CN103343121B

CN103343121B - 一种dna片段的回收方法

Info

Publication number: CN103343121B
Application number: CN201310313712.4A
Authority: CN
Inventors: 田生礼; 梁秀怡; 梁志成
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: ZHUHAI BAORUI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: CN103343121A

Abstract

本发明公开一种DNA片段的回收方法，是一种新的DNA和琼脂糖同步回收方法，利用弱碱性的异硫氰酸胍溶液溶解含有目DNA的琼脂糖凝胶条，再加入预冷的异丙醇，琼脂糖析出形成沉淀析出，而大部分的DNA则存在于上清液中，通过离心即可初步分离琼脂糖和DNA，再分别回收DNA和琼脂糖。该方法可从琼脂糖凝胶中高效同步回收DNA和琼脂糖，还具有廉价实用、低碳环保、快速简便、结果稳定可靠、设备要求简单等特点。

Description

一种DNA片段的回收方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DNA片段的回收方法，采用所述回收方法能从琼脂糖凝胶中同步回收琼脂糖和DNA片段。

背景技术

琼脂糖由D-半乳糖与3，6-内醚-半乳糖作为结构单元交替组成，是一种呈中性的直链多糖。其具有亲水性，并且几乎完全不含有带电基团，对敏感的生物大分子很少引起变性和吸附，在生物类应用上是理想的惰性载体。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，一定浓度的琼脂糖水溶液在温度下降到35-40℃时能形成性能良好的半固体状的凝胶，由于利用琼脂糖进行凝胶电泳操作快速，简单，电泳作用低，因此广泛应用于分离和回收DNA片段，极大地促进了重组DNA技术的发展。目前已报道多种从凝胶中回收DNA片段的方法，CsCl密度梯度离心法，蔗糖密度梯度离心法在早期使用较多，但由于价格高、耗时等原因被其他方法代替；Dretzen发明DEAE—纤维素滤膜回收法，DNA得率高，但存在操作繁琐，DNA片段洗脱困难等问题；而低熔点琼脂糖法的试剂成本较高；利用冻融法和超声波破胶法回收的DNA纯度好，但回收率较低；虽然透析袋电洗脱法回收率高，也由于回收耗时过长而未能广泛使用；另外还有试剂盒法，玻璃奶法，琼脂糖酶法，挖孔法等，其各有利弊。

现有的DNA回收方法存在许多不足之处，如DNA回收效率低、耗费时间长、操作复杂、试剂成本过高，需要自制电泳洗脱装置，还有回收产物不纯等问题，给下游实验操作带来诸多不便，而这些问题至今仍没有被比较好地解决。另外，以上各种方法均不能兼顾琼脂糖的回收和利用，浪费昂贵的琼脂糖的同时不利于低碳环保。目前，对于在琼脂糖凝胶中同步回收琼脂糖和DNA片段的研究至今未见报道。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种DNA片段的回收方法，该方法可从琼脂糖凝胶中高效同步回收DNA和琼脂糖，具有廉价实用、低碳环保、快速简便、结果稳定可靠、设备要求简单等特点，旨在解决现有的DNA回收方法不能兼顾琼脂糖的回收和利用的问题，且还解决了现有技术中存在许多不足之处，如DNA回收效率低、耗费时间长、操作复杂、试剂成本过高、回收产物不纯等问题。

本发明的技术方案如下：

一种DNA片段的回收方法，其中，包括以下步骤：

A、在含有DNA的琼脂糖凝胶条中加入溶胶液，混匀，加热至琼脂糖凝胶条融化；

B、将融化后的溶液静置冷却，加入预冷的异丙醇，混匀，再次静置，琼脂糖析出形成沉淀；

C、分离得到琼脂糖沉淀和含有DNA片段的上清液；

D、分别回收DNA片段和琼脂糖；

步骤A中，所述溶胶夜为弱碱性的异硫氰酸胍溶液(PH值为8.0)。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤C后，还包括以下步骤：

