CN103387501B - 一种制备高纯度l-辛弗林的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备高纯度L-辛弗林的方法，涉及采用超滤、树脂吸附和反渗透技术分离纯化L-辛弗林的方法。本发明以市售枳实为原料，经溶解及抽滤、超滤除糖和蛋白质、大孔吸附树脂脱色、乙醇除寡糖、反渗透膜浓缩、冷冻干燥，制得L-辛弗林粉末。本发明采用在常温下实施对L-辛弗林高效分离纯化，操作简单，产品纯度高，溶剂可循环使用，成本低，无“三废”排放等特点。采用本发明方法制备出的高纯度L-辛弗林产品可广泛应用于医药、保健品、食品、饮料等行业。

Description

一种制备高纯度L-辛弗林的方法

一、技术领域

本发明属于L-辛弗林分离纯化的技术领域，具体涉及采用超滤、树脂吸附和反渗透技术分离纯化L-辛弗林的方法。

二、背景技术

L-辛弗林，别名对羟福林、脱氧肾上腺素，是属于麻黄碱类、无副作用的天然兴奋剂，具有氧化脂肪、增加能量消耗减肥功能，具有收缩血管、升高血压、扩张气管和支气管、调节胃肠运动的作用，用于抗休克，治疗支气管哮喘和胃下垂等，在医药、保健品、食品、饮料等行业有广泛应用前景。

L-辛弗林既可化学合成又可从植物中提取，化学合成的路线有氨基乙氰法和直接酰化法，获得的产物为DL-外消旋体，由于D-对映体可能存在副作用且难以分离，致使化学合成L-辛弗林受到严重制约。因而，从植物中提取分离成为制备L-辛弗林的唯一方法。L-辛弗林存在于酸橙和柑橘的干燥幼果枳实、青皮等植物中，含量仅为0.28-2.53％。目前，市售的L-辛弗林产品纯度低，杂质多，不能应用于医药等高附加值领域。因此，研发出制备高纯度L-辛弗林成为本领域的关键。

现有分离L-辛弗林的方法，如2010年8月4日公开的公开号为CN101792394A的“一种萃取分离L-辛弗林的方法”专利，公开的方法是：以市售枳实为原料，经溶解及抽滤、超滤分离、反胶束萃取、反萃取、真空浓缩及冻干而得成品。该方法的缺点是：萃取的原理是基于正负电荷的相互作用，而L-辛弗林溶液中含有氨基酸、维生素等带正电荷的小分子，在实际生产过程中也被萃取，难以除去；该方法以真空浓缩方法来除去溶剂，达到提升L-辛弗林浓度的目的，但L-辛弗林为热敏性化合物，真空浓缩时一般需要将物料加热到65℃以上，此时，L-辛弗林已经开始氧化失效，因此，该法难以获得高纯度、高品质的产品。

又如2009年4月8日公开的公开号为CN101402577的“从个青皮中提取分离左旋-辛弗林的方法”专利，公开的方法是：用15～45％乙醇于80℃条件下回流提取个青皮细粉中左旋-辛弗林两次，将提取液减压浓缩至含固形物80～85％后上D101大孔吸附树脂柱，用15％乙醇洗脱；将洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得左旋-辛弗林粗品；用纯乙酸溶解左旋-辛弗林粗品，加入与粗品等质量的硅胶，搅拌均匀，去除乙醇，制备硅胶吸附样品，干法上样，按体积比用二氯甲烷∶甲醇∶氨水＝6～9∶2∶0.1配制的洗脱液洗脱收集左旋-辛弗林组分；将硅胶柱分离洗脱的左旋-辛弗林组分进行减压浓缩，喷雾干燥，获左旋-辛弗林产品。该方法的主要缺点是：含固形物80～85％的提取液流动性极差，需要洗脱液体积大，硅胶高温再生时耗能大，重复使用性差；使用二氯甲烷等有毒有机溶剂，污染严重，生产的安全性差；此外，在高温下进行减压浓缩及喷雾干燥，可能导致热敏性的左旋-辛弗林大量氧化而失效，因此，获得的产品质量差。

三、发明内容

本发明的目的是针对现有制备L-辛弗林方法的不足之处，提供一种制备高纯度L-辛弗林的新方法，具有在常温下实施对L-辛弗林高效分离纯化，操作简单，产品纯度高，溶剂可循环使用，成本低，无“三废”排放等特点。

