CN103344711B - 磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子含量的检测方法，采用离子色谱法（Ion Chromatography，简称IC），电导检测器，本方法灵敏度高、可靠性强，适用于磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子的测定和含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子含量的检测方法。
背景技术
磷酸肌酸二钠盐是一种心肌保护剂(结构式如下)，临床用于缺血状态下的心肌代谢异常，如心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治疗。由于存在高能磷酸键，磷酸肌酸二钠盐在水中和质子存在下，极易分解为磷酸盐和肌酸；同时，该药物极性大，只溶解与水，不溶于甲醇和乙醇等常用溶剂，制备过程中不容易除去水溶性磷酸盐、氯化物等。
目前磷酸肌酸二钠盐及制剂的有关检测方法均主要采用高效液相色谱仪和紫外检测器测定，如郭兴辉等报道的RP-HPLC法测定注射用磷酸肌酸钠有关物质的含量【中国药房，2013，24(9)，840-842】；张晓平等报道的“高效液相色谱法测定磷酸肌酸二钠盐含量及应用”【天津药学，2003，15(1)，18】；于忠辉等报道的“反相离子色谱对高效液相色谱法测定磷酸肌酸二钠盐的含量”【中国药学与临床，2005，5(11)，865】。使用离子对试剂，检测波长均在210nm，受溶剂影响较大，基线噪音强，测定时系统平衡稳定时间至少需要12小时，影响测定效率，且紫外检测器无法测定到没有紫外吸收的物质，尤其是磷酸盐等无机阴离子，不能完全控制磷酸肌酸二钠盐的杂质。
中国专利CN101034086B公开了一种磷酸肌酸二钠盐中杂质的检测方法，其使用离子对色谱法，蒸发光检测器测定，测定中检测限低，均在130～320ng左右，达不到测定要求，也无法测定和控制磷酸肌酸二钠盐的无机杂质，这也正是蒸发光检测器本身检测限度低所致的，本发明使检测限提高了1000倍以上。
磷酸肌酸二钠盐的含量测定方法目前主要有酶法和高效液相色谱法两种方法。酶法如郝苏丽等报道的“磷酸肌酸钠含量测定的研究”采用特异性联合酶测定含量，使用几个特异性的酶反应，采用紫外分光光度计、外标法测定磷酸肌酸含量【药物分析杂志，2003，23(4)，341】。高效液相色谱法如上述3篇文献报道的，与测定杂质相同，溶液本身不稳定，必须现配现用，且无法连续进样，精密度和准确度低。以上两种方法均需磷酸肌酸二钠盐对照品，外标法测定。
磷酸肌酸二钠盐对照品，价格昂贵，含4个结晶水，由于对热不稳定，对照品不能烘干至恒重，使用时需要对水分进行标定；上市产品磷酸肌酸钠本身也含有水分，测定含量也需要另外测定水分，计算时扣除水分，使得最终测定结果引入了两次系统误差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种全新的磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子含量的检测方法。该方法不需要磷酸肌酸二钠盐对照品，以国家标准物质“水中磷酸根”作为对照品，此标准物质稳定、准确、可靠、易储存，价格便宜，同时，整个测定过程中不使用任何有机溶剂，减少了对测定人员和环境的污染。
本发明方法的特点在于采用离子色谱仪、电导检测器测定杂质无机阴离子的含量。离子色谱(Ion Chromatography，简称IC)，本发明采用的是抑制型离子色谱，其灵敏度高，检测下限可达到ng/ml，甚至ng/L级。
所述的磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子含量的检测方法，具体如下：
色谱柱：阴离子交换柱。
氢氧化钠淋洗液浓度：20～40mmol/L，优选30mmol/L。
流速：0.5～1.5ml/min。
柱温：15℃～35℃，优选30℃。
抑制电流：80～100mA，优选90mA。
进样量：25μl。
供试品溶液A(临配现用)：精密称取磷酸肌酸二钠盐，置量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得，作为测定样品中的杂质无机阴离子。
供试品溶液B：精密称取磷酸肌酸二钠盐，置量瓶中，加入酸1ml，使磷酸肌酸二钠盐完全降解为磷酸盐和肌酸。所述酸为盐酸、硫酸和硝酸之一，优选盐酸，酸的浓度0.01mol/L～0.1mol/L，优选0.1mol/L。其中降解温度40℃～90℃，优选80℃，加热5min～30min，优选15min。放冷至室温后，用水定容，精密吸取2ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
对照溶液：精密量取“标准物质GBW(E)081215，0.1g/L水中磷酸根，”对照溶液，加水稀释至1～40μg/ml，优选20μg/ml。
分别取供试品溶液和对照品溶液各25μl进样，记录色谱仪，按外标法，以磷酸根峰面积计算总磷酸根含量，减去游离磷酸根含量，乘以系数2.6858换算成磷酸肌酸二钠盐含量即可。