在琼脂糖沉淀中加入TE缓冲液洗涤琼脂糖沉淀，溶解残存在琼脂糖沉淀中的少量DNA片段，离心，取上清液与步骤C中的上清液合并。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤A中，所述加热的过程为65-75℃水浴加热至琼脂糖凝胶完全融化；所述溶胶液为用TE缓冲液(PH值为8.0)溶解异硫氰酸胍制成，其浓度为0.25-0.40mol/L；所述溶胶液的用量为与所述含有DNA琼脂糖凝胶条等体积，或根据DNA片段的含量和琼脂糖凝胶条的浓度，适当调整所述溶胶液的用量；

步骤B中，所述静置冷却过程为置于冰上静置；所述预冷的异丙醇，其预冷温度为-20℃；所述再次静置过程为在冰上静置冷却。

所述的DNA片段的回收方法，其中，所述回收DNA片段过程包括以下步骤：

a1、在上清液中加入依次异丙醇和醋酸钠(PH值为5.2，浓度为3mol/L)溶液，置于低温-18℃至-30℃，沉淀DNA片段；

b1、用乙醇溶液洗涤DNA片段沉淀；

c1、晾干后加入TE缓冲液溶解得到回收的DNA。

所述的DNA片段的回收方法，其中，在进行回收DNA片段的步骤a1之前，若回收的DNA片段含有较多有机污染物或蛋白质，则需加步骤C所得的上清液用同样体积的酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清液。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤c1中，若加入TE缓冲液后有沉淀出现，则将沉淀吹打均匀，使DNA片段充分溶解在TE缓冲液中，离心分离，吸取上清液，得到含有DNA片段的上清液。

所述的DNA片段的回收方法，其中，所述步骤c1中，异丙醇的用量为待加入溶液同等体积；所述醋酸钠溶液的用量为总体积的1/10体积。

所述的DNA片段的回收方法，其中，所述回收琼脂糖过程包括以下步骤：

a2、在琼脂糖沉淀中加入适量的水，加热溶解，得到琼脂糖溶液；

b2、在琼脂糖溶液加入等体积的聚乙二醇溶液，析出琼脂糖沉淀，弃上清液；

c2、用乙醇溶液洗涤琼脂糖沉淀；

d2、在琼脂糖沉淀中加入无水乙醇进行脱水；

e2、烘干，得到琼脂糖粗产品。

所述的DNA片段的回收方法，其中，步骤a2中，所述加热过程是在98℃至100℃金属浴中加热，加热至琼脂糖沉淀完全溶解。

所述的DNA片段的回收方法，其中，在进行步骤e2以前，重复所述步骤a2～d2一次。

有益效果：本发明提出的一种DNA片段的回收方法，是一种新的DNA和琼脂糖同步回收方法，利用弱碱性的异硫氰酸胍溶液溶解含有目DNA的琼脂糖凝胶条，再加入预冷的异丙醇，使琼脂糖析出形成沉淀析出，而大部分的DNA则存在于上清液中，通过离心即可初步分离琼脂糖沉淀和DNA，再分别回收DNA和琼脂糖。该方法可从琼脂糖凝胶中高效同步回收DNA和琼脂糖，还具有廉价实用、低碳环保、快速简便、结果稳定可靠、设备要求简单等特点。

附图说明

图1为本发明实施例中200bp DNA片段回收前的检测结果图。

图2为本发明实施例中对照组Omega回收试剂盒回收200bp DNA片段的检测结果图。

图3为本发明实施例中实验组回收200bp DNA片段的检测结果图。

图4为本发明实施例中实验组回收200bp DNA片段的检测结果图。

图5为本发明实施例中实验组回收200bp DNA片段的检测结果图。

图6为本发明实施例中200bp DNA片段回收电泳图（2%的琼脂糖凝胶）；其中，M：Takara DL2000Marker；1：回收前的DNA片断；2：对照组Omega回收试剂盒回收的DNA片断；3-5：实验组回收的DNA片断。

