CN103360607A - 一种磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束的制备方法，属于载体与缓释材料技术领域。本发明用γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)修饰过的磁性纳米粒子四氧化三铁(Fe3O4-OH)为成核起始物，利用磁性纳米粒子表面羟基引发丙交酯(LA)进行活性开环聚合，得到具有磁性的星型聚合物作为核，核的尺寸和磁响应性与LA和Fe3O4-OH的比例有关，该星型聚合物与经羧基化的聚乙二醇单甲醚(CMPEG)进行酯化反应，合成一种星型嵌段磁响应性纳米胶束，其对外磁场具有响应性，有利于胶束传输过程的磁导向作用，从而使其具有优异的载药和靶向控释效果。本发明制备纳米胶束方法方便，结构规整，核、壳尺寸可控，生物相容性好，对人体无毒副作用。
Description
技术领域
一种磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束的制备方法，涉及一种生物可降解的纳米胶束药物载体的合成，属于载体与缓释材料技术领域。
背景技术
制备具有结构稳定、粒径合适、体内循环时间长、安全性好、具有靶向性的药物载体一直是国内外研究者们追求的目标。
Bahar等将悬浮有Fe3O4的油相倒入水相，搅拌，然后在室温下蒸发油相溶剂氯仿，制得带有反应性醛基的磁性聚苯乙烯微球，并将其用于固定化葡萄糖淀粉酶的研究。Yen等在FeCl2和FeCl3的酸性水溶液中溶解壳聚糖，然后通过控制pH值得到磁性壳聚糖微球。
本发明选用经化学修饰后的磁性纳米四氧化三铁为成核的起始物，然后用表面含有多羟基的Fe3O4-OH引发LA进行活性开环聚合，得到具有磁性的星型聚合物作为核，最后星型聚合物与CMPEG进行酯化反应，合成一种磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束。
由于磁性四氧化三铁纳米粒子与聚乳酸以共价键结合，增加了纳米胶束的稳定性，优于以往的物理混杂式磁性纳米胶束，同时可通过改变聚乳酸链段的长度来控制胶束尺寸的大小。
发明内容
本发明目的是提供一种星型嵌段磁响应性纳米胶束的制备方法，选用经化学修饰后的磁性纳米四氧化三铁为成核的起始物，然后用表面含多羟基的Fe3O4引发LA的活性开环聚合，最后星型聚合物与CMPEG进行酯化反应，合成一种磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束。
本发明的技术方案：
(1)制备Fe3O4-OH纳米粒子核心：在氮气保护下，将计量的氨水滴加至计量的FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液中，于60℃剧烈搅拌1h；再在80℃下熟化1h，用无水乙醇反复洗涤至中性；挥发掉乙醇得磁性纳米四氧化三铁粒子，将KH-560在酸性条件下水解，将磁性纳米四氧化三铁粒子超声震荡分散于乙醇中；接着将水解后的KH-560注入四氧化三铁乙醇溶液中，于80℃剧烈搅拌2h，反应产物依次用乙醇，水洗至中性，然后真空干燥即得黑色粉末多氨基磁性四氧化三铁纳米粒子Fe3O4-OH；
(2)Fe3O4-OH引发D，L-丙交酯的活性开环聚合：称取一定量的Fe3O4-OH和LA置于烧瓶中，LA和Fe3O4-OH的质量比为20∶1～200∶1，在氮气环境下以甲苯为溶剂，135℃油浴下搅拌熔融5min，接着加入一定量的辛酸亚锡-甲苯溶液，辛酸亚锡的用量为LA质量的0.5％，于135℃下反应24h；产物用二氯甲烷溶解，然后用正己烷沉淀三次，得灰黑色粘稠液体，真空干燥得结构规整的星型聚合物磁性纳米四氧化三铁-聚乳酸Fe3O4-PLA；
(3)CMPEG的合成：在无水条件下称取一定量的MPEG溶解于三氯甲烷，磁力搅拌条件下加入丁二酸酐，然后将一定量的DMAP加入到上述溶液中，丁二酸酐与MPEG的摩尔比为1.1∶1，室温反应24h；反应产物用三氯甲烷溶解，然后在乙醚中沉淀三次，真空干燥即得淡黄色固体CMPEG；
(4)Fe3O4-PLA与CMPEG的酯化反应：称取一定量的Fe3O4-PLA和CMPEG溶解于适量二氯甲烷中，在氮气保护下缓慢滴入DCC和DMAP的二氯甲烷溶解，室温下搅拌24h。滤除生成的DCU沉淀后，粗产物在乙醚中沉淀纯化，将产物溶解于四氢呋喃中，透析出去未反应的CMPEG，经冷冻干燥得星形Fe3O4-PLA-PEG嵌段共聚物。进行磁性能表征。
