CN115819641A - 一种改性硫酸软骨素及其制备方法和药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改性硫酸软骨素及其制备方法和药物组合物，涉及医药技术领域。本发明提供的改性硫酸软骨素具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构。本发明提供的改性硫酸软骨素的结构包括小分子硫酸软骨素主结构(LWCS)和接枝在所述小分子硫酸软骨素主结构上的脂溶性疏水端(X)，其中脂溶性疏水端(X)来源于槲皮素、α‑亚麻酸或烯醇型姜黄素。在本发明中，所述小分子硫酸软骨素主结构(LWCS)作为亲水端，在水中亲水端向外，脂溶性疏水端向内，自组装成胶束，能够有效将LMCS输送至小肠，实现生物利用度的提高。因此，本发明提供的改性硫酸软骨素在肠道中的吸收性好，生物利用度高，为高吸收性硫酸软骨素。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种改性硫酸软骨素及其制备方法和药物组合物。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitinsulfate，CS)是一种硫酸化糖胺聚糖，是高水溶性阴离子多糖，也是软骨细胞外基质(ECM)的关键成分，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面。CS是软骨的重要结构成分，并提供了大部分的抗压缩性。CS具有广泛的生物活性，包括组织再生、细胞内信号转导和药物传递系统。研究显示，CS的GalNAc残基与肝细胞膜上的ASGPRs有特异性结合，这些部分可以作为靶向HCC的配体，并通过ASGPR介导的内吞作用增加细胞摄取。与氨基葡萄糖一起，CS已成为一种广泛使用的用于治疗骨关节炎的膳食补充剂，是治疗骨关节炎的有力工具。几项对照试验表明，其在膝关节炎和关节软骨炎的治疗中具有非常好的耐受性。在之前的一项研究中，20名健康的人类志愿者口服牛CS，并在48小时内从血浆中提取和纯化。口服给药后，CS血浆水平增加(超过200％)。通过给药后血浆中双糖的组成与基线相比的变化，也证明了外源性CS的吸收。
但CS仍面临着口服生物利用率低的问题。研究显示，目前CS的口服生物利用度为15～24％，严重影响其在小肠部位的吸收，这可能是CS口服生物利用度低的原因。在口服配方中，分子量(Mw)直接影响其生物利用度，从而限制了天然CS的使用，低分子量硫酸软骨素(LWCS)可以有效克服这些缺点。有报道称，与CS相比，LWCS更容易通过肠黏膜。琼脂糖凝胶电泳测定显示，CS的分子量为1～5万Da，其到达血液的分子质量大约为2000Da时吸收效果最佳。因此，低分子量硫酸软骨素(LWCS)有利于提高硫酸软骨素口服生物利用度。但是目前低分子量硫酸软骨素的生物利用度仍有待提高。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种改性硫酸软骨素及其制备方法和药物组合物。本发明提供的改性硫酸软骨素在肠道中的吸收性好，生物利用度高，为高吸收性硫酸软骨素。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种改性硫酸软骨素，其特征在于，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构：
式Ⅰ中，X1为
式Ⅱ中，X2为
式Ⅰ和式Ⅱ中n为3～7。
本发明提供了以上技术方案所述改性硫酸软骨素的制备方法，包括以下步骤：
将脂溶性疏水化合物与二氯亚砜混合进行取代反应，得到酰氯化合物；所述脂溶性疏水化合物为槲皮素、α-亚麻酸或烯醇型姜黄素；
将所述酰氯化合物、小分子硫酸软骨素、催化剂和有机溶剂混合进行酯化反应，得到所述改性硫酸软骨素；所述小分子硫酸软骨素的分子量为1600～2200Da。
优选地，所述脂溶性疏水化合物与二氯亚砜的用量比为20g:(50～100)mL。
优选地，所述取代反应的温度为50～80℃，时间为0.5～2h。
优选地，所述小分子硫酸软骨素与脂溶性疏水化合物的质量比为1:(0.2～2)；所述催化剂为二甲基氨基吡啶，所述催化剂与脂溶性疏水化合物的用量比为8～12mmol:20g；所述有机溶剂为甲酰胺。
优选地，所述酯化反应的温度为40～70℃，时间为1～3h。
优选地，所述酯化反应后，还包括将所得酯化反应液依次进行透析、醇沉、固液分离和固相干燥。
优选地，所述透析采用的透析袋的截留分子量为2000Da；所述醇沉采用的醇试剂为乙醇-水混合溶液，所述乙醇-水混合溶液中乙醇的体积分数为95％。
本发明提供了一种药物组合物，包括药物活性成分和药学上可接受的辅料，所述药物活性成分为以上技术方案所述的改性硫酸软骨素或以上技术方案所述制备方法制备得到的改性硫酸软骨素。
优选地，所述药物组合物的剂型为口服制剂。
本发明提供了改性硫酸软骨素，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构。本发明提供的改性硫酸软骨素的结构包括小分子硫酸软骨素主结构(LWCS)和接枝在所述小分子硫酸软骨素主结构上的脂溶性疏水端(X1和X2，简写为X)，其中脂溶性疏水端(X)来源于槲皮素、α-亚麻酸或烯醇型姜黄素。在本发明中，所述小分子硫酸软骨素主结构(LWCS)作为亲水端，在水中亲水端向外，脂溶性疏水端向内，自组装成胶束，口服时能有效运送硫酸软骨素安全通过胃肠道环境运送至小肠的粘液层被吸收，实现硫酸软骨素生物利用度的提高。因此，本发明提供的改性硫酸软骨素在肠道中的吸收性好，生物利用度高，为高吸收性硫酸软骨素。