图7为本发明实施例中200bp DNA片断回收率对比图；其中，1：对照组Omega回收试剂盒回收率；2-4：实验组回收率。

图8为本发明实施例中1kb DNA片段回收前的检测结果图。

图9为本发明实施例中对照组Omega回收试剂盒回收1kb DNA片段的检测结果图。

图10为本发明实施例中实验组回收1kb DNA片段的检测结果图。

图11为本发明实施例中实验组回收1kb DNA片段的检测结果图。

图12为本发明实施例中实验组回收1kb DNA片段的检测结果图。

图13为本发明实施例中1kb DNA片段回收电泳图（1%的琼脂糖凝胶）；其中，M：Takara DL2000Marker；1：回收前的DNA片断；2：对照组Omega回收试剂盒回收的DNA片断；3-5：实验组回收的DNA片断。

图14为本发明实施例中1kb DNA片断回收率对比图；其中，1：对照组Omega回收试剂盒回收率；2-4：实验组回收率。

图15为本发明实施例中10kb DNA片段回收前的检测结果图。

图16为本发明实施例中对照组Omega回收试剂盒回收10kb DNA片段的检测结果图。

图17为本发明实施例中实验组回收10kb DNA片段的检测结果图。

图18为本发明实施例中实验组回收10kb DNA片段的检测结果图。

图19为本发明实施例中实验组回收10kb DNA片段的检测结果图。

图20为本发明实施例中10kb DNA片段回收电泳图（1%的琼脂糖凝胶）；其中，M：Takara DL2000Marker；1：回收前的DNA片断；2：对照组Omega回收试剂盒回收的DNA片断；3-5：实验组回收的DNA片断。

图21为本发明实施例中10kb DNA片断回收率对比图；其中，1：对照组Omega回收试剂盒回收率；2-4：实验组回收率。

图22为本发明实施例中不同长度DNA片段回收率变化图。

图23为本发明实施例中回收成本对比图。

具体实施方式

本发明提供一种DNA片段的回收方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的一种DNA片段的回收方法，其主要原理是利用弱碱性的异硫氰酸胍溶液作为溶胶液，溶解含有目的DNA的琼脂糖凝胶条，琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键作用所致，异硫氰酸胍能破坏氢键作用导致凝胶性的破坏。弱碱性的溶液有使DNA样品在溶胶的过程中不易降解，融后溶液经冰上静置处理后再加入预冷的异丙醇，琼脂糖形成沉淀析出，而大部分的DNA则存在于上清液中，通过离心即可初步分离琼脂糖和DNA，加入TE缓冲液洗涤琼脂糖沉淀可将沉淀中的残余的少量DNA溶解，离心再次得到含DNA的上清液，将两次离心得到的上清液合并在一起，加入异丙醇和醋酸钠溶液，置于-20℃，在弱酸性高盐低温条件下使得DNA的沉淀下来，用70%乙醇溶液洗涤DNA沉淀，晾干后加入TE缓冲液溶解得到回收的DNA。

琼脂糖沉淀回收采用的是加热溶解后加入聚乙二醇溶液再析出，聚乙二醇溶液是一种亲水性较好的溶剂，在含琼脂糖的溶液中，加入聚乙二醇溶液后可以明显降低水的活度，聚乙二醇分子丰富的亲水基团能使琼脂糖表面的荷电基团及亲水基团的水化程度降低，从而降低琼脂糖的介电常数，使其分子之间的静电引力增加，容易聚集形成沉淀从而在溶液中析出。

具体地，所述DNA片段的回收方法，包括以下步骤：

A、在含有DNA的琼脂糖凝胶条中加入溶胶液，混匀；水浴加热至琼脂糖凝胶条融化；

其中，所述溶胶夜为弱碱性的异硫氰酸胍溶液，用TE缓冲液（pH8.0）溶解异硫氰酸胍制成，其浓度为0.25mol/L（浓度在0.25-0.40mol/L均可）。所述溶胶液的用量一般为与所述含有DNA琼脂糖凝胶条等体积。根据DNA片段的分子量和琼脂糖凝胶条的浓度也可适当地增加，如含10kb的DNA片段的凝胶则加入两倍凝胶体积的溶胶液，若凝胶中琼脂糖的浓度较高也需多加溶胶液（一般推荐超过2%浓度的凝胶每增加1%的浓度需多加一倍凝胶体积的溶胶液）。所述混匀的方式为颠倒混匀，使所述琼脂糖凝胶条与所述溶胶液充分接触。所述水浴加热的过程为65℃水浴（65-75℃均可）至凝胶完全融化，期间可颠倒混匀3-4次，以加速凝胶融解。

