CN103884667A - 一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法 - Google Patents

一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法。包括以下步骤：（1）枸杞提取液的预处理；（2）还原糖和总糖供试液的制备；（3）标准曲线的制备；（4）还原糖和总糖供试液参比溶液的制备；（5）测定还原糖和总糖供试品溶液的吸光度，查标准曲线，计算多糖含量。本发明采用醋酸铅对枸杞提取液进行预处理，脱蛋白后的溶液透明澄清，适合光度法测定；同时，参比溶液的制备方法既扣除了显色剂的吸收，也消除了枸杞色素的影响。本发明的测定方法不需要脱除还原糖，也无需制备成固体粗多糖再测定，解决了苯酚-硫酸法易受还原糖影响的问题，提高了操作的安全性。本发明的方法快速、准确度高、重现性良好，适合大规模工业化生产的质量控制。

Description

一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法
技术领域
本发明涉及中药及其提取物的化学分析技术领域，特别涉及一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法。
背景技术
枸杞中的主要生物活性物质之一是枸杞多糖。枸杞多糖含量的测定对于枸杞多糖的提取工艺具有十分重要的指导意义。目前，常用的多糖测定方法主要有色谱法和比色法。色谱法的成本较高。而且由于糖类本身没有足够的挥发性，一般需将其转化为挥发性衍生物才能进行，使得操作步骤繁杂。比色法的成本相对较低、比较实用，适合作为提取工艺过程的质量控制方法。因此，国标法测定枸杞中多糖含量采用的是苯酚-硫酸法（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T18672-2002枸杞（枸杞子）.北京:中国标准出版社,2002.），其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生的单糖在强酸条件下与苯酚反应生成有色的衍生物。查阅文献可知，该方法的应用对象主要有两大类：第一类是脱除还原糖后的水提液（高洪霞,刘军海,李广录.枸杞多糖提取工艺的研究.食品与机械,2008,24(5):60-62,72.），缺点是脱除还原糖的步骤耗时较长，而还原糖如果脱除不彻底会导致测定结果偏高；第二类是固体粗多糖（黄文书,杨海燕,李焕荣等.枸杞多糖的脱色工艺.食品研究与开发,2008,29(3):95-98），缺点是粗多糖的制备需要更长的测定周期，而且测定时需要重新溶解粗多糖，可能会因为粗多糖纯度不够产生浑浊，从而影响光度测定。同时，苯酚-硫酸法还存在一些问题，如苯酚需要重蒸、浓硫酸腐蚀性强，对操作者和设备有潜在的危险，而且操作方式的不同常导致测定结果的重现性较差，甚至会造成多糖碳化等现象。
发明内容
本发明的目的是针对目前枸杞多糖含量测定方法所存在的不足，提供一种准确、快速地测定枸杞提取液中的多糖含量的方法。本发明的测定方法特别适合直接测定以水为溶媒的各种提取工艺得到的枸杞提取液中的多糖，也适合测定枸杞粗多糖固体溶解后的水溶液。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法，包括以下步骤：
（1）枸杞提取液的预处理：
准确吸取V mL的枸杞多糖提取液，加入Pb(Ac)2溶液除蛋白，至沉淀完全为止，加入Na2SO4溶液除铅，定容至50mL；过滤后定容至100mL。
（2）供试液的制备：
a.准确吸取步骤（1）获得的溶液20mL，定容至50mL，得还原糖供试液；
b.准确吸取步骤（1）获得的溶液20mL，加入10mL（1+1）的盐酸，水解充分后滴加酚酞指示剂，用NaOH溶液调至中性，定容，得总糖供试液。
（3）标准曲线的制备：
a.配制1mg/mL葡萄糖标准溶液和4mg/mL葡萄糖标准溶液；
b.以3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠和丙三醇为原料制备DNS显色剂；
c.分别取1mg/mL葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL，再分别取4mg/mL葡萄糖标准溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL，依次加入不同体积的水，保持水和葡萄糖的总体积为2.0mL，再依次分别加入3.0mL DNS显色剂，沸水浴5min后取出，冷却，定容至25mL，用光程为1cm的比色皿，以试剂空白溶液为参比在540nm处测定各标准待测液的吸光度值，以葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）枸杞提取液中多糖含量的测定和计算
