CN103398962A - 液态乳中乳糖含量的测定方法 - Google Patents

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CN103398962A CN2013103467158A CN201310346715A CN103398962A CN 103398962 A CN103398962 A CN 103398962A CN 2013103467158 A CN2013103467158 A CN 2013103467158A CN 201310346715 A CN201310346715 A CN 201310346715A CN 103398962 A CN103398962 A CN 103398962A
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张红发
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Abstract

本发明公开了一种液态乳中乳糖的测定方法，包括以下步骤：（1）将液态乳、氢氧化钡溶液和硫酸锌溶液混合均匀，在2000G-2500G的速度下离心2min-5min，得上清液；所述的液态乳、氢氧化钡和硫酸锌的质量比为（1：0.1：0.4）-（1：0.15：0.8）；（2）将步骤（1）中得到的上清液与发色剂混合均匀，经标准曲线法测定，即可；发色剂为苯酚溶液、氢氧化钠溶液、2，4，6-三硝基苯酚溶液和硫酸氢钠溶液；苯酚、氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠和液态乳的质量比为（1：10：2：1：3）-（1：10：2：1：1.5）。该测定方法简单方便，易操作，精密度高，易于工业化大规模利用。

Description

液态乳中乳糖含量的测定方法
技术领域
本发明涉及液态乳中乳糖含量的测定方法。
背景技术
乳糖在自然界中只存在于哺乳动物的乳中，是生乳、灭菌乳和巴氏杀菌乳等液体乳中重要的营养成分，也是其主要的特征指标之一。目前可行的乳糖测定方法有多种。其中，国家规定的食品安全国家标准方法有GB5413.5-2010《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》，另外还有出入境检验检疫行业标准SN/T0871-2000《进出口乳及乳制品中乳糖的测定方法》。
《进出口乳及乳制品中乳糖的测定方法》的测定是针对乳粉等乳固体物质，但对生乳、灭菌乳、巴氏杀菌乳等液体乳中乳糖的检测结果极低甚至无法检出。实际操作中，该方法检测出生乳的乳糖含量测定结果非常低，通常在1.5-2.3g/100g，有些样品甚至在分光光度计读不出吸光值，而这些与实际情况（即一般原料乳乳糖含量应在4.6g/100g以上）是极不相符。可见《进出口乳及乳制品中乳糖的测定方法》不适用于液态乳中的乳糖测定。
而《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》虽然可以同时测定乳粉和液态乳中的乳糖，但是其使用的是高效液相色谱法和莱因-埃农氏法。高效液相色谱法利用高效液相色谱柱分离样品中的乳糖并利用示差折光或蒸发光散射检测器进行测定，该方法虽然快速灵敏，但对仪器要求高、且费用高、难以大规模普及。莱因-埃农氏法则是利用乳糖的还原性与费林氏液发生氧化还原反应，以次甲基蓝为指示剂，在加热的条件下采用直接滴定法测得乳糖含量。氧化还原滴定法反应机理复杂，试剂配制繁琐费时，滴定终点判断干扰因素较多，操作具有一定难度。
现有技术中，还可使用直接滴定法、旋光法、（近）红外光谱法、毛细管电泳法对液态乳中的乳糖进行测定，但是直接滴定法精密度低，操作繁琐，已经基本不再使用；旋光法、红外光谱法和毛细管电泳法限于仪器设备的要求，且方法的精密度或准确性存在提高的空间。上述种种问题都限制了液态乳中乳糖的测定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中一般只能对乳粉中乳糖进行测定，而液态乳中乳糖测定方法要求高、费用高、难以大规模普及，精密度和准确性低，操作繁琐等缺陷，提供一种液态乳中乳糖含量的测定方法。该测定方法简单方便，易操作，精密度高，易于工业化大规模利用。
本发明的目的在于提供一种液态乳中乳糖的测定方法，所述的测定方法包括以下步骤：
（1）将液态乳、氢氧化钡溶液和硫酸锌溶液混合均匀，在2000G-2500G的速度下离心2min-5min，得上清液；其中，所述的液态乳、所述的氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和所述的硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为（1：0.1：0.4）-（1：0.15：0.8）；
（2）将步骤（1）中得到的上清液与发色剂混合均匀，经标准曲线法测定，即可；所述的发色剂为苯酚溶液、氢氧化钠溶液、2，4，6-三硝基苯酚溶液和硫酸氢钠溶液；所述的苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和所述的液态乳的质量比为（1：10：2：1：3）-（1：10：2：1：1.5）。
本发明中，所述的液态乳为本领域常规的液态乳，较佳的为牛乳。所述的液态乳一般包括以下成分：水、脂肪、蛋白质、乳糖和无机盐。较佳的，所述的牛乳中的成分及其含量如表1所示。
表1牛乳的成分及其含量（单位：%）
组分 平均组成 组成范围 干物质中平均组成
水 87.3 85.5-88.7 —
非脂乳固体 8.8 7.9-10.0 69
乳糖 4.6 3.8-5.3 36
脂肪 3.9 2.4-5.5 31
蛋白质 3.25 2.3-4.4 26
酪蛋白 2.6 1.7-3.5 20