其中，所述静置冷却过程，可以为置于冰上，使其冷却至0℃左右。所述异丙醇的用量可以与所述融化后的溶液等体积的量，其预冷的温度为-20℃左右。所述混匀的方式可以为振荡混匀，使所述融化后的溶液与预冷的异丙醇充分混合。所述再次静置过程优选为在冰上静置冷却10min左右，使得琼脂糖能充分析出。

C、将上述溶液进行离心，初步分离得到琼脂糖沉淀和含有DNA片段的上清液；

其中，所述离心过程中，离心速度为10000rpm（10000-12000rpm均可），离心时间为2-3min。此时上清液中含有DNA片段和微量的琼脂糖，而沉淀中除了含有琼脂糖外也含有微量的DNA片段。经过上述步骤后，大部分的DNA片段存在于所述上清液中，但是琼脂糖沉淀中仍含有小部分DNA片段。因此，为了提高DNA片段的回收效率，在上述步骤后还可包括以下步骤：

在琼脂糖沉淀中加入TE缓冲液洗涤琼脂糖沉淀，以溶解残存在琼脂糖沉淀中的少量DNA片段，离心，取上清液与上一步骤中的上清液合并。

D、回收DNA片段和琼脂糖。

其中，回收DNA片段包括以下步骤：

（1）在上清液中依次加入异丙醇和醋酸钠溶液，置于低温-20℃（-18℃至-30℃均可），在弱酸性高盐低温条件下，沉淀DNA片段；

（2）弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤DNA片段沉淀；

（3）晾干后加入TE缓冲液溶解得到回收的DNA片段。

其中，在进行步骤（1）之前，若回收的DNA片段含有较多有机污染物或蛋白质，则需加上述步骤所得的上清液用同样体积酚/氯仿，氯仿分别抽提一次，取上清。所述步骤（1）中，异丙醇的用量为加入的体积与琼脂糖与DNA片段的分离中步骤5相同（与待加入溶液同等体积）。所述醋酸钠溶液的用量为总体积的1/10。若需要高纯度的DNA，则可重复所述步骤（2）一次，最后倒扣在滤纸上室温晾干。步骤（3）中，若加入TE缓冲液后仍有微量的琼脂糖沉淀，可能是琼脂糖与DNA片段的分离过程中，琼脂糖未能完全沉淀下来，上清液中含有微量的琼脂糖，于是在最后用异丙醇沉淀DNA过程中连同琼脂糖也一起析出。其解决的方法是将沉淀吹打均匀，使DNA充分溶解在TE缓冲液中，然后离心分离，小心吸取上清液，即可得到高纯度的DNA回收产物。

所述回收琼脂糖过程包括以下步骤：

（1）在琼脂糖沉淀中加入水，加热溶解，得到琼脂糖溶液；

（2）在琼脂糖溶液加入聚乙二醇溶液，析出琼脂糖沉淀，弃上清液；

（3）用乙醇溶液洗涤琼脂糖沉淀，重复该步骤一次；

（4）在琼脂糖沉淀中加入无水乙醇进行脱水，重复该步骤一次；

（5）烘干，得到琼脂糖粗产品。

其中，步骤（1）中，所述加热过程可以在98℃（98℃至100℃均可）金属浴中加热，加热至琼脂糖沉淀完全溶解。步骤（2）中，所用的聚乙二醇溶液可以为浓度为50%的聚乙二醇6000。为了提高琼脂糖粗产品的纯度，在进行步骤（5）以前，可重复步骤（1）～（4）一次。

