CN103353495A - 一种富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富集水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法。本发明涉及食品安全分析领域中样品前处理的新方法。本发明先通过样品预处理，再加入表面修饰有C₁₈烷烃链的超顺磁纳米或亚微米磁球吸附，洗脱，收集洗脱液。洗脱溶液可直接上液相色谱或液相色谱-质谱联用定量分析隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的含量。本发明方法具有操作流程简单、提取回收率高、洗脱溶剂用量少、无需旋蒸的特点。

Description

一种富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法

技术领域

本发明涉及食品安全分析领域中样品前处理，具体是涉及一种以C₁₈磁球富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法。 

背景技术

孔雀石绿(Malachite green,MG)属碱性三苯甲烷类染料。由于抗菌、抗寄生虫效力较强且价格便宜,被广泛用于池塘水的水体消毒和防治鱼类的水霉病、烂鳃病以及寄生虫病。MG易被水产品吸收并迅速在体内代谢为脂溶性的隐色孔雀石绿(LMG)。LMG具有潜在的致癌、致畸、致突变等危害。由于LMG在水产品体内半衰期长，因此可通过食物链进入人体。 

结晶紫是与孔雀石绿结构性质相似的染料类杀菌剂，在水产品体内也会迅速代谢为脂溶性的隐色结晶紫，通过食物链进入人体后具有与LMG类似的毒副作用。 

鉴于此，许多国家都禁止将孔雀石绿和结晶紫用于水产养殖。但是，由于这两种药物对于甲鱼、黄鳝、崛鱼、鳗鱼等水生动物的水霉病、烂腮病、烂鳍病、寄生虫病及河蟹类等的纤毛虫病、寄生虫病等有较强疗效，它们常在养殖行业被滥用，并引发药物残留，对消费者健康造成损害。 

针对孔雀石绿、结晶紫类染料造成的水产品质量安全问题，建立复杂基质中痕量孔雀石绿和结晶紫的快速分离和准确定量方法，是当今研究和监管机构面临的挑战。 

目前，在痕量分析物的食品安全检测分析中，有将近一半的误差来源于样品的前处理，而真正来源于仪器检测的误差还不足三分之一，且近70%的工作量都耗费在样本的前处理阶段。因此，发展简便、高效的样品前处理方法，对痕量分析物进行快速有效的富集后再检测，是减少痕量分析物检测误差的有效手段。 

水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的传统提取方法多采用液液萃取或固相萃取，总体存在提取时间长，溶剂用量大。在痕量药物残留时，有提取回收率偏低，过程繁杂，重现性差等缺陷。 

磁固相萃取（Magnetic Solid Phase Extraction，MSPE）是一种以表面功能化的磁球（Magnetic Beads，MBs）为吸附剂的新型固相萃取方法。原理见图1，该磁球以超顺磁性纳米四氧化三铁为核，经非磁性聚合物材料包裹而成。通过在磁球表面修饰不同的化学功能团对目标物进行吸附。该方法结合了磁分离的简便性与分散固相萃取吸附的高效性，采用分 散固相萃取模式，克服了传统固相萃取中过柱操作的缺点（如过柱耗时长、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及装柱时吸附剂填装不均匀密实产生的短路等问题）。 

Min-Hung Liao报道了一种用单个超顺磁性纳米四氧化三铁为内芯，外表面包裹聚丙烯酸制成的纳米磁颗粒来富集分析水体中MG的方法。（Min-Hung Liao,Dong-Hwang Chen,Adsorption of Malachite Green by a Magnetic Nano-adsorbent.Fresenius Environmental Bulletin,2005,14(7):565-570）。该方法利用纳米磁粒子表面羧基带负电荷及水样中MG带正电荷的特性，通过离子交换吸附原理富集水体中MG，但无法实现LMG的吸附，同时由于磁粒子的直径小，需高磁场梯度回收磁粒子，因此对磁粒子回收设备要求较高。 

张建文，熊勇华，陈雪岚等报道了一种用表面磺酸化的磁球富集分析水样中的MG的新方法，该方法通过在磁球表面修饰磺酸基增加了磁球表面的Zeta电位,既有利于磁球在水相中的分散,同时增强了磁球对溶液中阳离子物质(孔雀石绿)的吸附,且使富集过程不易受溶液pH值以及其它离子的干扰。（张建文,熊勇华,陈雪岚等,磺酸化磁球富集鱼塘水中的孔雀石绿,分析化学，2011,39（5）：753-756）。但该方法仍不适于对水产品体内脂溶性的LMG进行富集分析。 

