CN103342757B - 一种两亲性硫酸软骨素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体内吸收效果好、生物利用度高、疗效稳定的两亲性硫酸软骨素衍生物及其制备方法和应用。其平均分子量（Mw）为3,100～50,000Da，通式如下：其中x为碳原子的个数，是10～22的整数；y为双键的个数，为0～6的整数；n为8～150的整数；O-烷基取代度为5％～50％。

Description

一种两亲性硫酸软骨素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种硫酸软骨素衍生物，具体涉及一种两亲性硫酸软骨素衍生物及其制备方法和应用。属于多糖及高分子材料技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一类硫酸化的糖胺聚糖，存在于人和动物结缔组织中，主要分布于软骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中，由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1,3苷键连接形成二糖，二糖之间以β-1,4苷键连接而成，相对分子质量(Mr)一般为25,000-30,000。根据其分子结构中糖醛酸种类和氨基己糖上硫酸酯位置的差异，主要分为硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸软骨素C(CS-C)、硫酸软骨素D(CS-D)、硫酸软骨素E(CS-E)等，结构如下：

R₁＝SO₃ ^-,R₂＝R₃＝H:CS-A R₂＝SO₃ ^-,R₁＝R₃＝H:CS-C

R₂＝R₃＝SO₃ ^-,R₁＝H:CS-D R₁＝R₂＝SO₃ ^-,R₃＝H:CS-E

在欧洲、美国、日本等国家，硫酸软骨素主要作为保健食品或药品，用于抗炎、免疫调节、心脑血管保护、神经保护、抗氧化、细胞黏附调节、抗肿瘤等，临床上应用广泛。普通硫酸软骨素分子量大、亲水性强、脂溶性差，存在口服吸收困难不完全、生物利用度低、疗效不稳定等缺点。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，特别是口服吸收差等问题，提供一种口服吸收效果好、生物利用度高、疗效稳定的两亲性硫酸软骨素衍生物；

本发明还提供了该两亲性硫酸软骨素衍生物的制备方法；

对应的，提供了该两亲性硫酸软骨素衍生物的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种两亲性硫酸软骨素衍生物，其平均分子量(Mw)为3,100～50,000Da，通式如下：

R₁＝SO₃ ^-,H,COC_xH_2x-2yCH₃

R₂＝H,COC_xH_2x-2yCH₃,SO₃ ^-

R₃＝H,COC_xH_2x-2yCH₃,SO₃ ^-

其中x为碳原子的个数，是10～22的整数；y为双键的个数，为0～6的整数；n为8～150的整数；O-烷基取代度为5％～50％。

优选的，x＝16，y＝3；O-烷基取代度为5％～20％。

上述的两亲性硫酸软骨素衍生物，其制备方法如下：

(1)取长链脂肪酸20～50g，二氯亚砜50～100mL，氮气保护下20～70℃反应1～6小时，减压蒸馏去除未反应的二氯亚砜，所得产物即为脂肪酰氯；

(2)将分子量为3,000～40,000Da的硫酸软骨素与二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于甲酰胺中，搅拌，加入脂肪酰氯，20～80℃搅拌1～12小时，反应结束后得到的反应溶液经后处理得到微黄色固体粉末，即为脂肪酰-硫酸软骨素；其中，脂肪酰氯、二甲基氨基吡啶、甲酰胺、硫酸软骨素的质量比为2.5～0.07:1～0.1:20～10:1；

(3)称取10mg脂肪酰-硫酸软骨素溶于2～5mL甲酰胺中，以透析袋透析后，得到脂肪酰-硫酸软骨素纳米胶束，即为两亲性硫酸软骨素衍生物。

所述步骤(1)中，长链脂肪酸为豆蔻酸、棕榈酸、棕榈一烯酸、十七烷酸、十七碳一烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生一烯酸、花生二烯酸、山嵛酸、芥酸、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳六烯酸、木焦油酸、二十四碳一烯酸中的一种或几种。

所述步骤(2)中，硫酸软骨素为猪硫酸软骨素、牛硫酸软骨素、鲨鱼硫酸软骨素、鸡硫酸软骨素、鸭硫酸软骨素、乌贼硫酸软骨素、鲟鱼硫酸软骨素、鳗鱼硫酸软骨素、鳐鱼硫酸软骨素、魟鱼硫酸软骨素中的一种或几种。

所述步骤(1)中，反应温度为20～70℃，因为温度过低则反应不完全，温度过高脂肪酸可能会被氧化变质；反应时间为1～6小时，时间过短则反应不完全，时间过长脂肪酸可能会被氧化变质。