本发明所提供的DNA片段的回收方法，可以从琼脂糖凝胶中同步回收DNA和琼脂糖，这是一种创新的回收方法，也给其他的实验方法的设计提供了一种新的思维方式。琼脂糖的生产过程产生很多的有害的酸碱废液，而且生产成本较高，因此对于琼脂糖高效快速的回收是非常有必要的，也符合低碳环保、绿色节能的理念，本发明技术方案有着独特的优势。另外，用本发明方法回收一个含有DNA样品的琼脂糖凝胶，只需要少量的异硫氰酸胍，乙醇，异丙醇，聚乙二醇6000以及TE缓冲液，按上述技术方案所耗费的成本为约0.5元。回收过程不仅将琼脂糖回收利用，而且回收过程使用过的乙醇、异丙醇废液，可通过分馏也可回收循环再用，符合环保低碳的同时也使成本进一步降低。由于琼脂糖凝胶中回收DNA片段实验在分子生物学实验中为常用技术，根据该方法回收的琼脂糖不仅降低成本，提高能源资源的利用效率，减少不必要的浪费，还具有节能、低碳环保等特点，这是目前其他回收方法所无法比拟的。

以下通过实施例对本发明技术方案做进一步的说明，但本发明的应用不限于以下实施例的描述。

实施例

1.1实验材料

1.1.1主要化学试剂

琼脂糖购自西班牙Biowest公司；限制性内切酶Xho I购自Fermentas公司；扩展DNA片段使用的引物由华大基因公司合成；凝胶回收试剂盒为美国Omega的产品；2000bp marker为Takara公司产品；1kb ladder marker购自全式金公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2使用的仪器设备

本实施例过程所使用的仪器设备如表1所示。

表1.实施例过程使用的仪器

1.1.3DNA待回收样品制备

（1）200bp DNA样品：来自本实验室保存的多头绒泡菌肉桂醇脱氢酶（PCAD）基因的部分片段的PCR反应产物。

（2）1kb DNA样品：来自本实验室保存的多头绒泡菌肉桂醇脱氢酶（PCAD）基因的PCR反应产物。

（3）10kb DNA样品：来自本实验室保存的乳酸克鲁维分泌表达型T载体（pk-T）质粒，经限制性内切酶Xho I单切线性化后的产物。

1.1.4溶液配方

（1）溶胶液：0.25M/L异硫氰酸胍，用适量的TE缓冲液（pH8.0）溶解295.4g异硫氰酸胍，然后定容至1L。

（2）TE缓冲液（pH8.0）：加入5ml的1M Tris-HCl缓冲液（PH＝8.0）和1ml的0.5M EDTA（PH＝8.0）于烧杯中，并加入约400ml的ddH2O均匀混合，将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存。

（3）3M醋酸钠溶液（PH＝5.2）：称取40.8g NaAc·3H₂O，加入适量的去离子水溶解，再加入适量的冰醋酸调pH值至5.2，然后定容到100ml。

（4）50%聚乙二醇6000溶液：称取5g聚乙二醇6000，加入ddH₂O溶解，定容至10ml。

（5）70%乙醇溶液：量取70ml的无水乙醇，加入ddH₂O至100ml。

（6）50×TAE缓冲液：242g Tris，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/L EDTA（pH8.0），补足1L。

1.2具体步骤

1.2.1琼脂糖凝胶电泳

用1×TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶，根据DNA片段大小选择不同浓度的凝胶，200bp的DNA片段使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，1kb的DNA片段使用1%的琼脂糖凝胶，而10kb的DNA片段使用0.8%的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液。为了减小实验的误差，每个样本的上样量相等，在每个凝胶孔内加入50μl待回收样品，洗脱时加入同样体积洗脱液洗脱DNA，以方便计算DNA回收率。

