价
1、对ATB的诊断效能评价
共有ATB患者20人，非ATB患者46人，联合ESAT-6和Rv1733c SLP抗原刺激患者的外周血，检测IP-10和CXCL-1的分泌量，结果表明用于诊断ATB时，AUC、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别是0.961、90.0%、93.5%、85.7%、95.6%、13.8、0.11。
2、对ATB与LTBI的鉴别诊断效能评价
共有ATB患者20人，LTBI患者25人，联合ESAT-6和Rv1733c SLP抗原刺激患者的外周血，检测IP-10和CXCL-1的分泌量，结果表明用于鉴别ATB与LTBI时，AUC、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别是0.932、85.0%、92.0%、89.5%、88.5%、10.63、0.16。
综上，通过检测经抗原ESAT-6和抗原Rv1733c SLP刺激后趋化因子IP-10和CXCL-1的分泌量，对诊断ATB和鉴别ATB与LTBI具有较高的诊断效能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但对于本领域的普通技术人员来说，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种检测结核感染状态的试剂，其特征在于：所述试剂为检测抗原刺激下趋化因子IP-10和CXCL-1分泌量的试剂；所述抗原为结核特异性毒力抗原ESAT-6和结核潜伏相关抗原Rv1733c SLP；所述检测结核感染状态具体为诊断活动性结核病和/或鉴别诊断活动性结核病与结核潜伏感染。
2.一种检测结核感染状态的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的试剂；所述检测结核感染状态具体为诊断活动性结核病和/或鉴别诊断活动性结核病与结核潜伏感染。
3.根据权利要求2所述的检测结核感染状态的试剂盒，其特征在于：所述结核特异性毒力抗原ESAT-6为ESAT-6肽段库，含序列如SEQ ID NO.1-17所示的17条肽段；
；
所述结核潜伏相关抗原Rv1733c SLP为Rv1733c SLP肽段库，含序列如SEQ ID NO.18-31所示的14条肽段。
4.权利要求1所述的试剂在制备检测结核感染状态试剂盒中的应用，其特征在于：所述检测结核感染状态具体为诊断活动性结核病和/或鉴别诊断活动性结核病与结核潜伏感染。
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