所述步骤(2)中，后处理的具体方法是：

反应溶液经透析、超滤去除未能反应的脂肪酸、多余的溶剂及催化剂，得到微黄色产物，用体积浓度为95％的乙醇溶液、甲醇或丙酮洗涤2次，45℃下真空干燥10～20小时。

所述步骤(3)中，所述透析袋的截留分子量(MWCO)为1000～10000，透析是指利用该透析袋对去离子水透析2天。

所述步骤(2)中，脂肪酰氯与硫酸软骨素的结构单元的摩尔比为3～0.1：1，脂肪酰氯与硫酸软骨素的结构单元的摩尔比过低，则羟基的取代度较低；脂肪酰氯与硫酸软骨素的结构单元的摩尔比过高，则过量的脂肪酸在后续纯化处理中较难除净且所得产品水溶性较低。硫酸软骨素的分子量为3,000～40,000Da，硫酸软骨素的分子量过低，反应过程中发生降解，得率较低；分子量过大，则长链烷基取代度较低。

上述的两亲性硫酸软骨素衍生物可用于制备抗炎、免疫调节、心脑血管保护、神经保护、抗氧化、细胞黏附调节、抗肿瘤药物。本申请的两亲性硫酸软骨素衍生物特别适用于制备纳米粒给药系统，作为药物载体应用。

本发明的原理是：

本发明将长链脂肪酸酰氯化，增强了脂肪酸的反应活性，解决了硫酸软骨素修饰过程中基团活性低的问题。长链脂肪酸与硫酸软骨素的羟基通过酯化反应连接，制得两亲性的O-长链酰基-硫酸软骨素接枝共聚物，其在水溶液中可自组装形成50～300nm的纳米粒。与现有的硫酸软骨素相比，本发明克服了传统硫酸软骨素口服吸收差的局限性，该硫酸软骨素衍生物利用度好、易于口服吸收，有利于增强硫酸软骨素的药理作用；与现有高分子聚合物相比，该聚合物在水溶液中可自组装形成纳米颗粒，完全可生物降解，生物相容性良好，且具有易修饰的官能团，可用做药物载体。

本发明的有益效果：

本发明用可生物降解的天然来源的硫酸软骨素作为原料，对其羟基进行修饰，改善硫酸软骨素的亲脂性，使其具有两亲性，即一部分糖链含有亲水基、另一部分糖链含亲脂基。本发明以硫酸软骨素为原料，在其-OH上接入长链脂肪酰，经修饰得到的硫酸软骨素衍生物除具有良好的口服生物利用度，可提高硫酸软骨素的药理作用外，还具有下列优点：

(1)多糖主链具有更好的生物亲和性、生物相容性、细胞识别等生物功能，且糖链分子间及分子内存在弱相互作用，能够自组装形成纳米级壳核多糖胶束，作为药物载体可用于体内难溶性药物的吸收、缓释及靶向定位；

(2)易修饰性：硫酸软骨素糖链上含有羧基、羟基、硫酸根等多种活性基团，易引入功能基团或小分子药物，从而制得许多具有特殊功能的产物。通过修饰来调节硫酸软骨素及其衍生物大分子链的结构或组成，从而可实现可控释放；

(3)组成两亲性硫酸软骨素的材料均为天然可生物降解的材料，其降解产物或为人体本身具有的物质或为人体必需的物质，不仅不会产生蓄积和毒副作用，还可能与硫酸软骨素在心脑血管系统保护、抗肿瘤、抗炎等方面产生协同治疗作用，因此具有疗效好、无毒性、无免疫原性和抗原性、生物相容性良好的特点；

(4)本发明所制备的硫酸软骨素衍生物在水中可自发聚合形成疏水核亲水壳的纳米粒，能够减少网状内皮细胞和巨噬细胞的吞噬，实现体内的长循环；

(5)本发明所制备的硫酸软骨素衍生物形成的纳米粒表面带有易修饰的羧基和羟基，可进一步与特异性配体结合，可作为主动靶向药物载体。

附图说明

图1为α-亚麻酸修饰的猪硫酸软骨素核磁谱图；

图2为α-亚麻酸修饰的猪硫酸软骨素红外谱图；

图3为α-亚麻酸修饰的猪硫酸软骨素自组装的纳米胶束的粒径分布图；

图4为α-亚麻酸修饰的猪硫酸软骨素自组装的纳米胶束透射电镜照片；

图5为α-亚麻酸-猪硫酸软骨素的细胞毒性实验图；

图6为给药后SD大鼠血浆中猪硫酸软骨素及其衍生物的药物动力学曲线(200mg/kg)；

图7为体外药物转运结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述。应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1油酰-鲨鱼硫酸软骨素的合成及其纳米粒子的制备

