CN103382483B - OsNRRa蛋白或其编码基因在调节植物开花时间中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种OsNRRa蛋白或其编码基因在调节植物开花时间中的应用。本发明提供的应用，所述OsNRRa为如下1）或2）：1）由序列表中序列1所示的核苷酸序列；2）由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的实验证明，通过改变植物中NRR(nutrition response and root growth)基因（水稻中OsNRRa基因及其他单子叶植物中的直系同源基因，菊花中ChNRRa基因及其他双子叶植物中的直系同源基因）的表达水平，调节植物花期。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种OsNRRa蛋白或其编码基因在调节植物开花时间中的应用。
背景技术
植物开花受体内和环境众多因素的影响，例如发育阶段、激素、光照和温度等。在农作物的生长过程中，开花时间的不同将直接影响作物产量。
发明内容
本发明的一个目的是提供OsNRRa蛋白或其编码基因的应用。
本发明提供了OsNRRa蛋白或其编码基因在如下1）-3）中的应用：
1）调节植物开花时间；
2）调节植物抽穗时间；
3）调节植物开花率；
所述OsNRRa蛋白的氨基酸序列为序列表中序列5。
上述应用中，所述OsNRRa的编码基因为如下a）-c）中任意一种：
a)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；
b）序列表中序列1自5’末端第140-1123位核苷酸；
c）序列表中序列1自5’末端第182-1111位核苷酸。
上述应用中，所述调节植物开花时间为加快植物开花时间或滞后植物开花时间；
所述调节植物抽穗时间为滞后植物抽穗时间；
所述调节植物开花率为提高植物开花率。
上述应用中，所述OsNRRa蛋白或其编码基因在滞后植物开花时间或滞后植物抽穗时间中的应用为将所述OsNRRa的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物A，所述转基因植物A的开花时间或抽穗时间均晚于所述目的植物；
所述OsNRRa蛋白或其编码基因在加快植物开花时间或提高植物开花率中的应用为抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的表达，得到转基因植物B，所述转基因植物B具有如下1）或2）中至少一种特征：
1）所述转基因植物B的开花时间早于所述目的植物；
2）所述转基因植物B的开花率大于所述目的植物。
上述应用中，所述OsNRRa编码基因通过重组载体A导入目的植物；
所述重组载体A具体为将所述OsNRRa编码基因插入植物表达载体pCambia1300-MCS的BamHI和Sac I位点间，得到表达所述OsNRRa编码基因的载体；
所述抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的表达通过将重组载体B导入所述目的植物中实现；
所述重组载体B为如下1）或2）：
1）为将DNA分子1插入植物表达载体IPK的EcoRI和XbaI位点间，得到抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的载体；
2）为将DNA分子2插入植物表达载体pCambia1300-MCS中的XbaI和SacI酶切位点间，得到抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的载体；
所述DNA分子1的核苷酸序列为序列表中序列2
所述DNA分子2的核苷酸序列为序列表中序列3；
上述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。
本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物A的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述OsNRRa的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物A，所述转基因植物A的开花时间或抽穗时间均晚于所述目的植物。
上述方法中，所述OsNRRa编码基因通过上述应用中的所述重组载体A导入目的植物；
所述目的植物具体为单子叶植物，所述单子叶植物进一步具体为水稻。
本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物B的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制或失活目的植物中的所述OsNRRa编码基因的表达，得到转基因植物B，所述转基因植物B具有如下1）或2）中至少一种特征：