无机盐 0.65 0.53-0.80 5.1
有机酸 0.18 0.13-0.22 1.4
其他 0.14 — 1.1
其中，平均组成为不同地区、不同时期和不同种类的牛乳所含营养物质（即各组分）的平均值（单位：%）；组成范围为不同地区、不同时期和不同种类的牛乳所含营养物质（即各组分）的最高值与最低值之间的范围（单位：%）；干物质中平均组成为牛乳中除去水分之外的营养物质（即各组分）占除去水分之外的营养物质总量的平均值（单位：%）。
本发明中，所述的液态乳可以为生乳、灭菌乳和巴氏杀菌乳中的一种或多种。
步骤（1）中，所述的液态乳、所述的氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和所述的硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比较佳的为（1：0.1：0.4）-（1：0.14：0.56）。
步骤（1）中，所述的离心的速度较佳的为2000G；所述的离心的时间较佳的为3min-5min，更佳的为3min。
步骤（1）中，所述的氢氧化钡溶液的浓度较佳的为2.5%-3.75%，更佳的为2.5%-3.75%，进一步更佳的为2.5%，所述百分比为质量百分比。
步骤（1）中，所述的硫酸锌溶液的浓度较佳的为2.5%-5%，更佳的为2.5%-3.75%，进一步更佳的为2.5%，所述百分比为质量百分比。
步骤（2）中，所述的标准曲线法测定的方法为本领域常规的标准曲线法计算的方法。较佳的，所述的标准曲线法测定的方法包括以下步骤：用标准品配制标准工作液，分别测定不同体积的标准工作液的吸光度，用吸光度对标准工作液中样品的质量绘制标准曲线，再在相同的测量条件下测量待测样品的吸光度，根据待测样品的吸光度和标准曲线计算待测样品的质量，并计算其含量。更佳的，所述的标准曲线法测定的方法包括以下步骤：用乳糖标准品配制乳糖标准工作液待用，取六份体积为V1-V6（其中含乳糖标准品M1-M6，M1-M6的值均不等，较佳的按照梯度变化）的乳糖标准工作液，测定其吸光度，记作A1-A6；根据M1-M6和A1-A6绘制标准曲线，再在相同的测量条件下，测量待测乳糖样品的吸光度，根据待测乳糖样品的吸光度和标准曲线计算待测乳糖样品的质量，并计算其含量。
步骤（2）中，所述的苯酚溶液的浓度较佳的为1%-2%，更佳的为1%，所述百分比为质量百分比。
步骤（2）中，所述的氢氧化钠溶液的浓度较佳的为5%-10%，更佳的为5%，所述百分比为质量百分比。
步骤（2）中，所述的2，4，6-三硝基苯酚溶液又名苦味酸溶液；所述的2，4，6-三硝基苯酚溶液的浓度较佳的为1%-2%，更佳的为1%，所述百分比为质量百分比。
步骤（2）中，所述的硫酸氢钠溶液的浓度较佳的为1%-2%，更佳的为1%，所述百分比为质量百分比。
较佳的，步骤（1）中，所述的混合均匀后，水浴加热，并冷却至室温。所述的水浴加热较佳的为沸水浴加热。按照本领域常规，所述的沸水浴加热的沸水为100℃的水。所述的水浴加热的时间较佳的为6min。所述的冷却的时间较佳的为1min-3min，更佳的为3min。所述的室温的温度为15℃-25℃。
所述的吸光度的测定使用紫外分光光度计进行。所述的吸光度的测定波长较佳的为515nm-524nm，更佳的为520nm。
本发明中，所述的乳糖标准样品为本领域常规的乳糖标准样品。较佳的，所述的乳糖标准样品的纯度≥99.5%。使用前，较佳的，乳糖标准样品在70℃真空烘箱中烘至恒重。所述的乳糖标准品的为购于国药集团化学试剂有限公司的α-乳糖（分析纯，AR）。
本发明中，所述的乳糖标准工作液的浓度为1mg/mL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的液态乳中乳糖含量的测定方法拓展了SN/T0871-2000中分光光度法只适用于测定乳粉中乳糖含量的适用范围，简单方便，易操作，精密度高，结果准确，成本低廉，特别适合工业化生产或大批量样品的快速检出。
附图说明
图1为实施例1的方法检测得到的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：2.5%的氢氧化钡溶液和2.5%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：1%的苯酚溶液、5%的氢氧化钠溶液、1%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和1%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取4.9252g样品（生乳），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.1：0.4，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2000G的离心力离心3min，取上层澄清液供测定用。
移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温20℃，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，绘制乳糖质量标准曲线图，如图1所示。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.1007X-0.0004
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：3。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0622，按照标准曲线计算出测定待测样品中乳糖质量m1为0.622mg，通过计算得到生乳中乳糖含量为5.05g/100g。
