CN103392598B - 一种花叶枸骨的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花叶枸骨的组织培养方法，包括消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽。以花叶枸骨当年生嫩枝条为外植体，经过无菌接种于诱芽培养基上，形成丛生芽后，利用丛生芽再进行继代培养，然后转接到生根培养基上进行生根诱导形成生根苗，生根苗经过炼苗驯化得到再生植株。本发明的方法使花叶枸骨的繁殖更为容易，打破了季节与气候的限制，缩短繁殖周期。
Description
技术领域
本发明属于设计一种植物组织培养方法，具体为花叶枸骨的组织培养方法。
背景技术
花叶枸骨为冬青科冬青属植物。花叶枸骨春天开花结果，秋后果实由青转红，是目前彩叶树种中的佼佼者。花叶枸骨的规格有1米桩球、1.5米桩球，大树型桩，古桩等。
花叶枸骨的繁殖方法以扦插繁殖为主，梅雨季节实行嫩枝扦插，成活率较高，但是受季节影响大。
发明内容
发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供了一种花叶枸骨的组织培养方法，加快了花叶枸骨的繁殖速度，解决季节性限制的问题。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种花叶枸骨的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：消毒灭菌，选取当年生枝条嫩芽，自来水冲洗后，在超净工作台上以75％酒精浸泡30秒钟，再转入0.1％升汞溶液中灭菌8～10分钟，倒去灭菌液，用预先准备好的无菌水冲洗4～5遍，沥干水后，切取嫩芽组织，接种到诱芽培养基上；
步骤2：接种培养
a、初代培养，切取花叶枸骨嫩芽接种在WPM+ZT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5～7g/L，PH值5.5～5.8，培养基经1.1kg/cm2高压消毒15～20分钟，在温度25～30，℃光照强度1500～2000lux，每日光照12小时的培养条件下培养；接种后一周，腋芽开如萌动，当30～40天伸长至2±0.2㎝时，即可切下进入下一阶段的继代培养；
b、继代培养，当初代培养的花叶枸骨腋芽长到2±0.2㎝时，切下接种在WPM+ZT 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5～7g/L，PH值5.5～5.8，在温度25～30，℃光照强度1500～2000lux，每日光照12小时，无根的试管苗经30～40天培养，丛生苗达到3±0.2㎝时，即可切割以扩大繁殖；一般第一次继代培养时增殖率2～3倍左右，经2～3次继代培养后增殖倍数可达到5倍左右，当继代苗达到一定数量时，可进行生根培养；
c、生根培养，当花叶枸骨无根苗长至2～3㎝时，可转移到生根培养基上培养；在温度25～28，℃光照强度1500lux，每日光照10～12小时，经30～40天培养后，可见白色短根形成，当根长至2～3㎝时，即可进行炼苗及移栽。
作为优选，所述炼苗及移栽的具体方法为：
移栽前，花叶枸骨组培苗炼苗可先在温度20～30℃之间的温室内拧松瓶盖放置3～5天，然后进行温床过渡移栽；过渡苗床建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m左右，床四周砌高30㎝，床底整平，再用0.15％高锰酸钾喷洒苗床表面及四周，24小时后即可移栽小苗；
移栽时，将幼苗从瓶内取出，用清水将根部琼脂清洗干净；
种入苗床后，选择清洁水浇灌，移栽当天喷施0.3％的磷酸二氢钾溶液，并喷施800～1000倍的甲基托布津或1000倍多菌灵药液，以后每隔一周喷施一次，连续3～4次。
作为优选，步骤2中所述生根培养基的配方为：1/3WPM+0.2～0.3mg/L的NAA+0.3％活性炭。
作为优选，炼苗及移栽过程中，移栽初期要特别注意保持苗床和空气湿度，需全封闭管理一周，再半封闭管理二周；第25天时逐步通风，并除去覆盖物；在春秋季节移栽时，需遮荫四周；冬季移栽时，遮荫三周。