1）所述转基因植物B的开花时间早于所述目的植物；
2）所述转基因植物B的开花率大于所述目的植物；
上述方法中，所述抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的表达通过将上述应用中的所述重组载体B导入所述目的植物实现；
所述目的植物具体为单子叶植物，所述单子叶植物进一步具体为水稻。
本发明的第四个目的还提供了如下重组载体A或重组载体B或DNA分子。
本发明提供的重组载体A为将所述OsNRRa编码基因插入植物表达载体pCambia1300-MCS的BamHI和Sac I位点间，得到表达所述OsNRRa编码基因的载体；
本发明提供的重组载体B为如下1）或2）：
1）为将DNA分子1插入植物表达载体IPK，得到抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的载体；
2）为将DNA分子2插入植物表达载体pCambia1300-MCS中，得到抑制或失活目的植物中所述OsNRRa编码基因的载体；
所述DNA分子1的核苷酸序列为序列表中序列2
所述DNA分子2的核苷酸序列为序列表中序列3；
本发明提供的DNA分子为如下1）或2）：
1）序列表中的序列2所示的DNA分子；
2）序列表中的序列3所示的DNA分子。
本发明的实验证明，通过改变植物中NRR(nutrition response and root growth)基因（水稻中OsNRRa基因）的表达水平，调节植物花期，在重要单子叶农作物水稻上验证了单独调节OsNRRa基因的表达水平就可以调节植物花期，过表达后的转基因植物花期滞后，抑制OsNRRa基因表达的转基因植物的花期提前；因此，本发明发现了简单有效的调节植物开花的新方法，在农作物生产中将具有重大应用潜力。
附图说明
图1为水稻OsNRRa过表达和RNAi抑制表达载体的构建示意图
(A)由CaMV 35S启动子驱动的OsNRRa及CCTmotif的过量表达载体(35S:OsNRRa和35S:CCT),Ex1,Ex2,Ex3和Ex4分别表示外显子；(B)OsNRRa RNAi沉默表达载体。OsNRRa-RNAi是通过长片段发卡结构的RNAi方法构建的载体；(C)amiR-OsNRRa是通过人工microRNA方法构建的载体。
图2为OsNRRa过表达和RNAi抑制表达转基因水稻的开花表型及其分子检测
(A)OsNRRa-OX(35S:OsNRRa)转基因植株的晚穗表型；
(B)和(C)分别是OsNRRa-OX和OsNRRa-RNAi植株的半定量RT-PCR检测分析；
(D)OsNRRa沉默转基因植株的开花百分比对比分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表1为下面实施例中所用的引物序列
实施例1、OsNRRa基因在调节水稻抽穗时间中的应用
采用水稻‘日本晴’（Oryza sativa ssp.japonica‘Nipponbare’，记载在章俊丽,杨鵾,张玉满,颜永胜,赵志强,方荣祥,孙宗修,傅亚萍,陈晓英.(2009)水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析.生物工程学报,25(9):1394-1401.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）进行基因的转化材料。
一、过表达载体和RNA干扰载体的构建
1、过表达载体的构建
1）OsNRRa过表达载体p 1300-35S-OsNRRa（35S:OsNRRa）的构建
采用TRIZOL方法从水稻‘日本晴’的根中提取总RNA，并按照TURBO DNA-freeTMKit说明(Applied Biosystems,AM1907)用TURBO DNase处理后，采用InvitrogensuperscriptTM III第一链合成系统(Cat.No.18080-051)将其反转录为cDNAs，采用特异引物对NaF/NaR(表1)进行PCR扩增，得到984bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列1自5’末端第140-1123位核苷酸，为水稻OsNRRa基因的cDNA片段，命名为OsNRRa，其编码区为序列1自5’端第182-1111位核苷酸，其编码的蛋白命名为OsNRRa，氨基酸序列为序列表中的序列5。
