CN103341156A - 重组抗高血压肽肠溶纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN103341156A CN2013103031933A CN201310303193A CN103341156A CN 103341156 A CN103341156 A CN 103341156A CN 2013103031933 A CN2013103031933 A CN 2013103031933A CN 201310303193 A CN201310303193 A CN 201310303193A CN 103341156 A CN103341156 A CN 103341156A
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孙海燕
刘冬
从彦丽
李艳
周丽珍
唐旭蔚
杨剑
沈鸣
段友容
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Shenzhen Polytechnic
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重组抗高血压肽肠溶纳米粒及其制备方法与应用，涉及纳米材料。提供一种载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒及其制备方法与应用。所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒是以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸聚合物为载体，以重组抗高血压肽为模型药。所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒的制备方法包括复乳法、薄膜水化法、透析法、乳化蒸发法、界面沉淀法和自组装法等。所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒可在制备降压药物中应用。

Description

重组抗高血压肽肠溶纳米粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米材料，尤其是涉及一种载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒及其制备方法与应用，其中，载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，简称为VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL。
背景技术
血管紧张素转换酶抑制剂（angitotensin converting enzyme inhibitor，ACEI），通过抑制血管紧张素转换酶的活性降低血管紧张素II(agiotensin II)的合成，进而起到降压作用，目前已成为治疗高血压的一线药物。源于食品的降血压肽是一类与ACEI具有相同降压机制的多肽药物，其降血压效果显著且无毒副作用，因而是一种极具开发潜力的多肽类抗高血压药物（参见文献：Yamamoto N.,Masahiro E.and Seiichi M.Biogenic Peptides and TheirPotential Use.Curr Pharmaceut Des,2003,9:1345-1355；李世敏，刘冬，孙海燕，等.玉米活性多肽降血压作用及其机制的研究.营养学报，2007，29(2)：186-188）。刘冬等人在中国专利200910112189.2中公开一种降血压肽的制备方法，该专利公开了重组抗高血压肽（氨基酸序列为VLPVPR）低成本、大规模制备方法。但制备的重组抗高血压肽经口服给药后受胃肠道pH、酶和吸收率的影响，生物利用度很低，药效持续时间短，临床应用受到局限（孙海燕，方科伟，刘冬，李世敏.基因重组高效表达降血压肽对自发性高血压大鼠的急性降压效果.中华高血压杂志，2010，18（1）：91-94）。而结肠由于特殊的生理性质，成为蛋白质类口服吸收的重要部位。因此设计结肠定位释放的剂型对蛋白质类药物口服吸收具有重要意义。
近几十年来，以可生物降解的聚合物为载体的递送系统由于其独特的优势而备受国内外关注。将药物包裹在靶向递送载体可以有效地降低药物的毒副作用，提高药物的溶解性，增强药物的靶向性，改善治疗效果。许多像聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸等生物降解材料已经广泛的被用做药物和基因的递送载体，取得了一定的治疗效果。
段友容等人在中国专利200910247576.7中公开一种聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米递送系统、制备方法及其应用，该专利公开了mPEG-PLGA-PLL阳离子聚合物纳米粒递送系统的制备和其应用，聚合物制备的载体纳米粒可用于负载有机药物、水溶性药物、水不溶性抗癌药物或用于诊断用的显影剂等。
Eudragit是一类pH敏感包衣材料，分为肠溶和胃溶型，不同型号和厚度的包衣能使药剂达到不同的pH敏感释放性质，因此它在缓控释制剂中应用广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒及其制备方法，其中，载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，简称为VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL；mPEG具有长循环功效；PLGA具有可生物降解有缓控释功效；PLL侧链带有侧氨基基团，易于用靶向基团修饰。
本发明的第二目的是提供一种所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）聚合物的制备方法。