本发明的主要机理：L-辛弗林和盐酸结合形成的盐酸盐易溶于水，橙皮苷等物质则不溶解，因此可用盐酸水溶液从枳实中提取，获得L-辛弗林提取液；超滤是根据分子直径差异实现物理分离，L-辛弗林是小分子，分子量仅为167.21，多糖、蛋白质等为大分子，分子量高达数万或数十万，故可以利用超滤使L-辛弗林透过超滤膜，而多糖、蛋白质等大分子被截留而与L-辛弗林分离；脱除多糖、蛋白质等大分子的L-辛弗林溶液中尚含有黄色素，该黄色素不带电荷，可与大孔吸附树脂结合，而L-辛弗林含亚氨基，接受质子即成为下离子，不能与吸附树脂结合，将该溶液用大孔吸附树脂处理，即可脱去黄色素；脱去黄色素的L-辛弗林溶液中还存在寡糖，由于寡糖不溶于乙醇等有机溶剂，所以，向脱去黄色素的L-辛弗林溶液中加入适量乙醇，则寡糖沉淀析出，过滤除去寡糖，再低温减压浓缩回收乙醇，得到除寡糖的L-辛弗林；L-辛弗林为酚类化合物，在高温下极易氧化，将分别脱去多糖、蛋白质等大分子、脱去黄色素和寡糖的L-辛弗林溶液进行反渗透膜浓缩，无机盐等小分子荷电杂质通过反渗透膜，L-辛弗林的相对分子量为167.21，则被截留下来，形成辛弗林浓缩液，最后对浓缩液进行冷冻干燥，即制备出高纯度L-辛弗林冻干粉。

本发明的目的是这样实现的：一种制备高纯度L-辛弗林的方法，以市售枳实为原料，经溶解及抽滤、超滤除糖和蛋白质、大孔吸附树脂脱色、乙醇除寡糖、反渗透膜浓缩、冷冻干燥，制得L-辛弗林粉末。其具体的方法步骤如下：

(1)制备L-辛弗林原料液

以市售枳实为原料，用粉碎机粉碎后过20目的筛网，未过筛网的颗粒进行下一批次的粉碎，过筛网的粉末进行提取L-辛弗林操作。按枳实粉末质量：0.05～0.1mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶8～10L的比例，将枳实粉末分散在0.05～0.1mol/L的盐酸水溶液中，先浸泡1～2h后，再搅拌3～5h，进行第一次提取，接着将提取物在6000～8000r/min的条件下进行第一次离心分离10～20min，分别收集第一次离心分离上清液和沉淀；对收集的第一次离心分离沉淀，按枳实粉末质量：0.05～0.1mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶4～6L的比例，先将第一次离心沉淀分散于0.05～0.1mol/L盐酸水溶液中，再搅拌3～5h，进行第二次提取，接着将第二次提取物在6000～8000r/min的条件下进行第二次离心分离10～20min，分别收集第二次离心分离的上清液和沉淀。对收集的第二次离心分离沉淀，用于进一步提取橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷；对收集的第二次离心分离上清液，与第一次离心分离上清液合并，即为L-辛弗林原料液，用于下步制备L-辛弗林脱糖液。

(2)制备L-辛弗林脱糖液

在第(1)步完成之后，先将第(1)步收集的L-辛弗林原料液泵入超滤器中，用截留分子量为3000～10000Da的超滤膜，在0.05～0.2MPa的压力下进行超滤分离。分别收集滤过液和截留液，对收集的截留液，主要含有大分子糖类和蛋白质，用作发酵食用菌的添加剂；对于收集的滤过液，即为L-辛弗林脱糖液，用于下步制备L-辛弗林脱色液。

(3)制备L-辛弗林脱色液

取已活化的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂湿法装柱，按照大孔吸附树脂体积：第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液体积的比为1L∶5～15L的比例，将第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液泵入装有D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂的层析柱中，控制L-辛弗林脱糖液泵入流速为D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂体积的1～5倍/小时(BV/h)，进行脱色处理。处理完成后分别收集吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱和流出的柱后液；对收集的吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，先用3～5倍树脂体积的蒸馏水冲洗。分别收集水洗液和洗涤后的吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱；对收集的水洗液，与流出的柱后液合并，即为L-辛弗林脱色液，用于下步制备L-辛弗林脱寡糖液；对收集的水洗后的吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，用pH为9.5～10.5、乙醇浓度为30％～60％的水溶液洗脱，洗脱液流速为1～5倍树脂体积/小时(BV/h)。分别收集洗脱液和脱附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液，含大量黄色素，用于减压浓缩回收乙醇并制备黄色素；对收集的脱附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，用3～5倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和水洗后的脱附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，对收集的水洗液，泵入水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的水洗后脱附色素的的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，可用于下批次吸附色素处理。