作为优选，炼苗移栽过程中，控制苗床温度在12～20；℃过渡移栽40天后，小苗就上盆移栽，春季直接移入大田；过渡苗长至5㎝以上时就可移栽开始进行大田移栽。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明通过采用组织培养的方法，加快花叶枸骨的繁殖速度，解决季节性限制的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一.消毒灭菌
选取当年生枝条嫩芽，自来水冲洗后，在超净工作台上以75％酒精浸泡30秒钟，再转入0.1％升汞溶液中灭菌8分钟，倒去灭菌液，用预先准备好的无菌水冲洗4遍，沥干水后，切取嫩芽组织，接种到诱芽培养基上。
二.接种培养
1.初代培养
切取花叶枸骨嫩芽接种在WPM+ZT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH值5.5左右，MS培养基经1.1kg/cm2高压消毒20分钟，在温度25，℃光照强度1500～2000lux，每日光照12小时的培养条件下培养。接种后一周左右腋芽开如萌动，40天可伸长至2㎝左右，即可切下进入下一阶段的继代培养。
2.继代培养
当初代培养的花叶枸骨腋芽长到2㎝左右时，切下接种在WPM+ZT 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，PH值5.5左右，在温度25，℃光照强度1500～2000lux，每日光照12小时，无根的试管苗经40天培养，丛生苗达到3㎝左右时，即可切割以扩大繁殖。
3.生根培养
当花叶枸骨无根苗长至3㎝时，可转移到生根培养基上培养。生根培养1/3WPM+0.2～0.3mg/L的NAA+0.3％活性炭的基本培养基上，在温度25，℃光照强度1500lux，每日光照12小时，一般一周左右可见白色短根形成，经40天培养后，根长长至3㎝，进行炼苗移栽。
4.炼苗及移栽
花叶枸骨组培苗炼苗，先在温度20～30℃之间的温室内拧松瓶盖放置3天，然后进行温床过渡移栽。过渡苗床(即温床)可建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m左右，床四周砌高30㎝，床底整平，再用0.15％高锰酸钾喷洒苗床表面及四周，24小时后即可移栽小苗。移栽时，将幼苗从瓶内取出，用清水将根部琼脂清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，移栽当天喷施0.3％的磷酸二氢钾溶液，并喷施1000倍的甲基托布津药液，以后每隔一周喷施一次，连续4次。全封闭管理一周左右，再半封闭管理二周左右，在25天左右可以逐步通风，并除去覆盖物。
实施例2
一.消毒灭菌
选取当年生枝条嫩芽，自来水冲洗后，在超净工作台上以75％酒精浸泡30秒钟，再转入0.1％升汞溶液中灭菌10分钟，倒去灭菌液，用预先准备好的无菌水冲洗5遍，沥干水后，切取嫩芽组织，接种到诱芽培养基上。
二.接种培养
1.初代培养
切取花叶枸骨嫩芽接种在WPM+ZT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.8左右，MS培养基经1.1kg/cm2高压消毒20分钟，在温度30，℃光照强度1500～2000lux，每日光照12小时的培养条件下培养。接种后一周左右腋芽开如萌动，30天可伸长至2㎝左右，即可切下进入下一阶段的继代培养。
2.继代培养
当初代培养的花叶枸骨腋芽长到2㎝左右时，切下接种在WPM+ZT 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH值5.8左右，在温度30，℃光照强度1500～2000lux，每日光照12小时，无根的试管苗经30天培养，丛生苗达到3㎝左右时，即可切割以扩大繁殖。
3.生根培养
当花叶枸骨无根苗长至3㎝时，可转移到生根培养基上培养。生根培养1/3WPM+0.2～0.3mg/L的NAA+0.3％活性炭的基本培养基上，在温度28，℃光照强度1500lux，每日光照10小时，一般一周左右可见白色短根形成，经30天培养后，当根长至3㎝时，进行炼苗移栽。