发明内容

本发明提供了一种比现有方法更为简便、灵敏度更高的水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的高效富集方法。 

具体来说本发明的技术方案包含下列步骤： 

（1）样品处理：取水产品肌肉组织，加入3～10倍体积的提取缓冲液，匀浆，离心；取上清液加入超纯水或NaCl溶液稀释至乙腈浓度不超过10%，同时加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液至溶液中，使溶液中离子强度为1～10mol/L，调节溶液pH值为9～11；所述提取缓冲液为乙腈与pH3.0McIlvaine缓冲液体积比为6：4的混合液； 

（2）吸附：加入适量C₁₈磁球，混匀，充分吸附，磁场分离磁球，弃去上清； 

所述C₁₈磁球是粒径为70～300nm，球体内含多个四氧化三铁纳米颗粒。四氧化三铁纳米颗粒被由苯乙烯，丙烯酸等含双键的有机化合物单体聚合而成的有机聚合物或二氧化硅包裹呈球形，磁性微球的外表面上修饰有完全疏水性的C18烷烃链基团，磁球含铁量为40～70%的磁性微球； 

（3）洗脱、收集：加适量洗脱液将磁球上的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫洗脱，磁场分离磁球，收集洗脱液。 

样品可以是各种加工形式的水产品如冷冻、新鲜、腌制、熏制等常规方法加工后能 顺利取肉的鱼、虾、蟹等水产品。 

步骤（1）中加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液使溶液的离子强度为1～10mol/L，采用的无机盐或无机盐溶液可以是氯化钠、氯化钾等无机盐或其溶液。 

为了达到更好的技术效果，步骤（1）中上清液加入超纯水或NaCl溶液稀释至乙腈浓度为5%～10%，加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液使溶液中离子强度为1.5mol/L。 

洗脱过程可以采取常规的洗脱方法，如氨化甲醇、乙腈等，经过本发明人大量的试验，发现洗脱液为纯乙腈具有优异的洗脱效果，可以有效地洗脱结合在C₁₈磁球表面的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，洗脱效率不低于95%。同时，收集洗脱液，过滤后可直接进样进行液相色谱或液相色谱-质谱联用定量分析。省时省力，非常方便。为了达到洗脱目的，又不浪费溶剂，洗脱剂的用量为50～500μL/mg磁球重量。 

本发明还涉及上述富集方法在隐色孔雀石绿和隐色结晶紫分析检测中的应用，用乙腈将隐色孔雀石绿和隐色结晶紫从磁球上洗脱下来后，收集洗脱液，过滤，直接进样进行常规液相色谱或液相色谱-质谱联用定量分析。过滤可以直接采取常规液相或液质联用进样所需的0.45μm或0.22μm滤膜过滤，液相色谱或液相色谱-质谱联用的条件可以直接采取隐色孔雀石绿和隐色结晶紫分析条件，此为常规实验技术，不再赘言。 

前面所述的C₁₈微球（粒径为70～300nm，内芯含多个四氧化三铁纳米颗粒，内芯外包覆有机层，在有机层外表修饰有完全疏水性的C₁₈油酸基团的磁球）可以通过下列技术方案来制备： 

方案一：以羧基化聚苯乙烯磁性微球为原料： 

1）羧基化磁球的氨基化：将相应粒径的表面羧基修饰的商品化聚苯乙烯磁球分散于硼酸盐缓冲液（pH4.0-5.0）中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺以活泼酯法活化磁球上的羧基；取乙二胺，加入剂量为羧基摩尔数的300～800倍，用浓盐酸调节pH到8～9后加入活化后的磁球，常温振荡反应10～12h，得表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球； 

2）油酸上羧基的活化：按体积比1:5～1:50将油酸加入无水四氢呋喃中，用N,N-二环己基碳二亚胺和:N-羟基琥珀酰亚胺以活泼酯法活化油酸上的羧基，向活化产物中加入三乙胺调节溶液pH值至8～9； 

3）用油酸功能化聚苯乙烯磁球：将相应粒径的表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球用无水四氢呋喃洗涤后，按6～12g/mL的比例加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡充分反应；分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中， 保存备用。 