(4)制备L-辛弗林脱寡糖液

在第(3)步完成之后，按第(3)步制备出的L-辛弗林脱色液体积：95％乙醇体积比为1L∶1～3L的比例，向脱色液中加入95％乙醇，搅拌10～30min后静置2～4h，过滤并收集滤液和滤渣。对收集的滤渣，用于制备高纯度寡糖；对收集的滤液，在40～55℃、真空度为-0.06MPa～-0.09MPa的条件下，进行真空减压浓缩。分别收集真空减压浓缩液和冷凝液，对收集的冷凝液，主要含乙醇，调配成乙醇浓度为30％～60％的洗脱水溶液，用于下批次洗脱黄色素；对收集的浓缩液，即为L-辛弗林脱寡糖液，用于下步制备L-辛弗林反渗透浓缩液。

(5)制备L-辛弗林反渗透浓缩液

第(4)步完成后，先将第(4)步收集的L-辛弗林脱寡糖液泵入反渗透器中，在0.2～0.6MPa的压力下进行反渗透浓缩。分别收集反渗透滤过液及截留液，对收集的滤过液，调节酸度后用于从下一批次的枳实粉中提取L-辛弗林；对收集的截留液，即L-辛弗林反渗透浓缩液，用于下步制备L-辛弗林冻干粉。

(6)制备L-辛弗林冻干粉

第(5)步完成之后，先将第(5)步制备的L-辛弗林反渗透浓缩液在-10～-30℃下，预冻3～5小时，再置于冷冻干燥机中，在真空度为20～60Pa、温度为-40～-60℃的条件下，冷冻干燥24～30小时，就制备出L-辛弗林冻干粉。

(6)树脂的再生

将用了10～15次后的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂，用蒸馏水冲洗至流出液清澈不浑浊；再依次用2～3倍树脂体积的95％乙醇、蒸馏水、5％HCl、蒸馏水、5％NaOH浸泡搅拌2h，最后用蒸馏水洗至中性，备用。

本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：

1、本发明方法在常温下提取枳实中的L-辛弗林，用超滤法除去大分子糖类、蛋白质等杂质，用大孔吸附树脂吸附L-辛弗林溶液中的色素，用乙醇除寡糖，以反渗透膜进行常温浓缩，最后进行冷冻干燥，获得L-辛弗林的纯度高达92％～96％的L-辛弗林冻干粉，以枳实粉质量计，其总收率达到0.6～0.95％。

2、本发明在生产过程中，经超滤获得的截留液，主要含大分子糖类、蛋白质，经干燥后可用作食用菌的发酵添加剂；获得的洗脱液含黄色素，可用于制备黄色素。既可显著降低生产成本，又充分利用资源，还可保护环境。

3、本发明在生产过程中，使用的超滤、大孔吸附树脂、反渗透、冷冻干燥设备为通用设备，操作方便且易于控制，投资小且生产安全。

4、本发明在生产过程中，使用的盐酸、乙醇等常见试剂，低毒且均实现回收使用，有利于提高产品质量及保护环境。

四、具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。

实施例1

一种制备高纯度L-辛弗林的方法，其具体步骤如下。

(1)制备L-辛弗林原料液

以市售枳实为原料，用粉碎机粉碎后过20目的筛网，未过筛网的颗粒进行下一批次的粉碎，过网的粉末进行提取L-辛弗林操作。按枳实粉末质量：0.05mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶8L的比例，将枳实粉末分散在0.05mol/L的盐酸水溶液中，先浸泡1h后，再搅拌3h，进行第一次提取，接着将提取物在6000r/min的条件下进行第一次离心分离10min，分别收集第一次离心分离上清液和沉淀；对收集的第一次离心分离沉淀，按枳实粉末质量：0.05mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶4L的比例，先将第一次离心沉淀分散于0.05mol/L盐酸水溶液中，再搅拌3h，进行第二次提取，接着将第二次提取物在6000r/min的条件下进行第二次离心分离10min，分别收集第二次离心分离的上清液和沉淀。对收集的第二次离心分离沉淀，用于进一步提取橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷；对收集的第二次离心分离上清液，与第一次离心分离上清液合并，即为L-辛弗林原料液，用于下步制备L-辛弗林脱糖液。

(2)制备L-辛弗林脱糖液

在第(1)步完成之后，先将第(1)步收集的L-辛弗林原料液泵入超滤器中，用截留分子量为3000Da的超滤膜，在0.05MPa的压力下进行超滤分离，分别收集滤过液和截留液。对收集的截留液，主要含有大分子糖类和蛋白质，用作发酵食用菌的添加剂；对于收集的滤过液，即为L-辛弗林脱糖液，用于下步制备L-辛弗林脱色液。