电泳毕，在紫外灯下切下含待回收的DNA琼脂糖胶条，称量其重量后将其置于干净的1.5ml离心管中（重量大于0.2g的胶条需将胶条切割至小于或等于0.2g的重量，切割后的凝胶分别至于多个离心管中进行回收，保证每个离心管中的凝胶重量少于或等于0.2g）。

本实验以Omega公司凝胶回收试剂盒回收的DNA作为对照组，根据试剂盒附带的说明回收DNA，最后加入50μl TE缓冲液洗脱DNA，实验组则按照下面的回收步骤进行回收。每个DNA片段设置三个平行的实验组。

1.2.2琼脂糖与DNA片段的分离

（1）加入与凝胶等体积的溶胶液于离心管中，含10kb的DNA片段的凝胶则加入两倍凝胶体积的溶胶液，颠倒混匀。65℃水浴约10min至凝胶完全融化，期间混匀3-4次，以加速凝胶融解。

（2）将盛有融后溶液的离心管插入冰内约5min，使其冷却至0℃。

（3）加入与融后溶液等体积的-20℃预冷的异丙醇，振荡混匀，再次插入冰内静置10min，使琼脂糖充分析出。

（4）将冰浴后的溶液以10000rpm离心2min。

（5）将上清液转移到一新的2ml离心管中，小心避免吸入沉淀。

此时大部分的DNA存在上清液中，沉淀的仍含有小部分DNA，因此需加入TE缓冲液洗涤沉淀，以溶解残存在沉淀中的少量DNA。加入100μlTE缓冲液充分洗涤琼脂糖沉淀，12000rpm离心3min，将上清液合并到上一步骤得到的上清液中。

此时上清液中含有DNA片段和微量的琼脂糖，而沉淀中除了含有琼脂糖外也含有微量的DNA，以下步骤将分别回收DNA和琼脂糖。

1.2.3DNA的回收

（1）若回收的DNA片段含有较多有机污染物或蛋白质，则需加上述步骤所得的上清液同样体积的酚/氯仿，氯仿分别抽提一次，取上清。由于本实验回收的DNA样品中只含有少量的琼脂糖和无机盐等杂质，因此省去该步骤。

（2）将上述步骤所得的上清液在加入异丙醇，加入的体积与琼脂糖与DNA片段的分离中步骤5相同，另外再加入总体积1/10体积3M醋酸钠溶液（PH＝5.2），振荡混匀后于-20℃中静置15min。

（3）4℃下，12000rpm离心15min，弃上清，再加入700μl70%乙醇洗涤沉淀，然后以12000rpm离心5min，弃上清，如果下游实验需要高纯度的DNA则重复该步骤一次，最后倒扣在滤纸上室温晾干。

（4）加入50μl TE缓冲液溶解沉淀，并进行电泳鉴定。

（5）电泳及利用超微量核酸浓度仪鉴定DNA回收情况。

1.2.4琼脂糖的回收

（1）在沉淀后的琼脂糖中加入200μl的ddH₂O，悬起后置于98℃金属浴中约5min，至琼脂糖完全溶于水中。

（2）加入200μl的50%聚乙二醇6000溶液，充分震荡，于室温静置10分钟待琼脂糖析出。

（3）12000rpm离心10min，弃上清。

（4）加入700μl70%乙醇洗涤沉淀，然后以12000rpm离心5min，弃上清，重复一次该步骤。

（5）加入无水乙醇进行脱水，12000rpm离心5min，弃上清，并重复一次该步骤。

（6）重复上述琼脂糖回收的步骤一次。

（7）40℃下烘干，即得到琼脂糖粗产品。

1.2.5测定方法

（1）DNA回收率及纯度测定

电泳前的DNA片段和回收后的DNA片段进行电泳鉴定，并且利用超微量核酸浓度仪测定回收前后样品浓度测定溶液中核酸含量，从而计算出DNA的回收率，并且超微量核酸浓度仪提供了OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值用以判断回收DNA的纯度。回收结果数据以均数表示。