系统适用性的要求：取醋酸钠、硫酸钾、氯化钠、水中磷酸根、硝酸钾、磷酸肌酸二钠盐适量，加水稀释成一定浓度，按上述色谱条件进行测定。磷酸根与其他阴离子峰及磷酸肌酸二钠盐峰分离度符合《中国药典》2010年版二部附录关于高效液相色谱法系统适用性的规定。
有益效果：
1、本发明采用离子色谱法(IC)测定磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子的含量，灵敏度高、可靠性强，适用于磷酸肌酸二钠盐的含量测定和杂质阴离子的测定。
2、本发明方法操作简捷、准确、快速。
附图说明
图1为各阴离子与磷酸肌酸二钠盐的色谱图，其中1为醋酸根Ac-，2为磷酸肌酸，3为氯离子Cl-，4为硫酸根SO4 2-，5为硝酸根NO3 -，6为磷酸根PO4 3-。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1磷酸肌酸二钠盐的杂质无机阴离子的测定
1仪器与试药
1.1仪器和材料
美国戴安ICS2100离子色谱仪，Mettler Toledo电子天平，Hitech-Kflow超纯水机。
1.2药品和试剂
醋酸钠、氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、超纯水。
对照品：“水中磷酸根，标准物质GBW(E)081215”，规格为0.1g/L，批号：120206，上海市计量测试技术研究院。
供试品：哈尔滨莱博通药业有限公司生产的磷酸肌酸二钠盐样品。
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：阴离子交换柱IonPacTM ASII-HC(4mm×250mm)；预柱：IonPacTM ASII-HC(4mm×50mm)。氢氧化钠淋洗液浓度：30mmol/L；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；抑制电流：90mA；进样量：25μL。
2.2系统适用性试验
取醋酸钠、硫酸钾、氯化钠、水中磷酸根、硝酸钾、磷酸肌酸二钠盐适量，加水稀释成含醋酸根0.07μg/ml、氯离子0.04μg/ml、硫酸根0.06μg/ml、硝酸根0.07μg/ml、磷酸肌酸20.52μg/ml和磷酸根0.2μg/ml的溶液，按上述色谱条件进行测定。结果表明主峰磷酸根与其他各阴离子、磷酸肌酸二钠盐达到较好的基线分离，杂质峰对磷酸根含量测定结果无干扰(参看图1)，各阴离子的出峰顺序和时间分别为醋酸根：3.8min；磷酸肌酸二钠盐：4.2min；氯离子：5.1min；硫酸根：6.8min；硝酸根：8.3min；磷酸根：13.0min。
2.3供试品溶液A(现配现用)
精密称取磷酸肌酸二钠盐约100mg，置50ml的量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4最小检测量
将混合的阴离子溶液不断稀释，使在信噪比(N≥3)测定，计算各阴离子最小检测限，结果参看表1，可以看出，本发明的测试结果高于专利CN101034086B方法近10000倍。
表1最小检测限的比较
实施例2磷酸肌酸二钠盐含量的测定
采用同一色谱条件，除测定磷酸肌酸二钠盐的无机阴离子外，同时还可以测定磷酸肌酸二钠盐的含量，即先将磷酸肌酸二钠盐进行酸解，然后测定总磷酸根含量，减去游离磷酸根含量，乘以系数2.6858换算成磷酸肌酸二钠盐的含量。色谱条件和仪器试药同实施例1。
1溶液的制备
1.1对照品储备液即“水中磷酸根”(规格为0.1g/L)。
1.2对照品溶液精密量取对照品储备液2ml，置10ml的量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(20μg/ml)。
1.3供试品溶液A(现配现用)：精密称取磷酸肌酸二钠盐约100mg，置50ml的量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
1.4供试品溶液B(酸降解)：精密称取磷酸肌酸二钠盐约25mg，置50ml的量瓶中，加0.1M盐酸1ml，加水适量，置80℃水温中15min，放冷至室温，吸2ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2磷酸根的线性试验
精密吸取对照品储备液适量，加水稀释制成2.5、5.0、10、20、30、40μg/ml溶液，注入色谱仪，记录色谱图。以磷酸根峰面积为纵坐标(Y)，磷酸根浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得磷酸根的回归方程为：Y＝0.125X-0.087，r＝0.99992。结果表明：磷酸根在0.125～2.000mg范围内有良好的线性响应关系。
3最小检测量
将对照品储备液浓度为2.5μg/ml样品不断稀释，使在信噪比(N≥3)测定，磷酸根最低检出限为0.3125ng。
4供试品溶液B(酸降解)