本发明的第三目的是提供一种载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL）在制备降压药物中的应用。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒是以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）聚合物为载体，以重组抗高血压肽（VLPVPR）为模型药。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒可采用Eudragit树脂为包衣材料。所述Eudragit树脂可采用Eudragit L100、Eudragit S100等中的至少一种，所述包衣材料与聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸聚合物的质量比可为（1～100）∶（1～50）。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒的粒径为10～2000nm，分子量可为1.5×103～9.5×106Da，优选为3×103～5×106Da；其中，所述聚合物中乳酸与羟基乙酸的摩尔比可为（1～80）∶（1～80），优选为（50～80）∶（2～50），例如乳酸和羟基乙酸摩尔比为50∶50、70∶30或80∶20等；羟基乙酸与赖氨酸的摩尔比可为（90～50）∶（10～50），优选为（50～70）∶（10～20），例如：羟基乙酸和赖氨酸摩尔比为70∶10、60∶10或50∶20；VLPVPR和mPEG-PLGA-PLL的摩尔比可为（1～60）∶（1～60），优选为（1～10）∶（10～60），例如VLPVPR和mPEG-PLGA-PLL的摩尔比为1∶15、1∶30或1∶50；所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒表面光滑，均匀度好，颗粒规则无粘连，再分散性好，载药量和包封率高。
所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）聚合物的制备方法如下：
（1）mPEG-PLGA的制备：抽真空加热干燥耐热玻璃管，加入丙交酯和乙交酯原料，再加入占原料总量质量百分比为1%～15%、分子量范围为350～5000的mPEG和催化剂，通氮气，加热溶解抽真空，冷却固化抽真空2h后封管，120～150℃反应8～50h；所述催化剂可选自辛酸亚锡、乳酸锌、SnCl2·2H2O、对甲苯磺酸等中的一种，所述mPEG与催化剂的摩尔比为（1～20）∶（1～20）；
（2）mPEG-PLGA-Boc(Z)的制备：在有机溶剂中和0～40℃下，mPEG-PLGA、Boc-Phe（eqv.）、N,N-二环己基碳二亚胺（eqv.）和4-二甲氨基吡啶反应1～3天；该反应推荐常压氮气保护；所述mPEG-PLGA、Boc-Phe（1～15eqv.）、N,N-二环己基碳二亚胺（1～15eqv.）和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶（1～15）∶（1～15）∶（1～15）；反应产物可以进行纯化，具体方法可采用过滤，碱洗水洗或透析，浓缩，加冰甲醇或冰乙醚沉淀出产物，过滤，真空干燥；所述Boc-Phe为Boc-苯丙氨酸；
（3）mPEG-PLGA-NH2的制备：在有机溶剂中和0℃下，将步骤（2）制得的mPEG-PLGA-Boc(Z)与三氟乙酸反应1～4h，反应推荐采用氮气保护，所述mPEG-PLGA-Boc(Z)与三氟乙酸的摩尔比为（1～50）∶（1～80）；产物纯化，旋蒸去除溶剂与未反应三氟乙酸，残渣溶于有机溶剂，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥；
（4）mPEG-PLGA-PZLL的制备：在有机溶剂中和室温下，PEG-PLGA-NH2和NCA反应1～5天，所述PEG-PLGA-NH2和NCA的摩尔比为1～60，反应推荐在氮气保护下进行；反应产物进一步纯化，具体方法可采用浓缩，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥；
（5）mPEG-PLGA-PLL的制备：在0℃下，mPEG-PLGA-PZLL、三氟乙酸和33%的HBr醋酸溶液反应0.5～8h，所述mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸为等摩尔，33%的HBr醋酸溶液占mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸的总体积的1%～50%；反应产物纯化，具体方法可采用冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。
本发明所述VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL肠溶纳米粒是由VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL纳米粒经过包衣制备的。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒的制备方法如下：
方法一：采用复乳法
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于溶剂中，加入含VLPVPR的水溶液，10～1000W和5s×1～5s×5的条件下进行超声乳化，再加入聚乙烯醇水分散介质，再次在10～1000W和5s×1～5s×3的条件下进行超声乳化，然后立即注入聚乙烯醇中，除去有机相，得载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒。
在方法一中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、溶剂、含VLPVPR的水溶液、聚乙烯醇水分散介质和聚乙烯醇的配比可为10～500mg∶0.2～1mL∶0.1～0.4mL∶2.2mL∶50mL，其中，聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸以质量计算，溶剂、含VLPVPR的水溶液、聚乙烯醇水分散介质和聚乙烯醇以体积计算；所述溶剂可选自二氯甲烷、丙酮等中的至少一种；所述含VLPVPR的水溶液中含有0.2～20mg VLPVPR；所述聚乙烯醇水分散介质的浓度可为0.01～10%（w/v）；所述聚乙烯醇的百分浓度为0.3%；所述除去有机相的条件是在室温下搅拌0.5～5h。
方法二：薄膜水化法
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于丙酮中，旋转蒸发成膜，随后加入含VLPVPR的水溶液，搅拌后得载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒。
在方法二中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、丙酮和含VLPVPR的水溶液的配比可为0～500mg∶0.4～2mL∶4～20mL，其中聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸以质量计算，丙酮和含VLPVPR的水溶液以体积计算；所述搅拌的时间可为0.5～6h。
方法三：透析法
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于二甲亚砜溶剂中，加入VLPVPR，再加入水中，将溶液装入透析袋中透析，除去有机溶剂，得载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒。