(3)制备L-辛弗林脱色液

取已活化的D3520大孔吸附树脂湿法装柱，按照大孔吸附树脂体积：第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液体积的比为1L∶3L的比例，将第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液泵入装有D3520大孔吸附树脂的层析柱中，控制L-辛弗林脱糖液泵入流速为D3520大孔吸附树脂体积的1倍/小时(BV/h)，进行脱色处理。处理完成后分别收集吸附着色素的D3520大孔吸附树脂柱和流出的柱后液；对收集的吸附着色素的D3520大孔吸附树脂柱，先用3倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和洗涤后的吸附着色素的D3520大孔吸附树脂柱；对收集的水洗液，与流出的柱后液合并，即为L-辛弗林脱色液，用于下步制备L-辛弗林脱寡糖液；对收集的洗涤后的吸附着色素的D3520大孔吸附树脂柱，用pH为9.5、乙醇浓度为30％水溶液洗脱，洗脱液流速为1倍树脂体积/小时(BV/h)。分别收集洗脱液和脱附着色素的D3520大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液，含大量黄色素，用于减压浓缩回收乙醇并制备黄色素；对收集的脱附色素的D3520大孔吸附树脂柱，用3倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和水洗后的D3520大孔吸附树脂柱，对收集的水洗液，泵入水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的水洗后的D3520大孔吸附树脂柱，可用于下批次吸附色素处理。

(4)制备L-辛弗林脱寡糖液

在第(3)步完成之后，按第(3)步制备出的L-辛弗林脱色液体积：95％乙醇体积比为1L∶1L的比例，向脱色液中加入95％乙醇，搅拌10min后静置2h，过滤并收集滤液和滤渣。对收集的滤渣，用于制备高纯度寡糖；对收集的滤液，在40℃、真空度为-0.06MPa的条件下，进行真空减压浓缩。分别收集真空减压浓缩液和冷凝液，对收集的冷凝液，主要含乙醇，调配后用于配制乙醇浓度为30％的洗脱水溶液；对收集的浓缩液，即为L-辛弗林脱寡糖液，用于下步制备L-辛弗林反渗透浓缩液。

(5)制备L-辛弗林反渗透浓缩液

第(4)步完成后，先将第(4)步收集的L-辛弗林脱寡糖液泵入反渗透器中，在0.2MPa的压力下进行反渗透浓缩，分别收集反渗透滤过液及截留液。对收集的滤过液，调节酸度后用于从下一批次的枳实粉中提取L-辛弗林；对收集的截留液，即L-辛弗林反渗透浓缩液，用于下步制备L-辛弗林冻干粉。

(6)制备L-辛弗林冻干粉

第(5)步完成之后，先将第(5)步制备的L-辛弗林反渗透浓缩液在-10℃下，预冻3小时，再置于冷冻干燥机中，在真空度为20Pa、温度为-40℃的条件下，冷冻干燥24小时，就制备出L-辛弗林冻干粉。

(6)树脂的再生

将用了15次后的D3520大孔吸附树脂，用蒸馏水冲洗至流出液清澈不浑浊；再依次用3倍树脂体积的95％乙醇、蒸馏水、5％HCl、蒸馏水、5％NaOH浸泡搅拌2h，蒸馏水洗至中性，备用。

实施例2

一种制备高纯度L-辛弗林的方法，其具体步骤如下。

(1)制备L-辛弗林原料液

以市售枳实为原料，用粉碎机粉碎后过20目的筛网，未过网的颗粒进行下一批次的粉碎，过网的粉末进行提取L-辛弗林操作。按枳实粉末质量：0.07mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶9L的比例，将枳实粉末分散在0.07mol/L的盐酸水溶液中，先浸泡1.5h后，再搅拌4h，进行第一次提取，接着将提取物在7000r/min的条件下进行第一次离心分离15min，分别收集第一次离心分离上清液和沉淀；对收集的第一次离心分离沉淀，按枳实粉末质量：0.07mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶5L的比例，先将第一次离心沉淀分散于0.07mol/L盐酸水溶液中，再搅拌4h，进行第二次提取，接着将第二次提取物在7000r/min的条件下进行第二次离心分离15min，分别收集第二次离心分离的上清液和沉淀。对收集的第二次离心分离沉淀，用于进一步提取橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷；对收集的第二次离心分离上清液，与第一次离心分离上清液合并，即为L-辛弗林原料液，用于下步制备L-辛弗林脱糖液。