磷酸肌酸二钠盐存在高能磷酸键，在有水和质子存在下，极易分解为磷酸盐和肌酸，经过筛选最终选择磷酸肌酸二钠盐加0.1mol/L盐酸1ml，在80℃水温中反应15min即可完全降解成游离磷酸根。因此，供试品溶液B(酸降解)的制备方法为：精密称取磷酸肌酸二钠盐25mg，置50ml的量瓶中。加0.1M盐酸1ml，加水适量，置80℃水温中15min，放冷至室温。吸2ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
5精密度
精密吸取对照品溶液，连续进六针，计算磷酸根峰面积RSD值，结果参看表2。
表2对照品溶液精密度结果
6重复性
取磷酸肌酸二钠盐原料药，按照“1.4”方法平行制备6份，测定原料药中磷酸根降解率，结果参看表3，RSD值为0.82％。
表3磷酸肌酸二钠盐磷酸根降解率结果(n＝6)
7准确度
取约12.5mg/ml磷酸肌酸二钠盐水溶液1ml各6份，置50ml量瓶中。分别加入15mg/ml磷酸三钠水溶液1ml(约含磷酸根3.83mg)，加0.1mol/L盐酸溶液1ml，80℃水浴加热15min。放冷至室温，用水稀释定容，吸取2ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得，做为加样样品溶液。按上述色谱条件进行测定，计算回收率和RSD，结果参看表4。
表4磷酸肌酸二钠盐原料药酸降解磷酸根回收率结果(n＝6)
8溶液稳定性
取一份酸降解的供试品溶液B，在0、0.5、2、3、6、24小时时进样，记录磷酸根峰面积，结果参看表5，测得磷酸根峰面积RSD为0.70％，表明该溶液中磷酸根在24小时内稳定。
表5酸降解供试品中磷酸根稳定性考察
9结果
对照品磷酸根与可能的几个杂质无机阴离子及磷酸肌酸二钠盐测定峰基本分离，不干扰测定结果，线性试验、精密度试验以及准确度试验等结果表明此测定方法，准确、可靠、安全。
实施例3目前执行的国家局批准含量测定方法中精密度试验与本发明精密度试验结果比较
现行的国家药品监督管理局批准标准(YBH0852005)中含量测定方法如下：
色谱条件及系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾2g与四丁基磷酸铵0.8g，加水溶解并稀释至1000ml，用冰醋酸调节pH值至3.5为流动相；检测波长为210nm。理论板数按磷酸肌酸二钠盐峰计算应不低于1000。
测定方法：取本品约40mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取磷酸肌酸二钠盐对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
国家批准标准的含量测定方法使用高效液相色谱法和紫外检测器，流动相中添加了离子对试剂四丁基磷酸铵，使用磷酸肌酸二钠盐对照品，配制1份溶液连续进样6针和本发明所用磷酸根对照品，配制1份溶液连续进样6针，记录峰面积，分别计算相对标准偏差，结果参看如下表6，可以看出，本发明中峰面积的相对标准偏差低于现行标准10倍以上。
表6两种方法精密度试验峰面积RSD％的比较
| 编号 | 现行国家标准(YBH0852005) | 本发明 |
| 1 | 2686383 | 0.3468 |
| 2 | 2616216 | 0.3463 |
| 3 | 2609761 | 0.3463 |
| 4 | 2599017 | 0.3473 |
| 5 | 2546052 | 0.3466 |
| 6 | 2512133 | 0.348 |
| RSD％ | 2.33 | 0.19 |
Claims (4)
1.一种磷酸肌酸二钠盐及其杂质阴离子含量的检测方法，其特征在于，先将磷酸肌酸二钠盐用酸完全降解为磷酸盐和肌酸，再配制成供试品溶液以测定样品含量，检测条件如下：
色谱柱：阴离子交换柱；
氢氧化钠淋洗液浓度：30mmol/L；
流速：0.5～1.5ml/min；
柱温：30℃；
抑制电流：90mA；
进样量：25μl；
精密称取磷酸肌酸二钠盐，置量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得，用于测定杂质阴离子，临配现用；
所述的用酸完全降解及供试品溶液的配制过程为：精密称取磷酸肌酸二钠盐，置量瓶中，加入酸，使磷酸肌酸二钠盐完全降解为磷酸盐和肌酸；其中降解温度40℃～90℃，加热5min～30min，放冷至室温后，用水定容，精密吸取2ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得，用于测定样品含量；
所述杂质阴离子为醋酸根离子、氯离子、硫酸根离子、硝酸根离子和磷酸根离子。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酸为盐酸、硫酸或硝酸，浓度0.01mol/L～0.1mol/L。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，对照溶液为标准物质GBW(E)081215“水中磷酸根”，浓度1～40μg/ml。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述对照溶液浓度为20μg/ml。
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