(5)Fe3O4-PLA-PEG胶束的制备：将Fe3O4-PLA-PEG聚合物配成初始质量分数为1％的N，N-二甲基甲酰胺溶液，并用微孔过滤膜过滤，得聚合物母液；搅拌下向母液中滴加超纯水至Fe3O4-PLA-PEG聚合物质量分数为0.1％的溶液，形成Fe3O4-PLA-PEG胶束溶液；继续搅拌1小时后，将胶束溶液逐滴滴入等体积量的超纯水中使胶束固定，然后在去离子水中透析3天。
(6)Fe3O4-PLA-PEG胶束水溶液进行细胞毒性实验：用10％MCDB(此配养基为低血清培养基，用于人微脉管内皮细胞的培养)将对数生长期的细胞配成浓度为6×103个/mL的细胞悬浮液，每孔150μL接种于2个96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。吸出每孔中的原培养液，每孔加入150μL的阴性对照液(10％MCDB培养基)、阳性对照液(0.64％苯酚培养基)、实验组(用10％MCDB培养液稀释成0.1g/L的胶束样品)，继续置于37℃、5％CO2培养箱中培养，2块板分别培养2天、3天，每组设6个平行孔。分别于第2、3天各取出一块板测试。
所述的星型嵌段酸敏性纳米胶束的制备方法，LA和Fe3O4-OH的质量比例越大，内层核尺寸越大。
本发明的有益效果：
①本发明的磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束可用于药剂学领域中，由于磁性纳米粒子Fe3O4-OH的存在，胶束具有靶向作用。
②内层核由疏水性高的PLA组成，是一种性能优异、对环境高度友好的可降解性高分子材料，疏水性药物在其中有较高的负载量，而外层是亲水性高聚物PEG，有较好的亲水性稳定性和生理相容性。有利于胶束在水相的稳定以及对生物组织的亲合靶向作用.从而使其具有优异的载药和控释效果。
③胶束核、壳的尺寸与CMPEG和大分子引发剂的比例有关，可以自由调节。
④本发明的纳米胶束制备方便，结构规整，有靶导向作用，生物相容性好，对人体无毒副作用。
附图说明
图1磁性星型嵌段共聚物Fe3O4-PLA-PEG的合成路线。
图2Fe3O4-PLA-PEG所形成的纳米胶束的TEM图像。
图3Fe3O4，Fe3O4-PLA，Fe3O4-PLA-PEG三种物质的磁滞回线。
图4Fe3O4-PLA-PEG所形成胶束的细胞毒性实验结果。
具体实施方式
实施例1
在氮气保护下，将过量的氨水滴加7.5ml、0.5mol/l的FeCl2·4H2O和0.5gFeCl3·6H2O的混合溶液中，于60℃剧烈搅拌1h；再在80℃下熟化1h，用无水乙醇反复洗涤至中性；挥发掉乙醇得磁性纳米四氧化三铁粒子，将KH-560在酸性条件下水解，将磁性纳米四氧化三铁粒子超声震荡分散于乙醇中；接着将水解后的KH-560注入四氧化三铁乙醇溶液中，于80℃剧烈搅拌2h，反应产物依次用乙醇，水洗至中性，然后真空干燥即得黑色粉末多羟基磁性四氧化三铁纳米粒子Fe3O4-OH。
称取0.1g Fe3O4-OH和2g LA置于烧瓶中，LA与Fe3O4-OH的质量比为20∶1，在氮气环境下以甲苯为溶剂，135℃油浴下搅拌熔融5min，接着加入一定量的辛酸亚锡-甲苯溶液，辛酸亚锡的用量为LA质量的0.5％，于135℃下反应24h；产物用二氯甲烷溶解，然后用正己烷沉淀三次，得灰黑色粘稠液体，真空干燥得结构规整的星型聚合物磁性纳米四氧化三铁-聚乳酸Fe3O4-PLA。
在无水条件下称取12g MPEG溶解于三氯甲烷，磁力搅拌条件下加入1.1g丁二酸酐，然后将一定量的DMAP加入到上述溶液中，丁二酸酐与MPEG的摩尔比为1.1∶1，室温反应24h；反应产物用三氯甲烷溶解，然后在乙醚中沉淀三次，真空干燥即得淡黄色固体带有端羧基的聚乙二醇单甲醚CMPEG。
称取一定量的Fe3O4-PLA和过量的CMPEG溶解于二氯甲烷中，在氮气保护下缓慢滴入DCC和DMAP的二氯甲烷溶解，室温下搅拌24h。滤除生成的二环己基脲(DCU)沉淀后，粗产物在乙醚中沉淀纯化，将产物溶解与四氢呋喃中，透析出去未反应的CMPEG，经冷冻干燥得星形Fe3O4-PLA-PEG嵌段共聚物。