本发明提供了以上技术方案所述改性硫酸软骨素的制备方法，过程简单，反应温和，制备使用的材料和溶剂均无毒，具有较好的环境效益，可应用于工厂化生产。
附图说明
图1为实施例中CS、LMCS与LMCS-X在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种改性硫酸软骨素，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构：
式Ⅰ中，X1为
式Ⅱ中，X2为
式Ⅰ和式Ⅱ中＊表示连接位点，n为3～7。
本发明提供的改性硫酸软骨素的结构包括小分子硫酸软骨素主结构(LWCS)和接枝在所述小分子硫酸软骨素主结构上的脂溶性疏水端(X)，其中脂溶性疏水端(X)来源于槲皮素、α-亚麻酸或烯醇型姜黄素。在本发明中，所述小分子硫酸软骨素主结构(LWCS)作为亲水端，在水中亲水端向外，脂溶性疏水端向内，自组装成胶束(LMCS-X胶束)，其在水中的溶解度高，能够有效将LMCS输送至小肠，实现生物利用度的提高。
本发明提供了以上技术方案所述改性硫酸软骨素的制备方法，包括以下步骤：
将脂溶性疏水化合物与二氯亚砜混合进行取代反应，得到酰氯化合物；所述脂溶性疏水化合物为槲皮素、α-亚麻酸或烯醇型姜黄素；
将所述酰氯化合物、小分子硫酸软骨素、催化剂和有机溶剂混合进行酯化反应，得到所述改性硫酸软骨素；所述小分子硫酸软骨素的分子量为1600～2200Da。
在本发明中，若无特别说明，所涉及原材料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将脂溶性疏水化合物与二氯亚砜(SOCl2)混合进行取代反应，得到酰氯化合物。在本发明中，所述脂溶性疏水化合物为槲皮素(Quercetin,QR)、α-亚麻酸(α-Linolenicacid,ALA)或烯醇型姜黄素(Curcumin,CUR)；所述脂溶性疏水化合物与二氯亚砜的用量比优选为20g:(50～100)mL，更优选为20g:50mL，本发明优选将脂溶性疏水化合物加入到二氯亚砜中进行取代反应。在本发明中，所述取代反应的温度优选为50～80℃，更优选为70℃，时间优选为0.5～2h，更优选为1h。
得到酰氯化合物后，本发明将所述酰氯化合物、小分子硫酸软骨素、催化剂和有机溶剂混合进行酯化反应，得到所述改性硫酸软骨素。在本发明中，所述小分子硫酸软骨素的分子量为1600～2200Da，优选为2000Da；所述小分子硫酸软骨素与脂溶性疏水化合物的质量比优选为1:(0.2～2)，更优选1:(0.3～1)，进一步优选为1:(0.5～0.8)，最优选为1:1。在本发明中，所述催化剂优选为二甲基氨基吡啶(DMAP)，所述催化剂与脂溶性疏水化合物的用量比优选为8～12mmol:20g，更优选为10mmol:20g。在本发明中，所述有机溶剂优选为甲酰胺，所述小分子硫酸软骨素的质量优选为小分子硫酸软骨素和有机溶剂质量之和的10～60％。本发明优选将小分子硫酸软骨素溶于有机溶剂，得到小分子硫酸软骨素溶液；将所述小分子硫酸软骨素溶液与酰氯化合物混合，得到混合液；在所述混合液中加入催化剂进行酯化反应。在本发明中，所述酯化反应的温度优选为40～70℃，更优选为45～55℃，时间优选为1～3h，更优选为2h；所述酯化反应优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的速率优选为100～200rpm。
所述酯化反应完成后，本发明优选将所得酯化反应液依次进行透析、醇沉、固液分离和固相干燥。在本发明中，所述透析采用的透析袋的截留分子量优选为2000Da，所述透析采用的透析介质为水，优选每6h换一次水，持续透析2天。在本发明中，所述醇沉采用的醇试剂优选为乙醇-水混合溶液，所述乙醇-水混合溶液中乙醇的体积分数优选为95％；所述醇试剂与所述透析所得浓缩液的体积比优选为3:1～5:1；所述醇沉的温度优选为4℃，时间优选为18～24h。本发明通过所述醇沉除去催化剂和多余的脂溶性疏水化合物。在本发明中，所述固液分离优选为离心分离，所述离心分离的转速优选为5000～8000rpm，更优选为5000rpm，时间优选为8～15min，更优选为10min。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的具体操作优选为：将固液分离所得固相加-4～4℃的水复溶，然后将所得混合液进行冷冻干燥；本发明将固液分离所得固相加-4～4℃的水复溶使固相均匀的分布于水中，使冷冻干燥后的成品更加疏松，无结块。所述干燥后，得到改性硫酸软骨素纯品(记为LMCS-X)。
在本发明中，当所述脂溶性疏水化合物为槲皮素时，所述改性硫酸软骨素(记为LMCS-QR)的合成路线如式A所示：
当所述脂溶性疏水化合物为α-亚麻酸时，所述改性硫酸软骨素(记为LMCS-ALA)的合成路线如式B所示：
当所述脂溶性疏水化合物为烯醇型姜黄素时，所述改性硫酸软骨素(记为LMCS-CUR)的合成路线如式C所示：