实施例2
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：3.75%的氢氧化钡溶液和5%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：1%的苯酚溶液、5%的氢氧化钠溶液、1%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和1%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取5.0021g样品生乳，用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.15：0.8，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2500G的离心力离心5min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，按上述步骤加入沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.1007X-0.0004
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：3。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0563，按照标准曲线计算出测定待测样品中乳糖质量m1为0.5630mg，通过计算得到生乳中乳糖含量为4.50g/100g。
实施例3
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：3.5%的氢氧化钡溶液和3.5%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：2%的苯酚溶液、10%的氢氧化钠溶液、2%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和10%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取4.9252g样品（生乳A），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.14：0.56，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2300G的离心力离心2min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.1012X-0.0006
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：1.5。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0622，按照标准曲线计算出测定待测样品中乳糖质量m1为0.620mg，通过计算得到生乳A中乳糖含量为5.04g/100g。
实施例4
生乳B：
称取4.9460g生乳B（m2），根据本发明方法测得样液吸光值为0.0558，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.567mg（m1），通过计算得到生乳B中乳糖含量为4.59g/100g。
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：3.75%的氢氧化钡溶液和3.75%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：1.5%的苯酚溶液、7.5%的氢氧化钠溶液、1.5%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和1.5%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取4.9460g样品（生乳），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.15：0.6，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2000G的离心力离心3min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.0996X-0.0007
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：2。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0558，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.567mg（m1），通过计算得到生乳B中乳糖含量为4.59g/100g。
实施例5
灭菌乳C：
称取5.0255g灭菌乳C（m2），根据本发明方法测得样液吸光值为0.0631，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.631mg（m1），通过计算得到灭菌乳C中乳糖含量为5.02g/100g。