1.油酰氯的制备

取油酸20g，二氯亚砜50mL，70℃反应1小时，减压蒸馏去除未反应的二氯亚砜，所得产物即为油酰氯。

2.油酰-鲨鱼硫酸软骨素的合成

取10mmol的鲨鱼硫酸软骨素(Mw：25,000)与1g二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于100mL甲酰胺，55℃搅拌溶解。加入5mmol的油酰氯进行酯化反应，于55℃搅拌2小时，反应溶液在水中透析2天，去除多余的溶剂及催化剂。在体积浓度为95％的乙醇溶液中继续透析2天，以去除未能反应的油酸。透析后所得的微黄色的产物用5mL体积浓度为95％的乙醇溶液中洗涤2次，45℃下真空干燥，所得微黄色固体粉末即为用油酰修饰后的鲨鱼硫酸软骨素，油酰取代度为5.9％。

3.油酰-鲨鱼硫酸软骨素纳米胶束的制备

称取10mg油酰-鲨鱼硫酸软骨素加入5mL甲酰胺，溶解，装入透析袋(MWCO 10000)对去离子水透析2天，即得油酰-鲨鱼硫酸软骨素纳米胶束，制得纳米胶束的平均粒径为117.7±5.1nm。

实施例2油酰-低分子量鲨鱼硫酸软骨素的合成及其纳米粒子的制备

1.低分子量鲨鱼硫酸软骨素的制备

取纯化后的鲨鱼硫酸软骨素(Mw：25,000)50g、水500mL，搅拌溶解。加150mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，75℃保温10小时。冷却后，加4倍体积的体积浓度为95％的乙醇溶液醇沉，沉淀过夜，离心，弃去上清，固体45℃下真空干燥，收率72％，所得产品平均分子量(Mw)为4800。

2.油酰氯的制备

取油酸20g，二氯亚砜50mL，70℃反应1小时，减压蒸馏去除未反应的二氯亚砜，所得产物即为油酰氯。

3.油酰-低分子量鲨鱼硫酸软骨素的合成

取10mmol的低分子量鲨鱼硫酸软骨素(Mw：4,800)与1g二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于100mL甲酰胺中，55℃搅拌溶解。加入5mmol的油酰氯进行酯化反应，于55℃搅拌2小时，反应溶液在水中透析2天，去除多余的溶剂及催化剂。体积浓度为95％的乙醇溶液中继续透析2天，以去除未能反应的油酸。透析后所得的微黄色的产物用5mL体积浓度为95％的乙醇溶液洗涤2次，45℃下真空干燥，所得微黄色固体粉末即为用油酰修饰后的鲨鱼硫酸软骨素，油酸取代度为6.1％。

4.油酰-低分子量鲨鱼硫酸软骨素纳米胶束的制备

称取10mg油酰-低分子量鲨鱼硫酸软骨素加入5mL甲酰胺，溶解，装入透析袋(MWCO1000)对去离子水透析2天，即得油酰-低分子量鲨鱼硫酸软骨素纳米胶束，制得纳米胶束的平均粒径为103.2±7.1nm。

实施例3α-亚麻酰-猪硫酸软骨素的合成及其纳米粒子的制备

1.α-亚麻酰氯的制备

取α-亚麻酸20g，二氯亚砜50mL，70℃反应1h，减压蒸馏去除未反应的二氯亚砜，所得产物即为α-亚麻酰氯。

2.α-亚麻酰-猪硫酸软骨素的合成

取10mmol的猪硫酸软骨素(Mw：22,500)与1g二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于100mL甲酰胺中，55℃搅拌溶解。加入10mmol的α-亚麻酰氯进行酯化反应，于55℃搅拌2小时，反应溶液在水中透析2天，去除多余的溶剂及催化剂。在体积浓度为95％的乙醇溶液中继续透析2天，以去除未能反应的α-亚麻酸。透析后所得的微黄色的产物用5mL体积浓度为95％的乙醇溶液洗涤2次，45℃下真空干燥，所得微黄色固体粉末即为用α-亚麻酰修饰后的猪硫酸软骨素，α-亚麻酰取代度为8.5％。