将上述PCR产物经Ram HI和Sac I酶切，得到的酶切产物与植物表达载体pCambia1300-MCS（章俊丽,杨鵾,张玉满,颜永胜,赵志强,方荣祥,孙宗修,傅亚萍,陈晓英.(2009)水稻OsCIPK1O基因的克隆和功能分析.生物工程学报,25(9):1394-1401.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）连接，得到植物表达载体p1300-35S-OsNRRa。经过测序，该载体为将序列表中序列1所示的自5’末端第140-1123位核苷酸插入pCambia1300-MCS载体的Bam HI和Sac I位点间得到的载体，其中OsNRRa由Cauliflower mosaic virus 35S启动子(CaMV 35S)驱动（图1A上图）。
2）、对照过表达载体p1300-35S-CCT(35S:CCT)的构建
以上述水稻‘日本晴’根的cDNA为模板，用特异引物CCT-F和NaR（表1）扩增CCT-motif片段（276bp）。用Bam HI和Sac I酶切CCT-motif片段，将酶切产物与经过同样酶切的pCambia1300-MCS载体连接，得到植物表达载体p1300-35S-CCT（图1A下图）。
经过测序，该p1300-35S-CCT为将序列表中序列1自5’末端第848-1123位核苷酸插入pCambia1300-MCS载体Bam HI和Sac I酶切位点间得到的载体。
2、OsNRRa基因沉默载体的构建
1）OsNRRa RNAi沉默表达载体pOsNRRa-RNAi的构建(图1B)
为了在水稻中抑制OsNRR的表达，将OsNRR的5'端cDNA（505bp,序列1：310-814bp）作为沉默靶标，通过PCR扩增,以OsNRRcDNA（序列1）为模板，分别用特异引物对RiF1/RiR1和RiF2/RiR2（表1）扩增了靶标片段的正向片段（505bp）和反向片段（505bp）。将正向片段（505bp）和反向片段（505bp）分别通过EcoRI/KpnI和XbaI/BamHI双酶切后克隆到沉默植物表达载体IPK上（章俊丽,杨鵾,张玉满,颜永胜,赵志强,方荣祥,孙宗修,傅亚萍,陈晓英.(2009)水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析.生物工程学报,25(9):1394-1401.公众可从中国科学院微生物研究所获得。），得到OsNRRa基因沉默的植物表达载体pOsNRRa-RNAi，其中由CaMV 35S驱动靶标基因的正反向片段的表达，经过测序为该载体为将序列2插入植物表达载体IPK的EcoRI和Xba I位点间（图1B）。
序列2的自5’末端第6-510位核苷酸为正向片段（为序列1自5’末端第310-814bp核苷酸），序列2的自5’末端第1324-1828位核苷酸为反向片段，序列2的自5’末端第515-1319位核苷酸为内含子，且其中正向片段和反向片段的序列为反向互补。
2）人工miRNA表达载体pamiR-OsNRRa-130的构建(图1C)
以水稻miR159a为骨架，通过用针对OsNRRa基因的cDNA片段置换miR159a中成熟miRNA片段，构建在水稻中特异抑制OsNRRa表达的人工miRNA，amiR-OsNRRa，具体如下：
采用引物159NaF/159NaR（表1），以T-159a质粒（Yuman Zhang,Yongsheng Yan,Lina Wang,Kun Yang,Na Xiao,Yunfeng Liu,Yaping Fu,Zongxiu Sun,RongxiangFang,Xiaoying Chen.(2012)A novel rice gene,NRR responds to macronutrientdeficiency and regulates root growth.Mol.Plant 5:63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）为模板，PCR扩增得到272bp的片段，经过测序，该片段的核苷酸序列为序列表中的序列3，命名为amiR-OsNRRa，由amiR-OsNRRa编码基因产生的成熟RNA序列为序列4，为成熟miRNA序列被OsNRRa靶标序列5'-GAAGAGAAACTTTGGCAGAAA-3'（位于OsNRRa的第三个外显子,序列2：985-1005bp）的互补序列取代的miR159a前体骨架的片段。
将该片段通过XbaI/SacI双酶切构建到植物表达载体pCambia1300-MCS，得到载体pamiR-OsNRRa-130，经过测序该载体为将序列表中的序列3插入表达载体pCambia1300-MCS的XbaI和SacI酶切位点间得到的载体，且CaMV 35S驱动ami R-OsNRRa表达。
二、过表达转基因水稻和OsNRR基因沉默转基因水稻的获得
1、转基因水稻的获得