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：3%的氢氧化钡溶液和3%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：1%的苯酚溶液、5%的氢氧化钠溶液、1%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和1%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取5.0255g样品（灭菌乳），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.12：0.48，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2250G的离心力离心4min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.1007X-0.0004
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：3。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0631，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.631mg（m1），通过计算得到灭菌乳C中乳糖含量为5.02g/100g。
实施例6
灭菌乳D：
称取5.0190g灭菌乳D（m2），根据本发明方法测得样液吸光值为0.0659，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.657mg（m1），通过计算得到灭菌乳D中乳糖含量为5.24g/100g。
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：2.5%的氢氧化钡溶液和2.5%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：2%的苯酚溶液、2%的氢氧化钠溶液、10%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和2%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取5.0190g样品（灭菌乳），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.1：0.4，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2000G的离心力离心3min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.1012X-0.0006
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：1.5。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0659，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.657mg（m1），通过计算得到灭菌乳D中乳糖含量为5.24g/100g。
实施例7
巴氏杀菌乳E：
称取5.0249g巴氏杀菌乳E（m2），根据本发明方法测得样液吸光值为0.0681，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.691mg（m1），通过计算得到生乳A中乳糖含量为5.50g/100g。
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：2.5%的氢氧化钡溶液和2.5%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：1.5%的苯酚溶液、7.5%的氢氧化钠溶液、1.5%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和1.5%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取5.0249g样品（巴氏杀菌乳），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.1：0.4，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2000G的离心力离心3min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.0996X-0.0007
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：2。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0681，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.691mg（m1），通过计算得到巴氏杀菌乳E中乳糖含量为5.50g/100g。
实施例8
巴氏杀菌乳F：
称取4.9758g巴氏杀菌乳F（m2），根据本发明方法测得样液吸光值为0.0632，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.632mg（m1），通过计算得到巴氏杀菌乳F中乳糖含量为5.08g/100g。
（1）配制溶液
乳糖标准工作液的配制：准确称取于70℃真空烘箱中烘至恒重的适量的乳糖标准品（纯度≥99.5%），加水溶解后，移入容量瓶中，稀释至刻度，配成浓度为1mg/mL的标准工作液。
沉淀剂：3.75%的氢氧化钡溶液和3.75%的硫酸锌溶液，所述百分比均为质量百分比。
发色剂：1%的苯酚溶液、5%的氢氧化钠溶液、1%的2，4，6-三硝基苯酚溶液和1%的硫酸氢钠溶液，所述百分比均为质量百分比。
（2）待测样品和空白样品处理