方案二：以外壳为二氧化硅的磁球（粒径范围在70-300nm之间）为原料： 

1）化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒，再将Fe₃O₄纳米单颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；2.0mL环己烷悬浮3g Fe₃O₄纳米颗粒获得磁流体，将磁流体转入400mL，0.01M含0.2～0.5%的SDS的NaHCO₃溶液中，200-300W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；于70℃下回流12h除去环己烷得到Fe₃O₄纳米粒子簇；磁分离Fe₃O₄纳米粒子簇，用浓度0.9g/L Tween-80溶液悬浮Fe₃O₄纳米粒子簇并静置；将上述悬浮液加入200mL反应液中（其中乙醇50份，氢氧化铵溶液(25%)1.5份，H₂O1.0份，正硅酯乙酯0.3份）反应15～30min，即可得到内含超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，外壳为二氧化硅的磁球，磁球粒径大小与溶液中SDS含量以及超声功率成反比。 

2）二氧化硅磁球表面的氨基化：取粒径为70～300nm二氧化硅磁球按25～100g/L比例分散于体积比为2:3～3:2的二甲基甲酰胺/甲苯溶剂中，按1mg二氧化硅磁珠加1～2μL的量逐滴加入乙氧基硅烷；氩气保护下室温振荡充分反应，分离磁球，无水乙醇洗涤磁球数次获得氨基表面修饰的二氧化硅磁球； 

3）油酸上羧基的活化：按体积比1:5～1:50将油酸加入无水四氢呋喃中，用N,N-二环己基碳二亚胺和:N-羟基琥珀酰亚胺以活泼酯法活化油酸上的羧基，向活化产物中加入三乙胺调节溶液pH值至8～9； 

4）用油酸功能化二氧化硅磁球：将表面氨基修饰的二氧化硅磁球按照6～12g/mL加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡充分反应；分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，保存备用。 

利用上述方案制备的C₁₈微球具有稳定性好、重现性好的优点。 

在磁球分离时可以常规的磁球分离方法如采用磁力架等磁场分离，也可以采用离心等方法分离等。 

本发明技术方案具有如下优点： 

1、能有效的富集水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，且吸附效率高，样品提取回收率高。 

2、本方案为磁球吸附，富集速度快。本磁球的溶液单分散性好，在溶液中可均匀分布，比表面积大，提高了萃取过程中吸附剂吸附待分离物的速率，缩短了吸附时间； 

3、吸附容量大，所用的有机溶剂少，节约材料，减少了环境污染。 

4、磁球粒径小，比表面积远大于固相萃取材料，吸附容量大，吸附剂用量少，可实现微量洗脱液洗脱，富集倍数高，且可省去常规前处理流程中的旋转蒸发等浓缩步骤，对分析物破坏少，减少了检测误差。 

附图说明

图1磁固相萃取原理图。 

图2本发明磁球结构图。 

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

实施例中McIlvaine缓冲液（pH3.0）的配制过程为将18.9mL0.2M磷酸一氢钠溶液与81.1mL0.1M柠檬酸溶液混合即可得到。 

实施例1粒径100nm的C₁₈聚苯乙烯微球的制备 

以表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球为原料： 

1）羧基化磁球的氨基化：将直径分别为100nm，表面羧基修饰的商品化聚苯乙烯磁球（上海奥润微纳新材料科技有限公司产品，产品编号为PM3-008）分散于硼酸盐缓冲液（pH4.0）中，按照磁球上羧基:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺:N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比=1：3：6分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，振荡反应2h以活化磁球上的羧基。取乙二胺，加入剂量为羧基摩尔数的300～800倍，用浓盐酸调节pH到8后加入活化后的磁球，常温振荡反应12h，得表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球； 

2）油酸上羧基的活化：取700μL油酸加入5mL无水四氢呋喃中，按照油酸:N,N-二环己基碳二亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比=1：3：6分别加入N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，剧烈振荡反应2h，离心取上清后，加入三乙胺调节溶液pH值至8； 

3）用油酸功能化聚苯乙烯磁球：将500mg粒径为100nm、经步骤（1）表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球预先采用无水四氢呋喃洗涤两次后，按6g/mL的比例加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡反应2h；磁力架分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，4℃保存备用。 