a.还原糖供试液的参比液的制备：取一只25mL比色管，分别加1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，沸水浴中加热5min后，流水冷却，再加入按照（2）中步骤制备的还原糖供试液1.0mL，定容至25mL，即可得到还原糖供试液的参比液；
b.总糖供试液的参比液的制备：取一只25mL比色管，分别加1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，沸水浴中加热5min后，流水冷却，再加入按照（2）中步骤制备的总糖供试液1.0mL，定容至25mL，即可得总糖供试液的参比液；
c.测定供试液中的还原糖浓度：取一只25mL比色管，分别加入1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，再加入1.0mL还原糖供试液，沸水浴5min后流水冷却，定容至25mL；用光程为1cm的比色皿，以还原糖供试液的参比液做参比在540nm处进行测定，测得A还原糖，查标准曲线得到还原糖浓度（c还原糖）；
d.测定供试液中的总糖浓度：取一只25mL比色管，分别加入1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，再加入1.0mL总糖供试液，沸水浴5min后流水冷却，定容至25mL；用光程为1cm的比色皿，以总糖供试液的参比液做参比在540nm处进行测定，测得A总糖，查标准曲线得到总糖浓度（c总糖）；
e.枸杞提取液中多糖含量的计算：供试液中总糖浓度和还原糖浓度相减可得到多糖浓度，枸杞提取液中的多糖含量计算公式如下：
Figure BDA0000493384890000031
式中：c总糖——总糖供试液的浓度；单位为μg/mL；
c还原糖——还原糖供试液的浓度；单位为μg/mL；
25.00——比色测定时的体积；单位为mL；
D——稀释倍数；
V——枸杞提取液的取样量，单位为mL；
X——枸杞提取液中枸杞多糖的含量，单位为mg/mL。
步骤（1）中所述的Pb(Ac)2溶液优选为20%Pb(Ac)2溶液，所述的Na2SO4溶液优选为10%Na2SO4溶液。
步骤（2）中所述的水解的条件优选为80℃水浴里水解15min；所述的NaOH溶液优选为30%NaOH溶液。
步骤（3）中所述的DNS显色剂的制备优选为：称取6.5g的3,5-二硝基水杨酸溶于少量热去离子水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL，贮于棕色瓶中，得到DNS显色剂。
本发明相对于现有技术有以下优点及效果：
1、本方法采用分别测定枸杞提取液中的总糖含量与还原糖含量，相减得到多糖含量的方法，在保证测定结果的准确度高、重现性好的前提下，不仅解决了苯酚-硫酸法易受还原糖影响的问题，也提高了可操作性和安全性。
2、枸杞多糖的提取一般是以水作为溶媒的，常见的有热水浸提法、超声法、酶法，本方法可直接对提取工艺中得到的枸杞多糖溶液进行测定，不需要脱除还原糖，也无需制备成粗多糖固体，因此，节省了步骤和试剂，实用性很强。此外，枸杞粗多糖直接溶解后得到的溶液也可以用此方法测定。
3、枸杞提取液一般含有果胶、蛋白等杂质而呈浑浊状，不利于光度法测定，本发明采用醋酸铅溶液进行预处理，处理后的溶液透明澄清，适合光度法测定。
4、选择在煮沸后的空白溶液中加枸杞提取液作为参比溶液，既扣除了显色剂的吸收，也消除了枸杞色素的影响，减少了测定误差。
5、本发明的方法快速、准确度高、重现性良好，适合大规模工业化生产的质量控制。
附图说明
图1是测定枸杞提取液中多糖含量的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方式做进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）枸杞提取液的预处理
准确吸取超声法提取枸杞多糖工艺得到的枸杞提取液8mL，加入20%Pb(Ac)2溶液除蛋白，至沉淀完全为止，加入10%Na2SO4溶液除铅，用去离子水定容至50mL；过滤后再用去离子水定容至100mL。
（2）供试液的制备
a.吸取步骤（1）获得的溶液20mL，用去离子水定容至50mL，得还原糖供试液。
b.吸取步骤（1）获得的溶液20mL，加入10mL（1+1）的盐酸，80℃水浴里水解15min，取出后迅速冷却至室温，滴加酚酞指示剂，用30%NaOH溶液调至中性，用去离子水定容至50mL，得总糖供试液。
（3）标准曲线的制备
a.准确称取105℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg溶于少量去离子水中，溶解后移入100mL容量瓶中，用去离子水定容至100mL，混匀，得到1mg/mL葡萄糖标准溶液。
b.准确称取105℃烘至恒重的分析纯葡萄糖400mg溶于少量去离子水中，溶解后移入100mL容量瓶中，用去离子水定容至100mL，混匀，得到4mg/mL葡萄糖标准溶液。
