CN103397026A

CN103397026A - miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别诊断标记物的应用及其试剂盒

Info

Publication number: CN103397026A
Application number: CN2013103228227A
Authority: CN
Inventors: 景在平; 周建; 董健; 陆清声; 赵志青; 包俊敏; 冯睿; 冯翔; 袁良喜
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-29
Also published as: CN103397026B

Abstract

miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别标记物的应用，其中，miR-23a的序列如SEQ ID NO.1所示。一种急性主动脉夹层鉴别试剂盒，其特征在于，具有：血浆总RNA提取试剂组、外源参照物、RNA逆转录试剂组、RNA逆转录引物组、实时定量PCR试剂组、实时定量PCR引物组和实时定量PCR探针组，其中，RNA逆转录引物组包括miR-23a逆转录引物和外源参照物逆转录引物，实时定量PCR引物组包括miR-23a实时定量PCR引物和外源参实时定量PCR引物，实时定量PCR探针组包括miR-23a实时定量PCR探针和外源参实时定量PCR探针。

Description

miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别诊断标记物的应用及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域。

背景技术

急性主动脉夹层（acute aortic dissection,AAD）是指主动脉内高速高压血流通过主动脉壁上的内膜撕裂口进入中膜层或中外膜交界处，从而形成主动脉真假两腔，并沿主动脉长轴方向扩展，可导致主动脉破裂致患者死亡或重要脏器（如：心脏、大脑、肾脏、肠道等）急性缺血引起严重并发症，病情凶险，是累及主动脉最严重的疾病之一。我们在临床实践中发现，很多急性主动脉夹层患者在获得手术治疗前甚至是明确诊断前即因病变主动脉破裂而死亡。有调查研究显示，未经治疗的StanfordA型急性主动脉夹层患者发病初期的死亡率高达1%～2%/h。经合理治疗的患者生存率会大幅提高，尤其是经手术治疗的患者，将会在短期内实现生存率从高死亡风险提高至大于70%。但是，在临床工作中，针对剧烈胸痛的患者常规进行的检查是心电图和胸部X线透视，这些检查对急性主动脉夹层的诊断都缺乏敏感度和特异性。从而急性主动脉夹层的患者往往不能得到及时有效的诊治，加之有部分患者并未表现出急性主动脉夹层的典型临床表现，导致急性主动脉夹层这一被医疗工作者发现并研究200多年的疾病（于1761年由Morgagni第一次报道）的临床误诊率仍高达39%，部分患者只有在尸检时才发现罹患了急性主动脉夹层。尤其是在Stanford A型急性主动脉夹层累及冠脉时，误诊为冠心病、急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）的可能性非常大；患者往往被施予抗凝、抗血小板、甚至是溶栓治疗，导致病情恶性进展。因此，及时明确诊断并采取合理的治疗是救治急性主动脉夹层患者的关键之一。

目前，急性主动脉夹层的诊断主要依赖于影像学检查，例如：电子计算机X线断层血管成像、经食道多普勒超声或者核磁共振血管成像，这些检查对急性主动脉夹层具有非常高的敏感度和特异性。但是，这些检查是在首诊医生认为该患者有罹患急性主动脉夹层可能的情况下进行的，且需要接诊医生首先排除具有相似临床表现的、发病率更高的急性冠脉综合征、肺梗死等疾病；加之这些检查的操作和等待过程需要大量时间，常会使患者丧失珍贵的早起诊疗时机。因此，寻找急性主动脉夹层临床适用的早期诊断生物标记物是目前亟待解决的重要问题之一，同时对疾病病情发展转归的监测及预后具有重要意义。学术界为寻找急性主动脉夹层的生物标记物进行了大量研究，发现了诸如：C反应蛋白、D-二聚体、平滑肌肌球蛋白重链、钙调理蛋白等可能与急性主动脉夹层的发生有关联的一系列生物标记物，但由于缺乏特异性、半衰期短或受到假腔血栓化的局限等因素均未能在急性主动脉夹层的临床诊治中得到广泛应用。对此，Ranasinghe等提出了理想的早期诊断指标应具备的一般特点：灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商；为AAD生物标记物的研究提供了理论标准。