(2)制备L-辛弗林脱糖液

在第(1)步完成之后，先将第(1)步收集的L-辛弗林原料液泵入超滤器中，用截留分子量为5000Da的超滤膜，在0.1MPa的压力下进行超滤分离，分别收集滤过液和截留液。对收集的截留液，主要含有大分子糖类和蛋白质，用作发酵食用菌的添加剂；对于收集的滤过液，即为L-辛弗林脱糖液，用于下步制备L-辛弗林脱色液。

(3)制备L-辛弗林脱色液

取已活化的X-5大孔吸附树脂湿法装柱，按照大孔吸附树脂体积：第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液体积的比为1L∶4L的比例，将第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液泵入装有X-5大孔吸附树脂的层析柱中，控制L-辛弗林脱糖液泵入流速为X-5大孔吸附树脂体积的2倍/小时(BV/h)，进行脱色处理。处理完成后分别收集吸附着色素的X-5大孔吸附树脂柱和流出的柱后液；对收集的吸附着色素的X-5大孔吸附树脂柱，先用4倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和洗涤后的吸附着色素的X-5大孔吸附树脂柱；对收集的水洗液，与流出的柱后液合并，即为L-辛弗林脱色液，用于下步制备L-辛弗林脱寡糖液；对收集的洗涤后的吸附着色素的X-5大孔吸附树脂柱，用pH为10.0、乙醇浓度为40％水溶液洗脱，洗脱液流速为2倍树脂体积/小时(BV/h)。分别收集洗脱液和脱附着色素的X-5大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液，含大量黄色素，用于减压浓缩回收乙醇并制备黄色素；对收集的脱附色素的X-5大孔吸附树脂柱，用4倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和水洗后的X-5大孔吸附树脂柱，对收集的水洗液，泵入水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的水洗后的X-5大孔吸附树脂柱，可用于下批次吸附色素处理。

(4)制备L-辛弗林脱寡糖液

在第(3)步完成之后，按第(3)步制备出的L-辛弗林脱色液体积：95％乙醇体积比为1L∶2L的比例，向脱色液中加入95％乙醇，搅拌20min后静置3h，过滤并收集滤液和滤渣。对收集的滤渣，用于制备高纯度寡糖；对收集的滤液，在45℃、真空度为-0.07MPa的条件下，进行真空减压浓缩。分别收集真空减压浓缩液和冷凝液，对收集的冷凝液，主要含乙醇，调配后用于配制乙醇浓度为40％的洗脱水溶液；对收集的浓缩液，即为L-辛弗林脱寡糖液，用于下步制备L-辛弗林反渗透浓缩液。

(5)制备L-辛弗林反渗透浓缩液

第(4)步完成后，先将第(4)步收集的L-辛弗林脱寡糖液泵入反渗透器中，在0.4MPa的压力下进行反渗透浓缩，分别收集反渗透滤过液及截留液。对收集的滤过液，调节酸度后用于从下一批次的枳实粉中提取L-辛弗林；对收集的截留液，即L-辛弗林反渗透浓缩液，用于下步制备L-辛弗林冻干粉。

(6)制备L-辛弗林冻干粉

第(5)步完成之后，先将第(5)步制备的L-辛弗林反渗透浓缩液在-20℃下，预冻4小时，再置于冷冻干燥机中，在真空度为40Pa、温度为-50℃的条件下，冷冻干燥27小时，就制备出L-辛弗林冻干粉。

(6)树脂的再生

将用了13次后的X-5大孔吸附树脂，用蒸馏水冲洗至流出液清澈不浑浊；再依次用3倍树脂体积的95％乙醇、蒸馏水、5％HCl、蒸馏水、5％NaOH浸泡搅拌2h，蒸馏水洗至中性，备用。

实施例3

一种制备高纯度L-辛弗林的方法，其具体步骤如下。

(1)制备L-辛弗林原料液

以市售枳实为原料，用粉碎机粉碎后过20目的筛网，未过网的颗粒进行下一批次的粉碎，过网的粉末进行提取L-辛弗林操作。按枳实粉末质量：0.07mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶9L的比例，将枳实粉末分散在0.07mol/L的盐酸水溶液中，先浸泡1.5h后，再搅拌4h，进行第一次提取，接着将提取物在7000r/min的条件下进行第一次离心分离15min，分别收集第一次离心分离上清液和沉淀；对收集的第一次离心分离沉淀，按枳实粉末质量：0.07mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶5L的比例，先将第一次离心沉淀分散于0.07mol/L盐酸水溶液中，再搅拌4h，进行第二次提取，接着将第二次提取物在7000r/min的条件下进行第二次离心分离15min，分别收集第二次离心分离的上清液和沉淀。对收集的第二次离心分离沉淀，用于进一步提取橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷；对收集的第二次离心分离上清液，与第一次离心分离上清液合并，即为L-辛弗林原料液，用于下步制备L-辛弗林脱糖液。