3.α-亚麻酰-猪硫酸软骨素纳米胶束的制备

称取10mgα-亚麻酰-猪硫酸软骨素加入5mL甲酰胺，溶解，装入透析袋(MWCO 10000)对去离子水透析2天，即得α-亚麻酰-猪硫酸软骨素纳米胶束，制得纳米胶束的平均粒径为133.7±4.1nm。

实施例4α-亚麻酰-低分子猪硫酸软骨素的合成及其纳米粒子的制备

1.低分子量猪硫酸软骨素的制备

取纯化后的猪硫酸软骨素(Mw：22,500)30g、水300mL，搅拌溶解。加90mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，75℃保温12小时。冷却后，加4倍体积的体积浓度为95％的乙醇溶液醇沉，沉淀过夜，离心，弃去上清，固体45℃下真空干燥，收率72％，所得产品平均分子量(Mw)为4120。

2.α-亚麻酰氯的制备

取α-亚麻酸20g，二氯亚砜50mL，70℃反应1小时，减压蒸馏去除未反应的二氯亚砜，所得产物即为α-亚麻酰氯。

3.α-亚麻酰-低分子量猪硫酸软骨素的合成

取10mmol的低分子量猪硫酸软骨素与1g二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于100mL甲酰胺中，55℃搅拌溶解。分别加入1mmol、5mmol、10mmol、20mmol的α-亚麻酰氯进行酯化反应，于55℃搅拌12小时，所得产物依次记为LNA-LMCS 1，LNA-LMCS 2，LNA-LMCS3，LNA-LMCS 4。反应溶液在水中透析2天，去除多余的溶剂及催化剂。体积浓度为95％的乙醇溶液中继续透析2天，以去除未能反应的α-亚麻酸。透析后所得的微黄色的产物用5mL体积浓度为95％的乙醇溶液洗涤2次，45℃下真空干燥，所得微黄色固体粉末即为用α-亚麻酰修饰后的猪硫酸软骨素，α-亚麻酰取代度分别为3.4％、5.7％、8.5％、12.3％。

4.α-亚麻酰-低分子量猪硫酸软骨素纳米胶束的制备

称取10mgα-亚麻酰-低分子量猪硫酸软骨素加入5mL甲酰胺，溶解，装入透析袋(MWCO 1000)对去离子水透析2天，即得α-亚麻酰-低分子量猪硫酸软骨素纳米胶束，制得纳米胶束的平均粒径为91.9±4.7nm。具体实验结果见图1～4。

实施例5α-亚麻酰-猪硫酸软骨素的细胞毒性实验

将Caco-2细胞接种于96孔板上(8000cells/well)，每孔体积100μL，接种后，将96孔板于37℃、体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养过夜，加入100μL的修饰后的猪硫酸软骨素溶液(浓度范围为20-500μg/mL)。于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养48小时后小心的吸取弃去上层液，每孔加入20μL MTT溶液(浓度为5mg/mL)，于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养4小时，终止培养，小心吸弃上层液，每孔加150μL的DMSO，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶溶解。用酶联免疫检测仪于490nm处测其吸光度值，计算细胞存活率。结果见图5，从测定结果得出猪硫酸软骨素及其衍生物的细胞毒性呈现出一定药物浓度依赖性，呈一定的正相关性，修饰后在浓度为500μg/mL时依然表现出了较高的存活率(90％以上)，基本无生物毒性。

实施例6给药后SD大鼠血浆中猪硫酸软骨素及其衍生物的药物动力学

清洁级雄性SD大鼠36只，体重230±10g，适应7天后，将大鼠随机分为6组(猪硫酸软骨素组和修饰后猪硫酸软骨素组)，每组10只。实验前禁食(不禁水)12小时，给药剂量为200mg/kg，于开始给药后0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24小时眼内眦取血，离心取血浆，采用二甲基亚甲兰法测定血液中硫酸软骨素的含量。

结果见图6a和图6b，其中，CS：猪硫酸软骨素；LWCS：低分子量猪硫酸软骨素；LNA-LWCS1：α-亚麻酰修饰的低分子量猪硫酸软骨素样品1(由实施例4获得，取代度为3.4％)；LNA-LWCS2：α-亚麻酰修饰的低分子量猪硫酸软骨素样品2(由实施例4获得，取代度为5.7％)；LNA-LWCS3：α-亚麻酰修饰的低分子量猪硫酸软骨素样品3(由实施例4获得，取代度为8.5％)；LNA-LWCS4：α-亚麻酰修饰的低分子量猪硫酸软骨素样品4(由实施例4获得，取代度为12.3％)。