在临床诊疗过程中，许多实验室检查项目以其迅速、能够在床边完成、并且对疾病具有较高的敏感度和特异性等特点，得到了广泛应用。近年来科学的重大发现微小RNA（mircoRNA，miRNA）是一类在人类和动物广泛存在并高度保守的小分子非编码RNA；miRNA在心血管组织细胞发育与分化及结构形成异常过程中扮演了极为重要的角色，本课题组前期针对主动脉夹层组和健康组（遗体捐献者）主动脉标本中miRNA进行检测分析，得到夹层主动脉中膜显著改变的miRNA表达谱，同时我们还发现了主动脉夹层中下调的miR-22与HSP27和EC-SOD相关(J vasc surg.2011;53:1341-9)。新近研究表明，miRNA因具有组织特异性及高度保守的特性，使其具有作为疾病生物标记物的可能。例如：Ai等通过急性心肌梗死患者与对照组比较，结合小鼠模型中miR-1的过表达，证实在急性心肌梗死患者循环血中miR-1水平显著增高，发病两周后恢复到基础水平的变化趋势；荆清教授等报道了急性心肌梗死患者相对健康人循环血中显著增高的miR-208a，其血浆水平随患者病情转归而变化，并且外周血中miR-208a早于心肌肌钙蛋白出现的特点，提示miR-208a可能是急性心肌梗死一个更敏感的早期标志物。

发明内容

本发明是基于上述背景技术，为了解决目前存在的问题而进行的，目的在于提供灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商的急性主动脉夹层分子标记以及急性主动脉夹层检测试剂盒。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。

miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别标记物的应用，其中，miR-23a的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，提供血浆总RNA提取试剂组、外源参照物、RNA逆转录试剂组、RNA逆转录引物组、实时定量PCR试剂组、实时定量PCR引物组和实时定量PCR探针组，其中，RNA逆转录引物组包括miR-23a逆转录引物和外源参照物逆转录引物，实时定量PCR引物组包括miR-23a实时定量PCR引物和外源参实时定量PCR引物，实时定量PCR探针组包括miR-23a实时定量PCR探针和外源参实时定量PCR探针。

另外，外源参照物为cel-miR-39-3p，序列如SEQ ID NO.2所示，所有核苷酸的2’O被甲基化修饰。

发明的有益效果

本发明提供的miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别诊断标记物的应用以及一种针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断试剂盒，实现了对急性主动脉夹层的灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉的诊断，具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商。

附图说明

图1是本发明提供的针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断检测结果的箱式图；

图2是本发明提供的针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断检测结果的接受者操作特征（ROC）曲线分析图；

图3是现阶段使用D-二聚体作为分子标记检测急性主动脉夹层的ROC曲线分析图；

图4是本发明提供的针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断检测结果与病人发病时间之间的关系图；

图5是miR-23a稳定性评价结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施方式进行详细说明。

本发明在具体实施过程中，相应步骤中使用的试剂如下：以购自Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit进行RNA提取，其中包括2ml离心管（无盖）、1.5ml离心管（有盖）、QIAzol lysis Reagent、无RNA/DNA酶的水、RWT缓冲液、RPE缓冲液以及Rneasy Mini spin column滤过柱；以购自Applied Biosystems公司的

MicroRNA ReverseTranscription Kit（货号4366597）进行RNA逆转录，其中包括：10×ReverseTranscription Buffer、100mM dNTPs(with dTTP)、20U/μl Rnase Inhibitor、50U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase；以购自Applied Biosystems公司的

Universal PCR Master Mix II,no UNG（货号4440048）进行实时定量PCR。此外，RNA逆转录引物以及实时定量PCR引物和探针为购自Applied Biosystems公司的

MicroRNA Assays（货号4427975），其中包括两部分，一部分用于反转录为：5×RT primer（反转录引物）；一部分用于实时定量PCR扩增，包含了扩增引物和特异性探针，为：

Small RNA Assay(20×)，即此具体实施方式中实施定量PCR引物和探针是预先混合的。ABI公司的miRNA assays使用统一货号，具体某个miRNA又有其编号，涉及本项目的miR-23a的Assays ID为：000399；外源参照物cel-miR-39-3p的Assays ID为：000200。

本发明的检测对象为患者的血浆样本。

一、血浆总RNA的提取

血浆中的总RNA的提取按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)的生厂商Qiagen公司提供的血浆标本总RNA提取标准说明书进行；标本在总RNA提取过程中掺入cel-miR-39-3p（序列如SEQ ID NO.2所示，所有核苷酸2’O甲基化修饰）作为PCR实验的外源性参照物，cel-miR-39-3p掺入量为0.4pmol/200μl血浆标本。具体如下：