本发明还提供了一种药物组合物，包括药物活性成分和药学上可接受的辅料，所述药物活性成分为以上技术方案所述的改性硫酸软骨素或以上技术方案所述制备方法制备得到的改性硫酸软骨素。本发明对所述药学上可接受的辅料的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的辅料即可。在本发明中，所述药物组合物的剂型优选为口服制剂。
下面结合实施例对本发明提供的改性硫酸软骨素及其制备方法和药物组合物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将20gα-亚麻酸(ALA)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与α-亚麻酸的质量比1:2混合，加入10mmol二甲基氨基吡啶(DMAP)并在60℃下剧烈搅拌，反应2h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，然后5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-ALA聚合物，收率为83％。
实施例2
将20gα-亚麻酸(ALA)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与α-亚麻酸的质量比1:1混合，加入10mmolDMAP并在55℃下剧烈搅拌，反应2h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍反应体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，然后5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-ALA聚合物，收率为77％。
实施例3
将20gα-亚麻酸(ALA)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与α-亚麻酸的质量比1:1混合，加入10mmolDMAP并在40℃下剧烈搅拌，反应1h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-ALA聚合物，收率为70％。
实施例4
将20g槲皮素(QR)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与槲皮素的质量比1:0.5混合，加入10mmolDMAP并在50℃下剧烈搅拌，反应2h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-QR聚合物，收率为64％。
实施例5
将20g槲皮素(QR)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与槲皮素的质量比1:2混合，加入10mmolDMAP并在45℃下剧烈搅拌，反应2h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的95vol％乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-QR聚合物，收率为69％。
实施例6
将20g槲皮素(QR)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与槲皮素的质量比1:1混合，加入10mmolDMAP并在55℃下剧烈搅拌，反应1h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-QR聚合物，收率为92％。
实施例7
将20g烯醇型姜黄素(CUR)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与烯醇型姜黄素的质量比1:2混合，加入10mmolDMAP并在55℃下剧烈搅拌，反应2h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的95vol％乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-CUR聚合物，收率为89％。
实施例8
将20g烯醇型姜黄素(CUR)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素LMCS(分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与烯醇型姜黄素的质量比1:0.3混合，加入10mmolDMAP并在45℃下剧烈搅拌，反应0.5h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-CUR聚合物，收率为67％。
实施例9
将20g烯醇型姜黄素(CUR)中加入50mL二氯亚砜(SOCl2)，70℃反应1h，得到酰氯化合物，然后将其与小分子硫酸软骨素(LMCS，分子量为2000Da，溶于甲酰胺)按照小分子硫酸软骨素与烯醇型姜黄素的质量比1:0.8混合，加入10mmolDMAP并在70℃下剧烈搅拌，反应1h；将所得反应液利用2000Da透析袋透析，透析结束后，向透析浓缩液中加入三倍体积的乙醇-水溶液(乙醇95vol％)，4℃条件下冰箱过夜，5000rpm离心10min，取离心沉淀复溶于冷水中，冷冻干燥，得到改性硫酸软骨素，记为LMCS-CUR聚合物，收率为72％。