将上述p1300-35S-OsNRRa、p1300-35S-CCT、pOsNRRa-RNAi、pamiR-OsNRRa-130分别转入农杆菌（Argrobactium tumefaciens）EHA105（章俊丽,杨鵾,张玉满,颜永胜,赵志强,方荣祥,孙宗修,傅亚萍,陈晓英.(2009)水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析.生物工程学报,25(9):1394-1401.公众可从中国科学院微生物研究所获得。），通过农杆菌介导的转化系统转化水稻‘日本晴’（以下简称野生型水稻），分别得到86株T0代OsNRRa-OX水稻（转p1300-35S-OsNRRa，过表达）、52株T0代CCT-OX水稻（转p1300-35S-CCT水稻，过表达）、110株T0代OsNRRa-RNAi水稻（转pOsNRRa-RNAi水稻，基因沉默）、52株T0代miROsNRRa水稻（转pamiR-OsNRRa-130水稻，基因沉默）。
采用相同的方法将空载体pCAMBIA1300和IPK转入水稻‘日本晴’，分别得到T0代转pCAMBIA1300水稻和T0代转IPK水稻作为阴性对照。
2、RT-PCR分析鉴定转基因水稻
参照文献Spencer&Christensen（1999）的半定量RT-PCR方法分析基因的表达水平，real-t ime PCR实验采用Real-t ime PCR Master Mix(TOYOBO,QPK-201)分析转基因水稻中OsNRRa的表达水平。用下述不同的引物对鉴定阳性转基因植物：
用于检测阳性T0代OsNRRa-OX水稻和阳性T0代CCT-OX水稻的引物为R4-F/R4-R（表1），提取转基因水稻的RNA，反转录得到cDNA作为模板，进行RT-PCR扩增，结果如图2B所示，其中WT为野生型水稻，OsNRRa-OX水稻和CCT-OX水稻均产生199bp产物且表达量高于野生型水稻的为阳性植株，得到32株阳性T0代OsNRRa-OX水稻和20株阳性T0代CCT-OX水稻。
用于检测阳性T1代OsNRRa-RNAi水稻纯系和阳性T1代miROsNRRa水稻纯系的引物对是14F/14R，提取转基因水稻的RNA，反转录得到cDNA作为模板，进行RT-PCR扩增，结果如图2C所示，其中CK为T1代转pCAMBIA1300水稻纯系，与CK中的表达量对比，在OsNRRa-RNAi阳性植株中OsNRRa的表达量很低，即产生781bp的PCR产物量极少，得到18株阳性T1代OsNRRa-RNAi水稻独立纯系和13株阳性T1代转miROsNRRa水稻独立纯系。
T0代转pCAMBIA1300水稻和T0代转IPK水稻采用上述方法鉴定，结果与野生型水稻无显著差异。
将上述T0代进行播种、传代，得到T1代纯系。
三、OsNRRa在调节水稻抽穗时间和调节开花时间的应用
将上述得到的T1代OsNRRa-OX水稻、T1代CCT-OX水稻、T1代OsNRRa-RNAi水稻和T1代转miROsNRRa水稻分别播种在中国海南陵水实验田（1-4月份）和北京农场实验田（5-10月份），以野生型水稻、T1代转pCAMBIA1300水稻和T1代转IPK水稻为对照。
每个株系30株，实验重复三次，结果取平均值。
1）过表达延迟抽穗时间
在单子叶植物如水稻、小麦等的生长周期中，植物生长状态由营养生长至生殖生长转换的重要标志是抽穗（heading），水稻抽穗后约一周时间就陆续开花。因此抽穗时期的早晚决定着开花时期。
统计抽穗时间和开花时间：
实验室催芽（首先将水稻干种子用75%乙醇浸泡2min后，迅速换为10%次氯酸钠溶液消毒30min,用蒸馏水漂洗至少三次后，在28℃催芽2天，期间换水2次）后的T1代OsNRRa-OX水稻和野生型水稻在海南实验田播种后第97天拍照，结果如图2A所示，可以看出，与野生型水稻相对比，OsNRRa-OX（T1代OsNRRa-OX水稻）的抽穗时期明显延迟，当野生型(左)处于种子成熟期时，OsNRRa-OX植株(右)仅处于初穗时期。
在中国海南陵水实验田中，野生型水稻在播种后85天抽穗，而T1代OsNRRa-OX植株在播种后97天抽穗，延迟了12天，表现明显的晚穗性状，即抽穗时期推迟。由于抽穗时期的早晚决定着开花时期，因此T1代OsNRRa-OX植株的开花时间比野生型水稻延迟了12天（T1代OsNRRa-OX植株在播种后第104天开花）。
在北京农场种植时，野生型植株在播种后116天抽穗，而T1代OsNRRa-OX植株则在播种后133至143天抽穗，推迟了17-27天，由于抽穗时期的早晚决定着开花时期，因此T1代OsNRRa-OX植株的开花时间比野生型水稻延迟了17-27天（T1代OsNRRa-OX植株在播种后第140-150天开花）。
由OsNRRa过量表达的植株连续繁殖至少3代，其晚穗表型遗传稳定。
T1代CCT-OX水稻、T1代转pCAMBIA1300水稻和T1代转IPK水稻的抽穗时间和开花时间与野生型水稻的结果对比没有明显差异。
2）基因沉默提前开花时间或提高开花率