由结果可得，修饰后猪硫酸软骨素的口服吸收能力大大增加。

实施例7采用实施例4中的纳米复合物进行体外细胞药物转运试验

采用Caco-2细胞系评价载体外细胞药物转运。将Caco-2细胞(1×10⁵cells/well)接种于激光共聚焦小皿中，在37℃、体积分数为5﹪的二氧化碳的培养箱中培养，每皿加2mL的培养基。培养4天后，去除培养基，用0.5mL PBS洗涤1次，HBSS缓冲液孵育30分钟后加入0.4mL 5-氨基荧光素标记的猪硫酸软骨素及其衍生物(100μg/mL)溶液孵育2小时，用0.5mL冷PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定10分钟，0.5mL冷PBS洗涤3次，质量浓度为1％的曲通-100孵育5分钟，0.5mL冷PBS洗涤3次，0.3mL 2μg/mL的Hoechst 33258蓝色荧光探针孵育20分钟，0.5mL冷PBS洗涤3次，0.3mL 10μg/mL DiI红色荧光探针孵育10分钟，0.5mL冷PBS洗涤3次，加入0.15mL抗荧光淬灭剂，激光共聚焦显微镜下观察药物转运状况。

体外药物转运结果如图7所示，与未修饰的猪硫酸软骨素相比，修饰后的猪硫酸软骨素在Caco-2细胞中以及细胞间隙中的浓度显著提高，说明修饰后的猪硫酸软骨素易于被吸收，也易于进入细胞内，起到了良好的药物转运的效果。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种两亲性硫酸软骨素衍生物，其特征在于，其平均分子量为3,100～50,000Da，通式如下：

其中x为碳原子的个数，是10～22的整数；y为双键的个数，为0～6的整数；n为8～150的整数；O-烷基取代度为5％～50％。

2.根据权利要求1所述的一种两亲性硫酸软骨素衍生物，其特征在于，x=16，y=3；O-烷基取代度为5％～20％。

3.权利要求1或2所述的一种两亲性硫酸软骨素衍生物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）取长链脂肪酸20～50g，二氯亚砜50～100mL，氮气保护下20～70℃反应1～6小时，减压蒸馏去除未反应的二氯亚砜，所得产物即为脂肪酰氯；

（2）将分子量为3,000～40,000Da的硫酸软骨素与二甲基氨基吡啶溶于甲酰胺中，搅拌，加入脂肪酰氯，20～80℃搅拌1～12小时，反应结束后得到的反应溶液，经后处理得到微黄色固体粉末，即为脂肪酰-硫酸软骨素；其中，脂肪酰氯、二甲基氨基吡啶、甲酰胺、硫酸软骨素的质量比为2.5～0.07:1～0.1:20～10:1；

（3）称取10mg脂肪酰-硫酸软骨素溶于2～5mL甲酰胺中，以透析袋透析后，得到脂肪酰-硫酸软骨素纳米胶束，即为两亲性硫酸软骨素衍生物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，长链脂肪酸为豆蔻酸、棕榈酸、棕榈一烯酸、十七烷酸、十七碳一烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生一烯酸、花生二烯酸、山嵛酸、芥酸、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳六烯酸、木焦油酸、二十四碳一烯酸中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，硫酸软骨素为猪硫酸软骨素、牛硫酸软骨素、鲨鱼硫酸软骨素、鸡硫酸软骨素、鸭硫酸软骨素、乌贼硫酸软骨素、鲟鱼硫酸软骨素、鳗鱼硫酸软骨素、鳐鱼硫酸软骨素、魟鱼硫酸软骨素中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，后处理的具体方法是：

反应溶液经在水中透析、超滤后去除未能反应的脂肪酸、多余的溶剂及催化剂，得到微黄色产物，用体积浓度为95%的乙醇溶液、甲醇或丙酮洗涤2次，45℃下真空干燥10～20小时。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述透析袋的截留分子量为1000～10000，透析是指利用该透析袋对去离子水透析2天。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，脂肪酰氯与硫酸软骨素的结构单元的摩尔比为3～0.1：1，硫酸软骨素的分子量为3,000-40,000Da。

9.权利要求1或2所述的一种两亲性硫酸软骨素衍生物在制备抗炎、免疫调节、心脑血管保护、神经保护、抗氧化、细胞黏附调节、抗肿瘤药物中的应用。

10.权利要求1或2所述的一种两亲性硫酸软骨素衍生物作为药物载体的应用。