实施例2粒径180nm的C₁₈聚苯乙烯磁球的制备 

步骤（1）中以直径为180nm的表面羧基修饰的商品化聚苯乙烯磁球（上海奥润微纳新材料 科技有限公司产品，产品编号为PM3-020）为原料； 

步骤（2）中取700μL油酸加入3.5mL无水四氢呋喃中，按照油酸:N,N-二环己基碳二亚胺:N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比=1：3：6分别加入N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，剧烈振荡反应2h，离心取上清后，加入三乙胺调节溶液pH值至9； 

步骤（3）中将500mg粒径为180nm、经步骤（1）表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球预先采用无水四氢呋喃洗涤两次后，按12g/mL的比例加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡反应2h；离心分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，4℃保存备用。 

其余同实施例1。 

实施例3粒径70nm的C₁₈二氧化硅磁球的制备 

以外壳为二氧化硅的磁球为载体： 

1）粒径70nm的二氧化硅磁球的合成。参照文献（Yan F,Li J,Zhang J,Liu F,Yang W.J.Nanopart.Res.,2009,11(2):289～296）方法采用化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒。再将Fe₃O₄纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干。2.0mL环己烷悬浮3gFe₃O₄纳米颗粒获得磁流体，将磁流体转入400mL，0.01M含0.5%的SDS的NaHCO₃溶液中，300W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；于70℃下回流12h除去环己烷得到Fe₃O₄纳米粒子簇；磁分离Fe₃O₄纳米粒子簇，用浓度0.9g/L Tween-80溶液悬浮Fe₃O₄纳米粒子簇并静置；将上述悬浮液加入200mL反应液中（其中乙醇50份，氢氧化铵溶液(25%)1.5份，H₂O1.0份，正硅酯乙酯0.3份）反应15min，即可得到粒径约为70nm外壳为二氧化硅的磁球。 

2）二氧化硅磁球表面的氨基化：500mg粒径为70nm二氧化硅磁球分散于10mL体积比为6：4的二甲基甲酰胺/甲苯溶剂中，逐滴加入500μL乙氧基硅烷；氩气保护下室温振荡反应24小时后，磁力架分离磁球，无水乙醇洗涤磁球数次获得氨基表面修饰的二氧化硅磁球； 

3）油酸上羧基的活化：取700μL油酸加入5mL无水四氢呋喃中，按照油酸:N,N-二环己基碳二亚胺:N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比=1：3：6分别加入N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，剧烈振荡反应2h，离心取上清后，加入三乙胺调节溶液pH值至8； 

4）用油酸功能化二氧化硅磁球：将500mg表面氨基修饰的二氧化硅磁球按照6g/mL加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡反应2h；磁力架分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤 除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，4℃保存备用； 

实施例4粒径200nm的C₁₈二氧化硅磁球的制备 

按实施例3中步骤1）方案合成获得磁流体，将5mL磁流体转入400mL，0.01M含0.3%的SDS的NaHCO₃溶液中，200W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；于70℃下回流12h除去环己烷得到Fe₃O₄纳米粒子簇；磁分离Fe₃O₄纳米粒子簇，用浓度0.9g/LTween-80溶液悬浮Fe₃O₄纳米粒子簇并静置；将上述悬浮液加入200mL反应液中（其中乙醇50份，氢氧化铵溶液(25%)1.5份，H₂O1.0份，正硅酯乙酯0.3份）反应15min，即可得粒径为200nm，外壳为二氧化硅的磁球。 

其余步骤同实施例3。 

实施例5粒径300nm的C₁₈二氧化硅磁球的制备 

按实施例3中步骤1）方案合成获得磁流体，将5mL磁流体转入400mL，0.01M含0.2%的SDS的NaHCO₃溶液中，200W（25KHz）功率继续超声乳化30min，形成细乳液；于70℃下回流12h除去环己烷得到Fe₃O₄纳米粒子簇；磁分离Fe₃O₄纳米粒子簇，用浓度0.9g/LTween-80溶液悬浮Fe₃O₄纳米粒子簇并静置；将上述悬浮液加入200mL反应液中（其中乙醇50份，氢氧化铵溶液(25%)1.5份，H₂O1.0份，正硅酯乙酯0.3份）反应30min，即可得粒径为300nm，外壳为二氧化硅的磁球。 