c.称取6.5g的3,5-二硝基水杨酸溶于少量热去离子水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后用去离子水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，得到3,5-二硝基水杨酸显色剂（DNS显色剂）。
d.分别取1mg/mL葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL，再分别取4mg/mL葡萄糖标准溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL，依次加入不同体积的水，保持水和葡萄糖的总体积为2.0mL，再依次分别加入3.0mL DNS显色剂，沸水浴5min后取出，冷却，去离子水定容至25mL，用光程为1cm的比色皿，以试剂空白溶液为参比在540nm处测定各标准待测液的吸光度值，以葡萄糖的浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光度（OD540）为纵坐标，绘制标准曲线，计算拟合得到回归方程为y=0.0062x-0.0038，R2=0.9991。
（4）枸杞提取液中多糖含量的测定和计算
a.还原糖供试液的参比液的制备：为了消除枸杞色素的影响，测定实际样品时参比溶液的制备方法如下：取一只25mL比色管，分别加1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，沸水浴中加热5min后，流水迅速冷却，再加入按照（2）中步骤制备的还原糖供试液1.0mL，去离子水定容至25mL，即可得到还原糖供试液的参比液；
b.总糖供试液的参比液的制备：同理，取一只25mL比色管，分别加1.0mL水和3.0mLDNS显色剂，沸水浴中加热5min后，流水迅速冷却，再加入按照（2）中步骤制备的总糖供试液1.0mL，去离子水定容至25mL，即可得总糖供试液的参比液；
c.测定枸杞提取液中的还原糖含量：取一只25mL比色管，分别加入1.0mL水和3.0mLDNS显色剂，再加入1.0mL还原糖供试液，沸水浴5min后流水迅速冷却，去离子水定容至25mL。用光程为1cm的比色皿，以还原糖供试液的参比液做参比在540nm处进行测定，测得A还原糖=0.318，查标准曲线得到还原糖浓度：c还原糖=51.90μg/mL。
d.测定枸杞提取液中的总糖含量：取一只25mL比色管，分别加入1.0mL水和3.0mLDNS显色剂，再加入1.0mL总糖供试液，沸水浴5min后流水迅速冷却，去离子水定容至25mL。用光程为1cm的比色皿，以总糖供试液的参比液做参比在540nm处进行测定，测得A总糖=0.341，查标准曲线得到总糖浓度：c总糖=55.61μg/mL。
e.枸杞提取液中多糖含量的计算：供试液中总糖浓度和还原糖浓度相减可得到多糖浓度，代入枸杞提取液中的多糖含量计算公式。根据计算公式可得8mL枸杞多糖提取液的中多糖含量为2.89mg/mL。
枸杞提取液中的多糖含量计算公式如下：
Figure BDA0000493384890000051
式中：c总糖——总糖供试液的浓度；单位为μg/mL；
c还原糖——还原糖供试液的浓度；单位为μg/mL；
25.00——比色测定时的体积；单位为mL；
D——稀释倍数；
V——枸杞提取液的取样量，单位为mL；
X——枸杞提取液中枸杞多糖的含量，单位为mg/mL。
（5）重现性试验：分别取按照步骤（2）方法制备得到的还原糖供试液、总糖供试液各5份，每份1mL，再按照步骤（4）依次测定吸光度，带入回归方程计算，可得枸杞提取液中的多糖含量（mg/mL）分别为2.90、2.89、2.91、2.88、2.92mg/mL，平均含量2.90mg/mL，RSD为0.55%，结果表明重复性较好。
（6）回收率试验：取样品，采用加样回收试验。具体做法如下，准确移取按照步骤（2）方法制备的还原糖试液和总糖试液各5份，每份1.0mL，分别加入1.0mg·mL-1的葡萄糖标液1.0mL，再按照步骤（4）依次测定吸光度，带入回归方程计算。结果如表1和表2所示，试验结果表明，本方法的回收率良好。
表1.还原糖回收率试验结果
Figure BDA0000493384890000061
表2.总糖回收率试验结果
实施例2
准确吸取热水浸提法得到的枸杞提取液20mL，定量检测方法同实施例1，测得还原糖供试液的吸光度值为0.632，总糖供试液的吸光度值为0.684，代入枸杞提取液中多糖含量的计算公式可得，多糖含量为2.62mg/mL。
实施例3
准确吸取酶法得到的枸杞提取液15mL，定量检测方法同实施例1，测得还原糖供试液的吸光度值为0.095，总糖供试液的吸光度值为0.142，代入枸杞提取液中多糖含量的计算公式，可得多糖含量为为3.16mg/mL。
上述实施例1～3仅仅是为了清楚地说明本发明的较佳的示例，不是对本发明的限制。凡在本发明范围的思想和原则之内，尤其是在技术方案范围之内，所作出的任何修改、等同替换或改进，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种测定枸杞提取液中多糖含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）枸杞提取液的预处理：