（2）琼脂糖回收率测定

琼脂糖回收率通过称量法测定，切下含的DNA琼脂糖胶条后，称量其重量，根据胶的浓度可计算出回收前琼脂糖的含量。最后称量烘干后的琼脂糖的重量，可得到琼脂糖的回收率。并且对回收的琼脂糖的状态进行评价。回收结果数据以均数表示。

2.1不同长度DNA片段回收结果比较

将DNA与琼脂糖分离后，加入异丙醇和3M醋酸钠溶液（PH＝5.2）沉淀DNA，最后加入50μl TE缓冲液溶解DNA，由于回收前是加入的是50μl的样品，试剂盒对照组同样也加入50μl洗脱液，因此可直接根据回收的DNA浓度进行比较，并计算出回收率。

200bp DNA片段回收结果见表2，图1至图7，实验组的平均回收率为19.85%，对照组利试剂盒回收率为22.11%，无论使用本方法还是对照组使用的试剂盒的回收的率均偏低。

1kb DNA片段的回收结果见表3，图8至图14，实验组回收效率达到36.40%，对照组回收率也高达54.60%，可见该长度的片段回收的效率较高。

10kb DNA片段与前面两组相比，回收率最低，只有13.49%，对照组回收率为28.56%，约为实验组的2倍，可能是初次和琼脂糖分离过程中，由于片段较大容易随琼脂糖沉淀所致，具体见表3及图15至图21。

从回收DNA片段的电泳图（图6，图13，图20）可知，本方法可有效回收不同长度DNA分子，回收所得的片段条带清晰锐利，无肉眼可见的杂带，片段大小与回收前相同，无核酸污染情况。根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值均可知本方法回收的DNA纯度高，比值均大于1.9，可直接用于下游操作，并且实验组回收的DNA的纯度均高于采用试剂盒回收的对照组。

表2.200bp DNA片段回收率比较

表3.1kb DNA片段回收率比较

表4.10kb DNA片段回收率比较

2.2琼脂糖回收率比较

利用50%的聚乙二醇溶液沉淀回收琼脂糖，含不同长度DNA片段琼脂糖回收结果见表5，含200bpDNA片段回收率为62.86%，而含1kb DNA片段回收率为61.96%，含10kb DNA片段回收则率为62.74%，回收率的差别较小，可见琼脂糖的回收率几乎不受回收DNA片段大小影响。回收得到的琼脂糖均为灰白颗粒，实验证明回收后的琼脂糖可收集起来循环利用，在水溶液中加热再冷却后可形成凝胶，其性状与商品琼脂糖所制得的凝胶并无差别。

表5.琼脂糖回收率比较

2.3回收率与DNA片段大小的关系及回收成本比较

回收率与DNA片段大小的关系见图22，由图可见DNA片段过大或过小都会使回收率降低，而大小为中等的1kb的DNA片段回收率最高，达36.40%。在小200bp DNA片段回收中，虽然实验组和对照组的回收率均偏低，但实验组和对照组的回收率最接近，实验组平均回收率为19.85%，对照组回收为22.11%，仅相差2.26%。在长片段10kb DNA片段回收中，对照组的回收率与本方法的回收率差别较大。本实验使用的同步回收法在中小DNA片段的回收率较高，且回收纯度高，因此适合在200bp至1kb范围大小的DNA片段回收。

而从回收成本中考虑，对照组使用的Omega试剂盒回收一个样品的价格为6元，实验组的回收成本每个样品约为0.5元，仅为对照组的1/12，如图23所示，两者相比较，本方案较之商业化的回收试剂盒相比可大大节省实验成本，具有经济实用、操作简单、低碳环保等优点。

综上所述，在现有多种DNA回收方法中试剂盒回收是最常用的，而试剂盒回收虽然具有快捷、较简单的特点，但价格较贵。在200bp至1kb长度的DNA片段回收效果较好，特别是在200bp DNA片段的回收。本发明方法的回收率非常接近试剂盒的回收方法，但实验成本大大降低，两者回收率仅相差2.26%，但回收成本仅为试剂盒的回收成本1/12，并且回收的样品的纯度更高。而本方法在1kb的DNA片段回收率三种不同大小片段中最高的，达36.4%，虽然不够试剂盒回收方法的回收率高，但由于回收的DNA纯度较好，回收成本低廉（大规模回收操作时成本更低），可满足一般的回收实验的要求。