其余步骤同实施例3。 

实施例6以粒径为100nm C₁₈聚苯乙烯磁球为吸附剂富集、净化水产品中隐色孔雀石绿 

1）添加隐色孔雀石绿的鱼肉样品的制备：取七份各1g去皮、骨的用中华人民共和国国家标准GB/T19857-2005验证不含隐色孔雀石绿的新鲜草鱼鱼肉样本，高速均质后，分别添加0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、1和2ng隐色孔雀石绿，避光静置30min。按同样方法再制备相同的七份添加隐色孔雀石绿的鱼肉样品。两组加标样品分别用本专利提供的方法及中华人民共和国国家标准GB/T19857—2005提取其中的隐色孔雀石绿，并比较两种提取方法回收率的差异。 

2）以粒径为100nm C₁₈聚苯乙烯磁球为吸附剂提取加标草鱼中的隐色孔雀石绿：向1g加标鱼肉样本中加入3mL样品提取缓冲液（乙腈/McIlvaine缓冲液（pH3.0）=6：4），高速均质，10000g离心取上清。向上清液中加入12mL浓度为2.25M的氯化钠水溶液，并NaOH溶液调整溶液pH至10。将5mg粒径为100nm的实施例（1）中的C₁₈聚苯乙烯磁球加 入上述提取液中，摇匀后静置5分钟，磁力架分离磁球，弃去提取液，300μL乙腈浸泡磁球1分钟后，磁力架分离磁球，收集乙腈溶液用于液相色谱-质谱联用法定量分析。本方法整个提取、富集净化过程耗时约40min。 

2）以中华人民共和国国家标准GB/T19857—2005）中的方法提取富集加标草鱼中的隐色孔雀石绿：参照文献（中华人民共和国国家标准GB/T19857—2005）方法，提取加标草鱼中的隐色孔雀石绿。本方法整个提取、富集净化过程耗时约3h。国标提取富集方法耗时约为本专利提供方法的4.5倍。 

4）参照文献（中华人民共和国国家标准GB/T19857—2005）方法，用液相色谱-质谱联用方法分析（2）、（3）中两种提取方法所得富集液中隐色孔雀石绿的含量，具体方法如下： 

液相色谱-串联质谱条件： 

色谱柱：C₁₈柱，50mm×2.1mm（i.d.），粒度3μm；流动相：乙腈+5mmol/L乙酸铵=75+25(v/v)；流速：0.2mL/min；d)柱温：35℃；e)进样量：10μL；f)离子源：电喷雾ESI，正离子；g)扫描方式：多反应监测MRM；h)雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；i)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；j)监测离子对：m/z331/316（定量离子）、氘代隐色孔雀石绿m/z337/322（定量离子）。 

液相色谱-串联质谱测定： 

按照上述液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液，以色谱峰面积按内标法定量，隐色孔雀石绿以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算。加标量为0.1ng隐色孔雀石绿的富集净化液的质谱图。 

5）回收率的计算：将由液相色谱-串联质谱法测定得到的富集净化液中隐色孔雀石绿的含量，除以加标量得到加标样品中隐色孔雀石绿的回收率。 

6）两种提取方法加标回收率的比较：两种提取富集方法的回收率见表1。由表可知，当鱼肉中隐色孔雀石绿添加量为0.1-0.2ng/g时，本专利提供方法的回收率大于70%，而国标方法的回收率很低，无法用LC-MS方法检出；当鱼肉中隐色孔雀石绿添加量为0.3-2ng/g时，本专利提供方法的回收率明显高于国标方法的回收率。 

本实施例的结果表明，本专利提供的方法与国标方法相比，耗时少，且当鱼肉中LMG含量为亚纳克/克鱼肉时，回收率更高。 

表1 

LMG:隐色孔雀石绿；ND:未检出；RSD:相对标准偏差。 

实施例7以粒径为100nm C₁₈二氧化硅磁球为吸附剂富集、净化水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫 

取1g去皮、骨的冷冻鲤鱼鱼肉样本（不含LMG和隐色结晶紫），加入3mL样品提取缓冲液（乙腈/McIlvaine缓冲液（pH3.0）=6：4），高速均质，10000g离心取上清。向上清液中加入12mL浓度为2.25M的氯化钠水溶液，并NaOH溶液调整溶液pH至10。将5mg粒径为100nm的实施例4中的C₁₈二氧化硅磁球加入上述提取液中，摇匀后静置5分钟，磁力架分离磁球，弃去提取液，300μL乙腈浸泡磁球1分钟后，磁力架分离磁球，收集乙腈溶液进行LC-MS分析；按如上流程提取肉组织中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，加标回收率（0.5ng-5ng/g）测定，样品提取回收率为85-97%。 