将Fe3O4-PLA-PEG聚合物配成初始质量分数为1％的N，N-二甲基甲酰胺溶液，并用微孔过滤膜过滤，得聚合物母液；搅拌下以一定速率向母液中滴加超纯水至Fe3O4-PLA-PEG聚合物质量分数为0.1％的溶液，形成Fe3O4-PLA-PEG胶束溶液；继续搅拌1小时后，将胶束溶液逐滴滴入等体积量的超纯水中使胶束固定，然后在去离子水中透析3天。
所得产物的测试结果如图2，图3和图4所示。图2显示具有磁性双亲聚合物所形成的胶束形态可以看出磁性聚合物Fe3O4-PLA-PEG已形成了形态规整，粒径均一的胶束，胶束平均粒径约为100nm。
图3为实施例1中Fe3O4，Fe3O4-PLA，Fe3O4-PLA-PEG的磁滞回线，a，b，c分别是Fe3O4，Fe3O4-PLA，Fe3O4-PLA-PEG在室温下的磁滞回曲线，从图中可以看出已制备的Fe3O4纳米粒子，聚合物Fe3O4-PLA，双亲性聚合物Fe3O4-PLA-PEG的剩磁和矫顽力都为零，这是典型的超顺磁性。它们的磁饱和强度分别为28.738emu/g，7.527emu/g，0.327emu/g。
图4为实施例1中Fe3O4-PLA-PEG胶束的细胞毒性测试结果，图中a为阴性对照组即以10％MCDB为培养基，细胞的生长情况。b为阳性对照组即以0.64％苯酚为培养基，细胞的生长情况。c为用10％MCDB培养液稀释成0.1g/L的胶束样品为培养基，培养两天后细胞的生长情况，d为用10％MCDB培养液稀释成0.1g/L的胶束样品为培养基，培养三天后细胞的生长情况。可通过倒置显微镜观察、评价细胞生长状况，如图4所示。通过SRB法计算细胞相对增值率(RGR)，根据RGR与细胞毒性等级的关系评价胶束的细胞毒性。其胶束样品细胞毒性测试等级为0级表明此胶束溶液对人体无毒害作用。
实施例2
LA和Fe3O4-OH的质量比为50∶1，其他合成过程和实施例1相同。
实施例3
LA和Fe3O4-OH的质量比为100∶1，其他合成过程和实施例1相同。
实施例4
过量CMPEG和Fe3O4-PLA(1∶20)质量比为10∶1，其他合成过程和实施例1相同。
实施例5
过量CMPEG和Fe3O4-PLA(1∶50)质量比为10∶1，其他合成过程和实施例1相同。
实施例6
过量CMPEG和Fe3O4-PLA(1∶100)质量比为10∶1，其他合成过程和实施例1相同。
Claims (4)
1.一种磁响应性星型嵌段共聚物纳米胶束，其特征是以磁性四氧化三铁纳米粒子为核，通过表面羟基引发LA聚合形成聚乳酸内层，再通过酯化反应连接亲水性的聚乙二醇外壳。该磁响应性星型嵌段共聚物的结构如图1所示。
2.一种权利要求1所述星型嵌段共聚物纳米胶束的制备方法，其特征是：首先采用共沉淀法制备磁性四氧化三铁纳米粒子，之后将KH-560在酸性条件下水解，接着将水解后的KH-560注入四氧化三铁乙醇溶液中，进行偶连反应，表面修饰四氧化三铁纳米粒子，反应产物依次用乙醇，水洗至中性，后真空干燥得表面多羟基磁性四氧化三铁纳米粒子Fe3O4-OH；然后以甲苯为溶剂，辛酸亚锡为催化剂，利用磁性纳米粒子Fe3O4-OH表面羟基引发LA的活性开环聚合得结构规整的星型聚合物磁性纳米四氧化三铁-聚乳酸Fe3O4-PLA；接着利用Fe3O4-PLA表面羟基与CMPEG端羧基在DMAP为催化剂，1，3-二环己基碳化二亚胺(DCC)为脱水剂条件下进行酯化反应，经冷冻干燥得星型四氧化三铁聚乳酸聚乙二醇(Fe3O4-PLA-PEG)嵌段共聚物；最后以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为聚合物Fe3O4-PLA-PEG的共溶剂，超纯水为聚乳酸连段的不良溶剂制备Fe3O4-PLA-PEG胶束，形成胶束的形貌如图2所示。
3.权利要求1所述的磁响应性星型嵌段共聚物Fe3O4-PLA-PEG制备的优选质量比，其特征是LA与Fe3O4-OH的质量比为20∶1～100∶1，在此比例范围内，所形成的纳米胶束具有明显的磁响应性，结果如图3所示。且LA和Fe3O4-OH的质量比例越大，内层核尺寸越大，磁性越小。CMPEG分子量在1000-5000之间所形成胶束的稳定性能良好。
4.权利要求1所述双亲性Fe3O4-PLA-PEG胶束为药物缓释材料的应用。其特征是生物相容性好，对人体无毒副作用。其样品细胞毒性测试等级为0级。照片结果如图4所示。
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