称取4.9758g样品（巴氏杀菌乳），用水稀释移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。准确移取2.5mL于离心管中，加入沉淀剂，液态乳、氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为1：0.15：0.6，用小玻璃棒轻轻搅匀后，以2250G的离心力离心4min，取上层澄清液供测定用。移取2.5mL蒸馏水于离心管中，加入相同的沉淀剂，离心后取上清，得到空白液。
（3）绘制标准曲线
移取乳糖标准工作液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL，分别置于25mL比色管中，加入发色剂，0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL的乳糖标准工作液中发色剂与乳糖的质量比为：苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和乳糖标准工作液中的乳糖的质量比依次分别为（1：10：2：1：0.048）、（1：10：2：1：0.096）、（1：10：2：1：0.144）、（1：10：2：1：0.192）和（1：10：2：1：0.24）。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以不加乳糖标准工作液的空白液调零，于波长520nm处测定吸光值。
乳糖质量M与吸光度A的标准曲线方程为：
Y=0.1007X-0.0004
其中，X为乳糖的质量（mg），Y为吸光度的值。
（4）样品浓度的测定
准确移取0.5mL样液和空白液分别置于25mL比色管中，加入发色剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：3。塞紧塑料塞，沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，用蒸馏水稀释至刻度。摇匀，以样品空白液调零，于波长520nm处测定吸光值，从标准曲线图中得到样品中乳糖质量。根据下式计算乳糖含量：
X = m 1 m 2 × 40
式中：X-样品中乳糖含量，g/100g；
m1-测定用样液中乳糖的质量，mg；
m2-样品质量，g。
本实施例中，检测得到的待测样品的吸光度为0.0632，按照标准曲线计算出测定用样液中乳糖质量为0.632mg（m1），通过计算得到巴氏杀菌乳F中乳糖含量为5.08g/100g。
效果实施例1
精密度检测。
重复进行实施例2中的操作9次，得到每次的测量结果，以计算相对标准偏差（RSD），结果见表2。
表2乳糖测定方法重复性实验结果
Figure BDA00003642723900191
对实施例2的方案进行重复性实验测定乳糖含量，得到的RSD值为1.22%，本发明的技术方案相对误差较小，稳定性较好，具有良好的精密度和重现性。
效果实施例2
沉淀剂添加量对样品吸光度的影响。
乳糖测定方法中常用的沉淀蛋白试剂有三氯乙酸、乙酸锌-亚铁氰化钾、硫酸锌-氢氧化钡等。但是，三氯乙酸对人体具一定刺激，且后续处理中的高温水浴步骤可能会提高其使用危险性；而乙酸锌-亚铁氰化钾引入的Fe2+及其氧化生成的Fe3+等带色离子会影响样品体系吸光值，从而影响测量结果，因此采用硫酸锌-氢氧化钡作为沉淀剂。
实验条件参数如下：
同一液体乳样品7份，分别加入不同质量比的氢氧化钡及硫酸锌沉淀剂，其中苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：3；2000G的离心力离心3min；沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，于波长520nm处测定吸光值。每个样品平行测定3次取平均值，结果见表3。
表3沉淀剂使用量对吸光值的影响
液态乳：氢氧化钡： 吸光度
硫酸锌的质量比 第一次测试 第二次测试 第三次测试 平均值
1：0.08：0.32 0.0377 0.0378 0.0379 0.0378
1：0.1：0.4 0.0551 0.0550 0.0551 0.0551
1：0.12：0.48 0.0553 0.0553 0.0553 0.0553
1：0.14：0.56 0.0553 0.0554 0.0554 0.0554
1：0.15：0.6 0.0553 0.0552 0.0551 0.0552
1：0.15：0.8 0.0551 0.0551 0.0551 0.0551
1：0.16：0.64 浑浊 浑浊 浑浊 /
1：0.18：0.72 浑浊 浑浊 浑浊 /
1：0.2：0.8 浑浊 浑浊 浑浊 /
如表3所示：当沉淀剂使用量过少时，沉淀蛋白质不完全，造成乳糖损失，吸光值偏小；沉淀剂使用量过大时，沉淀过量，形成发色浑浊现象，影响吸光度的测定。由表3可知：当液态乳：氢氧化钡：硫酸锌的质量比在（1：0.1：0.4）-（1：0.15：0.8）内时，可以进行吸光度的正常测定。
效果实施例3
不同的离心力与离心时间对样品检测的影响。
实验条件参数如下：
液态乳：氢氧化钡：硫酸锌的质量比为1：0.1：0.4；苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为1：10：2：1：3；沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，于波长520nm处测定吸光值。每个样品平行测定3次取平均值，结果见表4。
表4离心力与离心时间对样品吸光值的影响
Figure BDA00003642723900201
注：“-”表示吸光值无法正常显示。
如表4所示：离心力对吸光度的结果影响最大，其次是离心时间。当离心力较低时，样品中的沉淀不足以沉积在底部，悬浮于体系中，进而影响上清液的分光光度测定，造成结果不准确甚至无法读出。由表4可知：离心力在2000G-2500G，离心时间3min-5min时，能够实现较好的技术效果。