本方法在上述三个实验组的回收中，纯度均高于对照组，从琼脂糖凝胶电泳图可以看到实验组回收的DNA条带清晰锐利，无肉眼可观测的杂带，而试剂盒回收组回收的DNA还能看到微弱的杂带，因此对于需要高纯度的DNA的下游实验操作，本方法可提供高于试剂盒回收纯度的DNA。综合回收成本、回收率、纯度等考虑，本方法在200bp至1kb长度的DNA片段回收有一定的优势。

从回收过程来看，由于实验步骤简单快捷，避免了出现如其它方法回收效率低、操作复杂、DNA回收过程中容易降解等问题。本方法对实验器材和试剂要求低、具有简便、经济实用，回收纯度高，成本低廉等特点，特别适合在实验条件较薄弱的实验室采用，是一种非常适合科学研究和教学的实验方法。同时，由于回收成本低廉、设备要求低、符合实现程序化的要求、能够大规模操作，因此也非常适合在设备条件较差的企业生产上推广采用。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种DNA片段的回收方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、在含有DNA的琼脂糖凝胶条中加入浓度为0.25-0.40mol/L的弱碱性的异硫氰酸胍溶液，混匀，加热至琼脂糖凝胶条融化；所述加热的过程为65-75℃水浴加热至琼脂糖凝胶完全融化；所述溶胶液为用TE缓冲液溶解异硫氰酸胍制成，pH值为8.0；所述溶胶液的用量为与所述含有DNA琼脂糖凝胶条等体积，或根据DNA片段的含量和琼脂糖凝胶条的浓度，适当调整所述溶胶液的用量；

B、将融化后的溶液在冰上静置冷却，加入预冷温度为-20℃的异丙醇，混匀，再次在冰上静置，琼脂糖析出形成沉淀；

C、分离得到琼脂糖沉淀和含有DNA片段的上清液；

D、在琼脂糖沉淀中加入TE缓冲液洗涤琼脂糖沉淀，溶解残存在琼脂糖沉淀中的少量DNA片段，离心，取上清液与步骤C中的上清液合并；

E、分别回收DNA片段和琼脂糖；其中，回收DNA片段过程包括以下步骤：若回收的DNA片段含有较多有机污染物或蛋白质，则需加步骤C所得的上清液用同样体积的酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清液；在上清液中依次加入异丙醇和醋酸钠溶液，置于低温-18℃至-30℃，沉淀DNA片段，其中，异丙醇的用量为与待加溶液同等体积，醋酸钠溶液的用量为总体积的1/10体积；弃上清液，用乙醇溶液洗涤DNA片段沉淀；晾干后加入TE缓冲液溶解得到回收的DNA，若加入TE缓冲液后有沉淀出现，则将沉淀吹打均匀，使DNA片段充分溶解在TE缓冲液中，离心分离，吸取上清液，得到含有DNA片段的上清液。

2.根据权利要求1所述的DNA片段的回收方法，其特征在于，所述回收琼脂糖过程包括以下步骤：

a2、在琼脂糖沉淀中加入水，加热溶解，得到琼脂糖溶液；

b2、在琼脂糖溶液加入聚乙二醇溶液，析出琼脂糖沉淀，弃上清液；

c2、用乙醇溶液洗涤琼脂糖沉淀；

d2、在琼脂糖沉淀中加入无水乙醇进行脱水；

e2、烘干，得到琼脂糖粗产品。

3.根据权利要求2所述的DNA片段的回收方法，其特征在于，步骤a2中，所述加热过程是在98℃至100℃金属浴中加热，加热至琼脂糖沉淀完全溶解。

4.根据权利要求2所述的DNA片段的回收方法，其特征在于，在进行步骤e2以前，重复所述步骤a2～d2一次。