(2)制备L-辛弗林脱糖液

在第(1)步完成之后，先将第(1)步收集的L-辛弗林原料液泵入超滤器中，用截留分子量为5000Da的超滤膜，在0.15MPa的压力下进行超滤分离，分别收集滤过液和截留液。对收集的截留液，主要含有大分子糖类和蛋白质，用作发酵食用菌的添加剂；对于收集的滤过液，即为L-辛弗林脱糖液，用于下步制备L-辛弗林脱色液。

(3)制备L-辛弗林脱色液

取已活化的NKA-12大孔吸附树脂湿法装柱，按照大孔吸附树脂体积：第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液体积的比为1L∶4L的比例，将第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液泵入装有NKA-12大孔吸附树脂的层析柱中，控制L-辛弗林脱糖液泵入流速为NKA-12大孔吸附树脂体积的3倍/小时(BV/h)，进行脱色处理。处理完成后分别收集吸附着色素的NKA-12大孔吸附树脂柱和流出的柱后液；对收集的吸附着色素的NKA-12大孔吸附树脂柱，先用4倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和洗涤后的吸附着色素的NKA-12大孔吸附树脂柱；对收集的水洗液，与流出的柱后液合并，即为L-辛弗林脱色液，用于下步制备L-辛弗林脱寡糖液；对收集的洗涤后的吸附着色素的NKA-12大孔吸附树脂柱，用pH为10.0、乙醇浓度为40％水溶液洗脱，洗脱液流速为3倍树脂体积/小时(BV/h)。分别收集洗脱液和脱附着色素的NKA-12大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液，含大量黄色素，用于减压浓缩回收乙醇并制备黄色素；对收集的脱附色素的NKA-12大孔吸附树脂柱，用4倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和水洗后的NKA-12大孔吸附树脂柱，对收集的水洗液，泵入水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的水洗后的NKA-12大孔吸附树脂柱，可用于下批次吸附色素处理。

(4)制备L-辛弗林脱寡糖液

在第(3)步完成之后，按第(3)步制备出的L-辛弗林脱色液体积：95％乙醇体积比为1L∶2L的比例，向脱色液中加入95％乙醇，搅拌20min后静置3h，过滤并收集滤液和滤渣。对收集的滤渣，用于制备高纯度寡糖；对收集的滤液，在50℃、真空度为-0.07MPa的条件下，进行真空减压浓缩。分别收集真空减压浓缩液和冷凝液，对收集的冷凝液，主要含乙醇，调配后用于配制乙醇浓度为50％的洗脱水溶液；对收集的浓缩液，即为L-辛弗林脱寡糖液，用于下步制备L-辛弗林反渗透浓缩液。

(5)制备L-辛弗林反渗透浓缩液

第(4)步完成后，先将第(4)步收集的L-辛弗林脱寡糖液泵入反渗透器中，在0.4MPa的压力下进行反渗透浓缩，分别收集反渗透滤过液及截留液。对收集的滤过液，调节酸度后用于从下一批次的枳实粉中提取L-辛弗林；对收集的截留液，即L-辛弗林反渗透浓缩液，用于下步制备L-辛弗林冻干粉。

(6)制备L-辛弗林冻干粉

第(5)步完成之后，先将第(5)步制备的L-辛弗林反渗透浓缩液在-20℃下，预冻4小时，再置于冷冻干燥机中，在真空度为40Pa、温度为-50℃的条件下，冷冻干燥27小时，就制备出L-辛弗林冻干粉。

(6)树脂的再生

将用了12次后的NKA-12大孔吸附树脂，用蒸馏水冲洗至流出液清澈不浑浊；再依次用2倍树脂体积的95％乙醇、蒸馏水、5％HCl、蒸馏水、5％NaOH浸泡搅拌2h，蒸馏水洗至中性，备用。

实施例4

一种制备高纯度L-辛弗林的方法，其具体步骤如下。

(1)制备L-辛弗林原料液

以市售枳实为原料，用粉碎机粉碎后过20目的筛网，未过网的颗粒进行下一批次的粉碎，过网的粉末进行提取L-辛弗林操作。按枳实粉末质量：0.1mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶10L的比例，将枳实粉末分散在0.1mol/L的盐酸水溶液中，先浸泡2h后，再搅拌5h，进行第一次提取，接着将提取物在8000r/min的条件下进行第一次离心分离20min，分别收集第一次离心分离上清液和沉淀；对收集的第一次离心分离沉淀，按枳实粉末质量：0.1mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶6L的比例，先将第一次离心沉淀分散于0.1mol/L盐酸水溶液中，再搅拌5h，进行第二次提取，接着将第二次提取物在8000r/min的条件下进行第二次离心分离20min，分别收集第二次离心分离的上清液和沉淀。对收集的第二次离心分离沉淀，用于进一步提取橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷；对收集的第二次离心分离上清液，与第一次离心分离上清液合并，即为L-辛弗林原料液，用于下步制备L-辛弗林脱糖液。