效果实施例4
发色剂使用量对样品吸光值的影响。
实验条件参数如下：
液态乳：氢氧化钡：硫酸锌的质量比为1：0.1：0.4；2000G的离心力离心3min；沸水浴加热6min后，流动冷水在3min内冷却至室温，于波长520nm处测定吸光值。每个样品平行测定3次取平均值，结果见表5。
表5发色剂使用量对吸光值的影响
Figure BDA00003642723900211
如表5所示：当发色剂的添加量满足苯酚：氢氧化钠：2，4，6-三硝基苯酚：硫酸氢钠：液态乳的质量比为（1:10:2:1:3）-（1:10:2:1:1.5）范围内时，吸光度可以满足测量的要求。而质量比不在上述范围内，发色效果不明显，无法得到较好的技术效果。
效果实施例5
加标回收率实验：
实验条件参数如效果实施例1。
回收率的测量方法：在生乳样品中加入乳糖标样测定的加标回收率，每份生乳样品均为5g（精确到0.0001g），分别加入0.025g、0.05g和0.10g（精确到0.0001g）的乳糖标准样品，即加标量分别为0.5g/100g、1g/100g、2g/100g。分别检测生乳中乳糖含量以及加入了乳糖标准样的生乳中的乳糖含量。通过二者的差值得到实际测得的加标量。用该加标量与计算的加标量比较，得到加样回收率的实验结果。
检测结果见表5。
表5乳糖测定方法加标回收率实验结果
Figure BDA00003642723900221
使用本技术发明测得的液体乳乳糖含量加标回收率为99.24%-100.76%（加标量为0.5-2g/100g），测定结果与实际相符，相对误差较小，本发明的技术方案具有较好的准确性。

Claims (10)

1.一种液态乳中乳糖的测定方法，其特征在于：所述的测定方法包括以下步骤：
（1）将液态乳、氢氧化钡溶液和硫酸锌溶液混合均匀，在2000G-2500G的速度下离心2min-5min，得上清液；其中，所述的液态乳、所述的氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和所述的硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比为（1：0.1：0.4）-（1：0.15：0.8）；
（2）将步骤（1）中得到的上清液与发色剂混合均匀，经标准曲线法测定，即可；所述的发色剂为苯酚溶液、氢氧化钠溶液、2，4，6-三硝基苯酚溶液和硫酸氢钠溶液；所述的苯酚溶液中的苯酚、氢氧化钠溶液中的氢氧化钠、2，4，6-三硝基苯酚溶液中的2，4，6-三硝基苯酚、硫酸氢钠溶液中的硫酸氢钠和所述的液态乳的质量比为（1：10：2：1：3）-（1：10：2：1：1.5）。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的液态乳为生乳、灭菌乳和巴氏杀菌乳中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的液态乳、所述的氢氧化钡溶液中的氢氧化钡和所述的硫酸锌溶液中的硫酸锌的质量比较佳的为（1：0.1：0.4）-（1：0.14：0.56）。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的离心的速度为2000G；所述的离心的时间为3min-5min，更佳的为3min。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的氢氧化钡溶液的浓度为2.5%-3.75%，较佳的为2.5%-3.75%，更佳的为2.5%，所述百分比为质量百分比；
步骤（1）中，所述的硫酸锌溶液的浓度为2.5%-5%，较佳的为2.5%-3.75%，更佳的为2.5%，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的标准曲线法测定的方法包括以下步骤：用乳糖标准品配制乳糖标准工作液待用，取六份体积为V1-V6的乳糖标准工作液，测定吸光度，记作A1-A6，六份体积为V1-V6的乳糖标准工作液中含乳糖标准品的量分别为M1-M6，M1-M6的值均不等；根据M1-M6和A1-A6绘制标准曲线，再在相同的测量条件下，测量待测乳糖样品的吸光度，根据待测乳糖样品的吸光度和标准曲线计算待测乳糖样品的质量，并计算其含量。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的苯酚溶液的浓度为1%-2%，较佳的为1%，所述百分比为质量百分比；
步骤（2）中，所述的氢氧化钠溶液的浓度为5%-10%，较佳的为5%，所述百分比为质量百分比；
步骤（2）中，所述的2，4，6-三硝基苯酚溶液的浓度为1%-2%，较佳的为1%，所述百分比为质量百分比；
步骤（2）中，所述的硫酸氢钠溶液的浓度为1%-2%，较佳的为1%，所述百分比为质量百分比。
8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的混合均匀后，水浴加热，并冷却至15℃-25℃。
9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于：所述的水浴加热为沸水浴加热；所述的水浴加热的时间为6min；所述的冷却的时间为1min-3min，较佳的为3min。
10.如权利要求6所述的测定方法，其特征在于：所述的吸光度的测定使用紫外分光光度计进行；所述的吸光度的测定波长为515nm-524nm，较佳的为520nm；
所述的乳糖标准样品的纯度≥99.5%；使用前，乳糖标准样品在70℃真空烘箱中烘至恒重；所述的乳糖标准工作液的浓度为1mg/mL。
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