1、将cel-miR-39-3p模拟物使用无RNA/DNA酶的水配成0.08pmol/μl溶液；

2、取200μl血浆/血清样品于2ml离心管中，加1000μl QIAzol lysisReagent（样品体积的5倍），漩涡摇匀，使溶液均一无白色沉淀；

3、室温放置5分钟；

4、加5μl0.08pmol/μl cel-miR-39-3p溶液（仅用于PCR实验的标本提取总RNA时包含此步）；

5、加入200μl氯仿（为样品体积的1倍），漩涡摇匀，使溶液均一为粉红色；

6、室温放置2-3分钟；

7、12000g4℃条件下离心15分钟；

8、取上层水相部分600μl置于已提供的2ml离心管中（不可触及中层白色物质），加900μl无水乙醇，抽打数次（请勿离心，可能会产生沉淀物，不会影响）；

9、取700μl样品，包含沉淀物，加入Rneasy Mini spin column（滤过柱）中，柔和的盖上盖子，室温下8000g离心15s。弃去滤过液；

10、剩余样品重复第9步；

11、向Rneasy Mini spin column加700μlRWT缓冲液，8000g，15℃离心15s洗柱，弃去滤过液；

12、向Rneasy Mini spin column加500μlRPE缓冲液，8000g，15℃离心15s洗柱，弃去滤过液；

13、重复第12部，离心后取出虑过柱，不要触及滤过液；

14、将滤过柱置于新的2ml离心管，微量离心机全速离心2分钟（离心力＞17000g）；

15、将滤过柱置于新的1.5ml离心管（试剂盒中已提供），加入50μl无RNA酶水，柔和的盖上盖子，静置1分钟，8000g，15℃离心1分钟；

16、取第15步中离心所得的溶液45μl加入滤过柱（不更换离心管）；柔和的盖上盖子，静置1分钟，8000g，15℃离心1分钟；

17、所得溶液取1μl使用NP1000测定RNA质量及浓度，记录A260/280，A260/230及浓度；剩余溶液保存于-80℃冰箱或直接用于下一实验过程（芯片或qRT-PCR实验）。

二、逆转录反应

1、准备样本总RNA

室温下溶解-80℃下保存的样品总RNA并混匀或提取的总RNA直接用于该实验。

2、反转录主反应液制备

（1）将

MicroRNA Reverse Transcription Kit中的各组分试剂置于冰上溶解；

（2）在聚丙烯管（PT管）中进行配液，该操作须在冰上进行，各组分比例按表1计算；在此推荐增加配液期望反应量的10-20%，以避免移液时试剂损耗带来的配液不足；

表1反转录主反应液的配制

（3）混合时要缓慢，离心使溶液溶解混合在PT管底部（不可漩涡摇匀）；

（4）在进行反转录前，需将配液置于冰上。

3、准备反转录反应

（1）在冰上溶解5x反转录引物和RNA模板；使用前，漩涡震荡保存反转录引物的试剂管使其溶液均匀，并进行短暂离心；

（2）将准备好的总RNA进行以下操作：

①15ul反应体系中，按每7ul反转录主反应液中加入5ul总RNA（1-10ng）的比例混合，成为反转录主反应液-总RNA混合液；

②混合时要缓慢，短暂离心使溶液溶解混合在PT管底部（不可漩涡摇匀）；

③将每12ul反转录主反应液-总RNA混合液转移至0.2ml PT管或者96孔板；

④在相应的管/孔中加入3ul反转录引物，使反应体系达到15ul；

⑤封板/管，轻柔的混合，短暂离心（不可漩涡摇匀）；

⑥至少在冰上孵育5分钟，然后，保持该状态至进行反转录反应；

⑦按表2设定PCR仪的反应步骤和条件。

表2反转录反应条件

三、实时定量PCR（qPCR）反应

1、准备qPCR反应

（1）将各组份置于冰上，小心倒置使其混合均匀后，放回冰上；

（2）按照20ul体系计算所需各组份体积（ABI推荐每个反应进行三次重复，为防止移液时试剂的消耗，增加总试剂使用体积20%），如表3；

表3qPCR反应体系的配制

（3）在微量离心管中混合各组份试剂；

（4）小心倒置离心管以混合溶液，再进行短暂离心。

2、准备qPCR反应板

（1）转移20ul制备好的PCR反应液；

（2）使用光学粘性膜或者光学帽封板，短暂离心。

3、进行PCR反应

（1）按照以下参数创建实验文件：

①模式：标准

②反应体系：20ul

③热循环参数如表4

（2）将反应板置入PCR仪；

（3）启动反应。

表4qPCR热循环设定

4、读取实验数据

（1）观察扩增曲线；

（2）设定基线及阈值获取实验数据。

图1是本发明提供的针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断检测结果的箱式图。

基于临床工作中急性主动脉夹层需要与具有胸痛症状的其他急症相鉴别，我们对病例对照组进行了进一步的分层，来探索是否有能够用于鉴别急性主动脉夹层与非夹层胸痛急症的血浆miRNA。如图1所示，AAD组为急性主动脉夹层患者，SAD组为亚急性主动脉夹层患者，Healthy组为健康人，AA组为动脉瘤患者，AMI组为急性心肌梗塞患者，PE组为肺栓塞患者，其中，急性心肌梗塞和肺栓塞是临床常见的胸痛急症。37例急性主动脉夹层患者血浆中miR-23a的水平显著高于非夹层胸痛患者（n=13，P=0.026；FC=17.851)，即急性心肌梗塞患者（AMI组）和肺栓塞患者（PE组）。同时急性主动脉夹层患者（AAD组）血浆中miR-23a的水平与亚急性主动脉夹层患者（SAD组）、健康人（Healthy组）和动脉瘤患者（AA组）没有显著性差异。这表明miR-23a可以作为区分胸痛急症病人是急性主动脉夹层患者还是其他胸痛急症的标记物。