对实施例1、实施例6、实施例7制备的改性硫酸软骨素LMCS-ALA、LMCS-QR、LMCS-CUR进行生物利用度(大鼠体内生物利用度)的检测，并以小分子硫酸软骨素LMCS和硫酸软骨素CS原药进行对照，方法如下：
平均体重为180～200g的雄性SD大鼠在实验前禁食一夜，并自由饮水。将30只大鼠随机分为四组(n＝6)，将CS、LMCS、LMCS-QR、LMCS-ALA、LMCS-CUR溶液按照50mg/kg(按照原药计算)的给药剂量对大鼠进行灌胃。并在给药后的0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12和24h对麻醉的大鼠进行眼眶取血(600～800μL)。血样以3000×g离心10min后将上清液(血浆)转移到新的1.5mL离心管中，-20℃储存，备用。
样品用移液器精密吸取200μL血浆样品，加入1mL甲醇之后旋涡5min(除去蛋白)，超声20min。将样品用氮气吹干，并加入100μL甲醇复溶残渣后再次旋涡3min，超声10min。样品在10000rpm下离心10min，取上清，利用HPLC检测CS含量。计算12个时间点血药浓度。
实验结果为：
在本实验中给大鼠灌服CS、LMCS、LMCS-QR、LMCS-ALA、LMCS-CUR溶液，并在12个时间点(0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8和12、24h)采集血液样本并检测CS含量，将检测结果列于表1，并绘制血药浓度-时间曲线图，如图1所示。
表1口服CS、LMCS与LMCS-X后大鼠血浆中的血药浓度(μg/mL)
由表1和图1显示，LMCS-QR、LMCS-ALA、LMCS-CUR均在2～3h达到血药浓度最高值，分别为6.07±0.37μg/mL、7.26±0.37μg/mL和6.95±0.74μg/mL，远高于CS(2.43±0.37μg/mL)和LMCS(3.70±0.59μg/mL)。结果表明，LMCS-QR、LMCS-ALA、LMCS-CUR明显提高了原药(CS)在大鼠体内的血药浓度，说明改性硫酸软骨素LMCS-QR、LMCS-ALA、LMCS-CUR显著提高了生物利用度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种改性硫酸软骨素，其特征在于，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构：
式Ⅰ中，X1为
式Ⅱ中，X2为
式Ⅰ和式Ⅱ中n为3～7。
2.权利要求1所述改性硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脂溶性疏水化合物与二氯亚砜混合进行取代反应，得到酰氯化合物；所述脂溶性疏水化合物为槲皮素、α-亚麻酸或烯醇型姜黄素；
将所述酰氯化合物、小分子硫酸软骨素、催化剂和有机溶剂混合进行酯化反应，得到所述改性硫酸软骨素；所述小分子硫酸软骨素的分子量为1600～2200Da。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脂溶性疏水化合物与二氯亚砜的用量比为20g:(50～100)mL。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述取代反应的温度为50～80℃，时间为0.5～2h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述小分子硫酸软骨素与脂溶性疏水化合物的质量比为1:(0.2～2)；所述催化剂为二甲基氨基吡啶，所述催化剂与脂溶性疏水化合物的用量比为8～12mmol:20g；所述有机溶剂为甲酰胺。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述酯化反应的温度为40～70℃，时间为1～3h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酯化反应后，还包括将所得酯化反应液依次进行透析、醇沉、固液分离和固相干燥。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述透析采用的透析袋的截留分子量为2000Da；所述醇沉采用的醇试剂为乙醇-水混合溶液，所述乙醇-水混合溶液中乙醇的体积分数为95％。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括药物活性成分和药学上可接受的辅料，所述药物活性成分为权利要求1所述的改性硫酸软骨素或权利要求2～8任意一项所述制备方法制备得到的改性硫酸软骨素。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为口服制剂。
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