4.炼苗及移栽
花叶枸骨组培苗炼苗可先在温度20～30℃之间的温室内拧松瓶盖放置5天，然后进行温床过渡移栽。过渡苗床(即温床)可建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m左右，床四周砌高30㎝，床底整平，再用0.15％高锰酸钾喷洒苗床表面及四周，24小时后即可移栽小苗。移栽时，将幼苗从瓶内取出，用清水将根部琼脂清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，移栽当天喷施0.3％的磷酸二氢钾溶液，并喷施1000倍多菌灵药液，以后每隔一周喷施一次，连续4次。全封闭管理一周左右，再半封闭管理二周左右，在25天左右可以逐步通风，并除去覆盖物。
本发明的方法使花叶枸骨的繁殖更为容易，打破了季节与气候的限制，缩短繁殖周期。
Claims (2)
1.一种花叶枸骨的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：消毒灭菌，选取当年生枝条嫩芽，自来水冲洗后，在超净工作台上以75％酒精浸泡30秒钟，再转入0.1％升汞溶液中灭菌8～10分钟，倒去灭菌液，用预先准备好的无菌水冲洗4～5遍，沥干水后，切取嫩芽组织，接种到诱芽培养基上；
步骤2：接种培养
a、初代培养，切取花叶枸骨嫩芽接种在WPM+ZT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5～7g/L，pH值5.5～5.8，培养基经1.1kg/cm2高压消毒15～20分钟，在温度25～30℃，光照强度1500～2000lux，每日光照12小时的培养条件下培养；接种后一周，腋芽开始萌动，当30～40天伸长至2±0.2㎝时，切下进入下一阶段的继代培养；
b、继代培养，当初代培养的花叶枸骨腋芽长到2±0.2㎝时，切下接种在WPM+ZT 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5～7g/L，pH值5.5～5.8，在温度25～30℃，光照强度1500～2000lux，每日光照12小时，无根的试管苗经30～40天培养，丛生苗达到3±0.2㎝时，切割以扩大繁殖；
c、生根培养，当花叶枸骨无根苗长至2～3㎝时，转移到生根培养基上培养；在温度25～28℃，光照强度1500lux，每日光照10～12小时，经30～40天培养后，见白色短根形成，当根长至2～3㎝时，进行炼苗及移栽；所述炼苗及移栽的具体方法为：
移栽前，花叶枸骨组培苗炼苗先在温度20～30℃之间的温室内拧松瓶盖放置3～5天，然后进行温床过渡移栽；过渡苗床建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m左右，床四周砌高30㎝，床底整平，再用0.15％高锰酸钾喷洒苗床表面及四周，24小时后移栽小苗；
移栽时，将幼苗从瓶内取出，用清水将根部琼脂清洗干净；
种入苗床后，选择清洁水浇灌，移栽当天喷施0.3％的磷酸二氢钾溶液，并喷施800～1000倍的甲基托布津或1000倍多菌灵药液，以后每隔一周喷施一次，连续3～4次；
步骤2中所述生根培养基的配方为：1/3WPM+0.2～0.3mg/L的NAA+0.3％活性炭。
2.根据权利要求1所述花叶枸骨的组织培养方法，其特征在于：炼苗及移栽过程中，移栽初期要特别注意保持苗床和空气湿度，需全封闭管理一周，再半封闭管理二周；第25天时逐步通风，并除去覆盖物；在春秋季节移栽时，需遮荫四周；冬季移栽时，遮荫三周。
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| ‘贝尔奇卡金’哈克勒雷冬青无性快繁技术研究;徐志豪;《浙江大学》;20100501;第31-35页 * |
| 无刺枸骨快速繁殖技术研究;简大为等;《湖北林业科技》;20111231(第2期);第30-32，64页 * |
| 枸骨的组织培养与快速繁殖;周喜军等;《植物生理学通讯》;20081031;第44卷(第5期);第949页 * |
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