图2是本发明提供的针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断试剂盒检测结果的接受者操作特征（ROC）曲线分析图。

如图2所示，ROC分析提示miR-23a对急性主动脉夹层的诊断敏感度为：91.9%；特异性是：85.7%；相应的AUC：0.925。

图3是现阶段使用D-二聚体作为分子标记检测急性主动脉夹层的ROC曲线分析图。

同时，为了与已报道的急性主动脉夹层分子标记物做对比分析，我们在同一样品集中采集了D-二聚体的临床数据，鉴于临床工作中可能会多次复测患者D-二聚体水平，我们仅收集并分析与用于miRNA检测的标本在相同时间及状态下采集并测得的D-二聚体的临床数据。如图3所示，经ROC分析，上述miRNA的AUC数据优于D-二聚体对急性主动脉夹层的诊断准确率。D-二聚体在我们的研究中测得的敏感度和特异性分别是81.1%和47.5%。这一数据与Suzuki等引用国际急性主动脉夹层数据库（TheInternational Registry of Acute Aortic Dissection,RIAD）资料观测到的D-二聚体对急性主动脉夹层的诊断敏感度96.6%和特异性46.6%较为相近；本研究中D-二聚体敏感度低的原因可能是由于纳入的研究对象发病时间窗较宽，而D-二聚体的半衰期又相对较短的原因造成的。

从以上结果可以看出miRNA分子标记物miR-23a在特异性上明显高于已报道的急性主动脉夹层分子标记物D-二聚体。

图4是本发明提供的针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断试剂盒检测结果与病人发病时间之间的关系图。

对急性主动脉夹层患者血浆中miR-23a的表达水平进一步分析。在按照发病时间(0～6h,～12h,～24h,～3d,～10d,～14d和慢性期)的分析中，对主动脉夹层患者第一次就诊时所采集的血标本进行检测，并以发病至采集血标本的时间将患者分为7个亚组。通过线性相关分析，观察到发病时间对患者血浆中特定miRNA水平的影响并不显著，相应的R2=0.0007（如图4所示）。这表明急性主动脉夹层患者循环血中特定miRNA水平的增高可能会伴随着疾病状态的持续存在而处于一个较高水平。

同时，还通过反复冻融和室温环境下防止，对血浆中miRNA的稳定性进行了评价。

图5是miR-23a稳定性评价结果图。

如图5所示，将同一组患者的血浆标本（n=3）等分为4份，分别经冻融1次、2次、4次、8次处理后进行qRT-PCR定量检测特定miRNA。我们观察到，冻融次数会对miR-23a产生一定的影响，且随着冻融次数的增加miR-15a和miR-23a呈降解的趋势，但是在冻融4次以内对其影响并不十分显著（图5A）。将同一组患者的血浆标本（n=3）等分为5份，分别于室温环境下密封放置1h、2h、4h、8h、24h处理后进行qRT-PCR定量检测特定miRNA，我们观察到室温下放置时间长短对miR-23a有一定影响（图5B），且随着放置时间越长miR-23a呈降解趋势；但在8小时内室温下放置对特定miRNA的影响并不显著。

具体实施方式的有益效果

通过本发明的具体实施方式，miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别诊断标记物，不仅灵敏度高、特异性强，而且稳定不易降解；同时，针对miR-23a的急性主动脉夹层鉴别诊断试剂盒快捷、易用、价格低廉，具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商。

以上，仅为本发明的一种具体实施方式而已，并非用来限定本发明的实施范围，即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.miR-23a作为急性主动脉夹层鉴别标记物的应用，

其中，所述miR-23a的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种急性主动脉夹层鉴别试剂盒，其特征在于，具有：

血浆总RNA提取试剂组、外源参照物、RNA逆转录试剂组、RNA逆转录引物组、实时定量PCR试剂组、实时定量PCR引物组和实时定量PCR探针组，

其中，所述RNA逆转录引物组包括miR-23a逆转录引物和外源参照物逆转录引物，

所述实时定量PCR引物组包括miR-23a实时定量PCR引物和外源参实时定量PCR引物，

所述实时定量PCR探针组包括miR-23a实时定量PCR探针和外源参实时定量PCR探针。

3.根据权利要求2所述的急性主动脉夹层鉴别试剂盒，其特征在于：

其中，所述外源参照物为cel-miR-39-3p，所述cel-miR-39-3p序列如SEQ ID NO.2所示，所述cel-miR-39-3p的所有核苷酸的2’O被甲基化修饰。