实施例8以粒径为300nm C₁₈聚苯乙烯磁球为吸附剂富集试验 

取1g新鲜草鱼肉样本（不含LMG和隐色结晶紫），加入3mL样品提取缓冲液（乙腈/McIlvaine缓冲液（pH3.0）=6：4），高速均质，10000g离心取上清。加入12mL氯化钠浓度为2M的蒸馏水溶液，并用NaOH溶液调整溶液pH至9。将10mg粒径为300nm的实施例2中的C₁₈聚苯乙烯磁球加入上述提取液中，摇匀后静置5分钟，磁力架分离磁球，弃去提取液，500μL乙腈浸泡磁球1min后，磁力架分离磁球，收集乙腈溶液进行LC-MS分析；按如上流程提取肉组织中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，加标回收率（0.5ng-5ng/g）测定，样品提取回收率均高于85%； 

实施例9不同状态水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫富集试验 

以粒径为100nm C₁₈表面修饰的二氧化硅磁球为吸附剂富集、净化水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的流程： 

样本a为1g干虾肉、样本b为1g腌制鲤鱼肉、样本c为1g熏制鲢鱼肉、样本d为1g新鲜扁鱼肉、e为1g冷冻鳝鱼肉，均不含LMG和隐色结晶紫。 

在各样本中分别加入3mL样品提取缓冲液（乙腈/McIlvaine缓冲液（PH3.0）=6：4），高速均质，10000g离心取上清。加入12mL氯化钠浓度为2.5M的蒸馏水溶液，并用NaOH溶液调整溶液pH至10。将3mg粒径为100nm的实施例（5）中的C₁₈二氧化硅磁球加入上述提取液中，摇匀后静置5分钟，磁力架分离磁球，弃去提取液，200μL乙腈浸泡磁球1分钟后，磁力架分离磁球，收集乙腈溶液进行LC-MS分析；按如上流程提取鱼肉组织中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，加标回收率（0.2ng-5ng/g）测定，样品提取回收率均高于85%。 

实施例10 

取1g去皮、骨的冷冻鲤鱼鱼肉样本（不含LMG和隐色结晶紫），加入3mL样品提取缓冲液（乙腈/McIlvaine缓冲液（PH3.0）=6：4），高速均质，10000g离心取上清。向上清液中加入浓度为2.25M的氯化钠水溶液调至乙腈浓度为5%，并NaOH溶液调整溶液pH至11。将5mg粒径为500nm的实施例6中的C₁₈二氧化硅磁球加入上述提取液中，摇匀后静置5分钟，磁力架分离磁球，弃去提取液，300μL乙腈浸泡磁球1分钟后，磁力架分离磁球，收集乙腈溶液进行液相色谱-质谱联用分析；按如上流程提取鱼肉组织中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，加标回收率（0.5ng-5ng/g）测定，样品提取回收率为85-100%。 

实施例11 

取1g去皮、骨的冷冻鲤鱼鱼肉样本（不含LMG和隐色结晶紫），加入3mL样品提取缓冲液（乙腈/McIlvaine缓冲液（PH3.0）=6：4），高速均质，10000g离心取上清。向上清液中加入浓度为2.25M的氯化钠水溶液调至乙腈浓度为10%，并NaOH溶液调整溶液pH至10。将5mg粒径为300nm实施例（4）C₁₈二氧化硅磁球加入上述提取液中，摇匀后静置5分钟，磁力架分离磁球，弃去提取液。300μL乙腈浸泡磁球1分钟后，磁力架分离磁球，洗脱效率为99.9%。收集乙腈溶液进行液相色谱-质谱联用分析；按如上流程提取鱼肉组织中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，加标回收率（0.5ng-5ng/g）测定，样品提取回收率高于85-100%。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.一种富集水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）样品处理：取水产品肌肉组织，加入3~10倍体积的提取缓冲液，匀浆，离心；取上清液加入超纯水或NaCl溶液稀释至乙腈浓度不超过10%，同时加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液至溶液中使溶液中离子强度为1~10 mol/L ，调节溶液pH值为9~11；所述提取缓冲液为乙腈与pH 3.0 McIlvaine 缓冲液体积比6：4的混合液；