(2)制备L-辛弗林脱糖液

在第(1)步完成之后，先将第(1)步收集的L-辛弗林原料液泵入超滤器中，用截留分子量为10000Da的超滤膜，在0.2MPa的压力下进行超滤分离，分别收集滤过液和截留液。对收集的截留液，主要含有大分子糖类和蛋白质，用作发酵食用菌的添加剂；对于收集的滤过液，即为L-辛弗林脱糖液，用于下步制备L-辛弗林脱色液。

(3)制备L-辛弗林脱色液

取已活化的NKA-9大孔吸附树脂湿法装柱，按照大孔吸附树脂体积：第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液体积的比为1L∶5L的比例，将第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液泵入装有NKA-9大孔吸附树脂的层析柱中，控制L-辛弗林脱糖液泵入流速为NKA-9大孔吸附树脂体积的5倍/小时(BV/h)，进行脱色处理。处理完成后分别收集吸附着色素的NKA-9大孔吸附树脂柱和流出的柱后液；对收集的吸附着色素的NKA-9大孔吸附树脂柱，先用3～5倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和洗涤后的吸附着色素的NKA-9大孔吸附树脂柱；对收集的水洗液，与流出的柱后液合并，即为L-辛弗林脱色液，用于下步制备L-辛弗林脱寡糖液；对收集的洗涤后的吸附着色素的NKA-9大孔吸附树脂柱，用pH为10.5、乙醇浓度为60％水溶液洗脱，洗脱液流速为5倍树脂体积/小时(BV/h)。分别收集洗脱液和脱附着色素的NKA-9大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液，含大量黄色素，用于减压浓缩回收乙醇并制备黄色素；对收集的脱附色素的NKA-9大孔吸附树脂柱，用5倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和水洗后的NKA-9大孔吸附树脂柱，对收集的水洗液，泵入水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的水洗后的NKA-9大孔吸附树脂柱，可用于下批次吸附色素处理。

(4)制备L-辛弗林脱寡糖液

在第(3)步完成之后，按第(3)步制备出的L-辛弗林脱色液体积：95％乙醇体积比为1L∶3L的比例，向脱色液中加入95％乙醇，搅拌30min后静置4h，过滤并收集滤液和滤渣。对收集的滤渣，用于制备高纯度寡糖；对收集的滤液，在55℃、真空度为-0.09MPa的条件下，进行真空减压浓缩。分别收集真空减压浓缩液和冷凝液，对收集的冷凝液，主要含乙醇，调配后用于配制乙醇浓度为60％的洗脱水溶液；对收集的浓缩液，即为L-辛弗林脱寡糖液，用于下步制备L-辛弗林反渗透浓缩液。

(5)制备L-辛弗林反渗透浓缩液

第(4)步完成后，先将第(4)步收集的L-辛弗林脱寡糖液泵入反渗透器中，在0.6MPa的压力下进行反渗透浓缩，分别收集反渗透滤过液及截留液。对收集的滤过液，调节酸度后用于从下一批次的枳实粉中提取L-辛弗林；对收集的截留液，即L-辛弗林反渗透浓缩液，用于下步制备L-辛弗林冻干粉。

(6)制备L-辛弗林冻干粉

第(5)步完成之后，先将第(5)步制备的L-辛弗林反渗透浓缩液在-30℃下，预冻5小时，再置于冷冻干燥机中，在真空度60Pa、温度为-60℃的条件下，冷冻干燥30小时，就制备出L-辛弗林冻干粉。

(6)树脂的再生

将用了10次后的NKA-9大孔吸附树脂，用蒸馏水冲洗至流出液清澈不浑浊；再依次用2倍树脂体积的95％乙醇、蒸馏水、5％HCl、蒸馏水、5％NaOH浸泡搅拌2h，蒸馏水洗至中性，备用。

Claims (1)