统计北京实验田中编号为1和2的T1代OsNRRa-RNAi水稻、编号为1和2的T1代转miROsNRRa水稻、野生型水稻、T1代转pCAMBIA1300水稻在不同时间的开花百分比。实验重复三次，结果取平均值。
结果如图2D所示，
编号为1的阳性T1代OsNRRa-RNAi水稻（OsNRRa-RNAi-1）在播种后第108、110、112天的开花百分比分别为60%、96%、100%；
编号为2的阳性T1代OsNRRa-RNAi水稻（OsNRRa-RNAi-2）在播种后第108、110、112、114天的开花百分比分别为26.67%、83.33%、96.67%、100%；
编号为1的阳性T1代转miROsNRRa水稻（miROsNRRa-1）在播种后第108、110、112、114天的开花百分比分别为0%、36.67%、76.67%、100%；
编号为2的阳性T1代转miROsNRRa水稻（miROsNRRa-2）在播种后第108、110、112、114天的开花百分比分别为0%、31.03%、65.52%、100%；
野生型水稻（wild type）在播种后第108、110、112、114、116天的开花百分比分别为0%、0%、30.88%、75%、100%；
T1代转pCAMBIA1300水稻在播种后第108、110、112、114、116天的开花百分比分别为0%、3.33%、20.00%、83.33%、100%；
可以看出，T1代OsNRRa-RNAi水稻、T1代转miROsNRRa水稻比野生型和T1代转pCAMBIA1300水稻的开花率均高，在播种后108-112天即表现了较高的开花百分比。说明沉默了OsNRRa可以提前开花。
Claims (6)
1.OsNRRa蛋白或其编码基因在如下1）-3）中的应用：
1）加快水稻开花时间或滞后水稻开花时间；
2）滞后水稻抽穗时间；
3）提高水稻开花率；
所述OsNRRa蛋白的氨基酸序列为序列表中序列5；
所述OsNRRa蛋白或其编码基因在滞后水稻开花时间或滞后水稻抽穗时间中的应用为将所述OsNRRa的编码基因导入目的水稻中，得到转基因水稻A，所述转基因水稻A的开花时间或抽穗时间均晚于所述目的水稻；
所述OsNRRa蛋白或其编码基因在加快水稻开花时间或提高水稻开花率中的应用为抑制或失活目的水稻中所述OsNRRa编码基因的表达，得到转基因水稻B，所述转基因水稻B具有如下1）或2）中至少一种特征：
1）所述转基因水稻B的开花时间早于所述目的水稻；
2）所述转基因水稻B的开花率大于所述目的水稻。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述OsNRRa的编码基因为如下a）-c）中任意一种：
a) 序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；
b）序列表中序列1自5’末端第140-1123位核苷酸；
c）序列表中序列1自5’末端第182-1111位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述OsNRRa编码基因通过重组载体A导入目的水稻；
所述重组载体A为将所述OsNRRa编码基因插入植物表达载体pCambia1300-MCS中，得到表达所述OsNRRa编码基因的载体；
所述抑制或失活目的水稻中所述OsNRRa编码基因的表达通过将重组载体B导入所述目的水稻中实现；
所述重组载体B为如下1）或2）：
1）为将DNA分子1插入植物表达载体IPK，得到抑制或失活目的水稻中所述OsNRRa编码基因的载体；
2）为将DNA分子2插入植物表达载体pCambia1300-MCS中，得到抑制或失活目的水稻中所述OsNRRa编码基因的载体；
所述DNA分子1的核苷酸序列为序列表中序列2；
所述DNA分子2的核苷酸序列为序列表中序列3。
4.一种培育转基因水稻A的方法，包括如下步骤：将权利要求2的应用中的所述OsNRRa编码基因导入目的水稻中，得到转基因水稻A，所述转基因水稻A的开花时间或抽穗时间均晚于所述目的水稻。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述OsNRRa编码基因通过权利要求3的应用中的所述重组载体A导入目的水稻。
6.一种培育转基因水稻B的方法，包括如下步骤：抑制或失活目的水稻中的所述OsNRRa编码基因的表达，得到转基因水稻B，
所述转基因水稻B具有如下1）或2）中至少一种特征：
1）所述转基因水稻B的开花时间早于所述目的水稻；
2）所述转基因水稻B的开花率大于所述目的水稻；
所述抑制或失活目的水稻中所述OsNRRa编码基因的表达通过将权利要求3的应用中的所述重组载体B导入所述目的水稻实现。
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