准确吸取V mL的枸杞多糖提取液，加入Pb(Ac)2溶液除蛋白，至沉淀完全为止，加入Na2SO4溶液除铅，定容至50mL；过滤后定容至100mL；
（2）供试液的制备：
a.吸取步骤（1）获得的溶液20mL，定容至50mL，得还原糖供试液；
b.吸取步骤（1）获得的溶液20mL，加入10mL（1+1）的盐酸，水解充分后滴加酚酞指示剂，用NaOH溶液调至中性，定容至50mL，得总糖供试液；
（3）标准曲线的制备：
a.配制1mg/mL葡萄糖标准溶液和4mg/mL葡萄糖标准溶液；
b.以3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠和丙三醇为原料制备DNS显色剂；
c.分别取1mg/mL葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL，再分别取4mg/mL葡萄糖标准溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL，依次加入不同体积的水，保持水和葡萄糖的总体积为2.0mL，再依次分别加入3.0mL DNS显色剂，沸水浴5min后取出，冷却，定容至25mL，用光程为1cm的比色皿，以试剂空白溶液为参比在540nm处测定各标准待测液的吸光度值，以葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
（4）枸杞提取液中多糖含量的测定和计算
a.还原糖供试液的参比液的制备：取一只25mL比色管，分别加1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，沸水浴中加热5min后，流水冷却，再加入按照（2）中步骤制备的还原糖供试液1.0mL，定容至25mL，即可得到还原糖供试液的参比液；
b.总糖供试液的参比液的制备：取一只25mL比色管，分别加1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，沸水浴中加热5min后，流水冷却，再加入按照（2）中步骤制备的总糖供试液1.0mL，定容至25mL，即可得总糖供试液的参比液；
c.测定供试液中的还原糖浓度：取一只25mL比色管，分别加入1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，再加入1.0mL还原糖供试液，沸水浴5min后流水冷却，定容至25mL；用光程为1cm的比色皿，以还原糖供试液的参比液做参比在540nm处进行测定，测得A还原糖，查标准曲线得到还原糖浓度（c还原糖）；
d.测定供试液中的总糖浓度：取一只25mL比色管，分别加入1.0mL水和3.0mL DNS显色剂，再加入1.0mL总糖供试液，沸水浴5min后流水冷却，定容至25mL；用光程为1cm的比色皿，以总糖供试液的参比液做参比在540nm处进行测定，测得A总糖，查标准曲线得到总糖浓度（c总糖）；
e.枸杞提取液中多糖含量的计算：供试液中总糖浓度和还原糖浓度相减可得到多糖浓度，枸杞提取液中的多糖含量计算公式如下：
Figure FDA0000493384880000021
式中：c总糖——总糖供试液的浓度；单位为μg/mL；
c还原糖——还原糖供试液的浓度；单位为μg/mL；
25.00——比色测定时的体积；单位为mL；
D——稀释倍数；
V——枸杞提取液的取样量，单位为mL；
X——枸杞提取液中枸杞多糖的含量，单位为mg/mL。
2.根据权利要求1所述的测定枸杞提取液中多糖含量的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的Pb(Ac)2溶液为20%Pb(Ac)2溶液，所述的Na2SO4溶液为10%Na2SO4溶液。
3.根据权利要求1所述的测定枸杞提取液中多糖含量的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的水解的条件为80℃水浴里水解15min。
4.根据权利要求1所述的测定枸杞提取液中多糖含量的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的NaOH溶液为30%NaOH溶液。
5.根据权利要求1所述的测定枸杞提取液中多糖含量的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的DNS显色剂的制备具体为：称取6.5g的3,5-二硝基水杨酸溶于少量热去离子水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL，贮于棕色瓶中，得到DNS显色剂。
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