（2）吸附：加入适量C₁₈磁球，混匀，充分吸附，磁场分离磁球，弃去上清；所述C₁₈磁球是粒径为70~300 nm，球体内含多个四氧化三铁纳米颗粒，四氧化三铁纳米颗粒被由苯乙烯，丙烯酸等含双键的有机化合物单体聚合而成的有机聚合物或二氧化硅包裹呈球形，磁性微球的外表面上修饰有完全疏水性的C₁₈烷烃链基团，磁球含铁量为40~70%的磁性微球；

（3）洗脱、收集：加适量洗脱液将磁球上的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫洗脱，磁力架分离磁球，收集洗脱液。

2.根据权利要求1所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于：步骤（1）中提取获得的上清液加入超纯水或NaCl溶液稀释至乙腈浓度为2%~10%，加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液至溶液中使溶液中离子强度为1~10 mol/L。

3.根据权利要求1所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于步骤（3）洗脱液为纯乙腈。

4.权利要求3所述的富集方法在隐色孔雀石绿和隐色结晶紫分析检测中的应用，其特征在于：收集洗脱液，过滤，直接进样进行液相色谱或液相色谱-质谱联用定量分析。

5.根据权利要求1~3任一所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于所述C₁₈微球按照如下步骤制备：

以羧基化聚苯乙烯磁性微球为原料：

1）羧基化磁球的氨基化：将相应粒径的表面羧基修饰的商品化聚苯乙烯磁球分散于pH4-5硼酸盐缓冲液中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺以活泼酯法活化磁球上的羧基；取乙二胺，加入剂量为羧基摩尔数的300~800倍，用浓盐酸调节pH到8~9后加入活化后的磁球，常温振荡反应10~12h，得表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球；

2）油酸上羧基的活化：按体积比1:5~1:50将油酸加入无水四氢呋喃中，用N,N-二环己基碳二亚胺和:N-羟基琥珀酰亚胺以活泼酯法活化油酸上的羧基，向活化产物中加入三乙胺调节溶液pH值至8~9；

3）用油酸功能化聚苯乙烯磁球：将粒径为70~300 nm、表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球用无水四氢呋喃洗涤后，按6~12 g/mL的比例加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡充分反应；分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，保存备用。

6.根据权利要求1~3任一所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于所述C₁₈微球按照如下步骤制备：

以外壳为二氧化硅粒径范围在70-300 nm之间的磁球为原料：

化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒，再将Fe₃O₄纳米单颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；2.0 mL环己烷悬浮3g Fe₃O₄纳米颗粒获得磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.2~0.5%的SDS的NaHCO₃溶液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下继续超声乳化30min，形成细乳液；于70℃下回流12h除去环己烷得到Fe₃O₄纳米粒子簇；磁分离Fe₃O₄纳米粒子簇，用浓度 0.9 g/L Tween-80 溶液悬浮Fe₃O₄纳米粒子簇并静置；将上述悬浮液加入200 mL由乙醇50份、25%氢氧化铵溶液 1.5份、H₂O 1.0份 、正硅酯乙酯0.3份配比而成的反应液中反应15~30 min，即可得到内含超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，外壳为二氧化硅的磁球； 

 2）二氧化硅磁球表面的氨基化： 取粒径为70~300 nm二氧化硅磁球按25~100 g/L比例分散于体积比为2:3~3:2的二甲基甲酰胺/甲苯溶剂中，按1 mg二氧化硅磁珠加1~2 μL的量逐滴加入乙氧基硅烷；氩气保护下室温振荡充分反应，分离磁球，无水乙醇洗涤磁球数次获得氨基表面修饰的二氧化硅磁球；

3）油酸上羧基的活化：按体积比1:5~1:50将油酸加入无水四氢呋喃中，用N,N-二环己基碳二亚胺和:N-羟基琥珀酰亚胺以活泼酯法活化油酸上的羧基，向活化产物中加入三乙胺调节溶液pH值至8~9；

4）用油酸功能化二氧化硅磁球：将表面氨基修饰的二氧化硅磁球按照6~12 g/mL加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡充分反应；分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，保存备用。

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