1.一种制备L-辛弗林的方法，其特征在于具体方法步骤如下：

(1)制备L-辛弗林原料液

以市售枳实为原料，用粉碎机粉碎后过20目的筛网，未过筛网的颗粒进行下一批次的粉碎，过筛网的粉末进行提取L-辛弗林操作，按枳实粉末质量：0.05～0.1mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶8～10L的比例，将枳实粉末分散在0.05～0.1mol/L的盐酸水溶液中，先浸泡1～2h后，再搅拌3～5h，进行第一次提取，接着将提取物在6000～8000r/min的条件下进行第一次离心分离10～20min，分别收集第一次离心分离上清液和沉淀；对收集的第一次离心分离沉淀，按枳实粉末质量：0.05～0.1mol/L盐酸溶液体积之比为1kg∶4～6L的比例，先将第一次离心沉淀分散于0.05～0.1mol/L盐酸水溶液中，再搅拌3～5h，进行第二次提取，接着将第二次提取物在6000～8000r/min的条件下进行第二次离心分离10～20min，分别收集第二次离心分离的上清液和沉淀，对收集的第二次离心分离沉淀，用于进一步提取橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷；对收集的第二次离心分离上清液，与第一次离心分离上清液合并，即为L-辛弗林原料液，用于下步制备L-辛弗林脱糖液；

(2)制备L-辛弗林脱糖液

在第(1)步完成之后，先将第(1)步收集的L-辛弗林原料液泵入超滤器中，用截留分子量为3000～10000Da的超滤膜，在0.05～0.2MPa的压力下进行超滤分离，分别收集滤过液和截留液，对收集的截留液，主要含有大分子糖类和蛋白质，用作发酵食用菌的添加剂；对于收集的滤过液，即为L-辛弗林脱糖液，用于下步制备L-辛弗林脱色液；

(3)制备L-辛弗林脱色液

取已活化的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂湿法装柱，按照大孔吸附树脂体积：第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液体积的比为1L∶5～15L的比例，将第(2)步制备出的L-辛弗林脱糖液泵入装有D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂的层析柱中，控制L-辛弗林脱糖液泵入流速为D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂体积的1～5倍/小时，进行脱色处理，处理完成后分别收集吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱和流出的柱后液；对收集的吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，先用3～5倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和洗涤后的吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱；对收集的水洗液，与流出的柱后液合并，即为L-辛弗林脱色液；对收集的水洗后的吸附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，用pH为9.5～10.5、乙醇浓度为30％～60％的水溶液洗脱，洗脱液流速为1～5倍树脂体积/小时，分别收集洗脱液和脱附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液，含大量黄色素，用于减压浓缩回收乙醇并制备黄色素；对收集的脱附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，用3～5倍树脂体积的蒸馏水冲洗，分别收集水洗液和水洗后的脱附色素的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，对收集的水洗液，泵入水处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的水洗后脱附色素的的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂柱，可用于下批次吸附色素处理；

(4)制备L-辛弗林脱寡糖液

在第(3)步完成之后，按第(3)步制备出的L-辛弗林脱色液体积：95％乙醇体积比为1L∶1～3L的比例，向脱色液中加入95％乙醇，搅拌10～30min后静置2～4h，过滤并收集滤液和滤渣，对收集的滤渣，用于制备高纯度寡糖；对收集的滤液，在40～55℃、真空度为-0.06MPa～-0.09MPa的条件下，进行真空减压浓缩，分别收集真空减压浓缩液和冷凝液，对收集的冷凝液，主要含乙醇，调配成乙醇浓度为30％～60％的洗脱水溶液，用于下批次洗脱黄色素；对收集的浓缩液，即为L-辛弗林脱寡糖液；

(5)制备L-辛弗林反渗透浓缩液

第(4)步完成后，先将第(4)步收集的L-辛弗林脱寡糖液泵入反渗透器中，在0.2～0.6MPa的压力下进行反渗透浓缩，分别收集反渗透滤过液及截留液，对收集的滤过液，调节酸度后用于从下一批次的枳实粉中提取L-辛弗林；对收集的截留液，即L-辛弗林反渗透浓缩液；

(6)制备L-辛弗林冻干粉

第(5)步完成之后，先将第(5)步制备的L-辛弗林反渗透浓缩液在-10～-30℃下，预冻3～5小时，再置于冷冻干燥机中，在真空度为20～60Pa、温度为-40～-60℃的条件下，冷冻干燥24～30小时，就制备出L-辛弗林冻干粉；

(6)树脂的再生

将用了10～15次后的D3520、或X-5、或NKA-12、或NKA-9大孔吸附树脂，用蒸馏水冲洗至流出液清澈不浑浊；再依次用2～3倍树脂体积的95％乙醇、蒸馏水、5％HCl、蒸馏水、5％NaOH浸泡搅拌2h，最后用蒸馏水洗至中性，备用。