在方法三中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、二甲亚砜溶剂、VLPVPR、水的配比可为10～500mg∶0.2～1mL∶0.2～20mg∶2～10mL，其中聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸和VLPVPR以质量计算，二甲亚砜溶剂和水以体积计算；所述透析的时间可为3～72h；所述透析袋的截留分子量可为100～10000。
方法四：乳化蒸发法
取mPEG-PLGA-PLL溶于丙酮/二氯甲烷的混合溶剂中，加入含VLPVPR的聚乙烯醇（PVA）水分散介质中，超声或高压乳匀乳化，再除去乳液中的有机溶剂，即得载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒。
在方法四中，所述mPEG-PLGA-PLL、丙酮/二氯甲烷的混合溶剂、含VLPVPR的聚乙烯醇（PVA）水分散介质的配比可为10～500mg∶0.4～2mL∶2.2～44mL，其中，mPEG-PLGA-PLL以质量计算，丙酮/二氯甲烷的混合溶剂、含VLPVPR的聚乙烯醇（PVA）水分散介质以体积计算；所述含VLPVPR的聚乙烯醇（PVA）水分散介质中的VLPVPR含量为0.2～20mg，含VLPVPR的聚乙烯醇（PVA）水分散介质的浓度可为0.01%～10%（w/v）；所述除去乳液中的有机溶剂可采用搅拌的方法除去乳液中的有机溶剂，所述搅拌的时间可为2～4h。
方法五：界面沉淀法
取mPEG-PLGA-PLL溶于丙酮溶剂中，然后注入含VLPVPR的PVA水分散介质中，加压挥发去除丙酮，即得载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒。
在方法五中，所述mPEG-PLGA-PLL、丙酮、含VLPVPR的PVA水分散介质的配比可为10～500mg∶0.4～2mL∶2.2～44mL，其中，mPEG-PLGA-PLL以质量计算，丙酮、含VLPVPR的PVA水分散介质以体积计算；所述含VLPVPR的PVA水分散介质中VLPVPR的含量可为0.2～20mg，所述含VLPVPR的PVA水分散介质的百分浓度可为0.01%～10%（w/v）。
方法六：自组装法
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于水溶液中，加入VLPVPR，再加入水中，将溶液装入透析袋中透析，除去有机溶剂，即得载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒。
在方法六中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、水溶液、VLPVPR和水的配比可为10～500mg∶0.2～1mL∶0.2～20mg∶2～10mL，其中聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸和VLPVPR以质量计算，水溶液和水以体积计算；所述透析的时间可为3～72h，所述透析袋的截留分子量可为100～10000。
本发明所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒可在机械搅拌、超声、高压乳匀机作用下制得，其粒径在10～2000nm，表面光滑，均匀度好，颗粒规则无粘连，再分散性好，载药量和包封率高。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒可在制备降压药物中应用，所述降压药物包括静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂、皮内注射制剂、口服给药制剂或经皮给药制剂等，优选口服给药制剂，所述口服给药制剂可采用胶囊剂、片制剂、丸剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂或膜剂等。
本发明所述包衣方法为界面沉淀法，取mPEG-PLGA-PLL纳米粒溶液，在搅拌下滴入1mg/mL的Eudragit树脂的无水乙醇溶液，搅拌0.5～5h除去乙醇，或减压除去乙醇，即得肠溶纳米粒溶液。mPEG-PLGA-PLL与Eudragit树脂质量比为（1～100）∶（1～50）。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒可以制备成冻干剂，所述冻干剂的支架剂包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇或聚乙二醇等，冻干支架剂的含量为冻干剂的0.01%～20%（w/v）。
所述载重组抗高血压肽（VLPVPR）的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）纳米粒作为降压药物，具有可生物降解、缓控释、pH敏感性、结肠靶向、运送活性物质、降压等作用。
本发明所要解决的技术问题在于如何有效地将VLPVPR包裹在制备的聚合物载体中，使之能够有效地递送到结肠，从而最大限度地发挥药物的疗效。
本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备具有可生物降解、缓控释、运送活性物质、降压的药物，尤其是制备抗肠癌的药物。采用本发明的方法获得的降压的药物适合于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服或经皮给药等方式。
本发明以mPEG-PLGA-PLL为材料，包裹重组抗高血压肽，形成纳米粒，再在此纳米粒外层用肠溶型Eudragit为包衣，使其带有pH敏感性。口服后在胃和小肠上部，由于包衣的存在，药物不释放，避免被降解；到达结肠后，包衣材料在结肠的pH条件下溶解，纳米粒中的药物迅速释放出来并被吸收，达到治疗的效果。
附图说明
图1为VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL缓释纳米粒粒径分布图（Nicomp-380ZLS粒度测定仪，美国Particle Sizing Systems公司）。在图1中，横坐标为粒径（nm），纵坐标为强度。
图2为VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL缓释纳米粒口服给药高血压大鼠降血压效果。在图2中，横坐标为口服给药后时间（h），纵坐标为动脉血压（mmhg）；标记◆为空白对照，■为VLPVPR原药（800μg/kg），▲为纳米粒（3.25mg/kg）,●为纳米粒（6.5mg/kg）,■为纳米粒（13mg/kg）。
具体实施方式
下面以实施例对本发明加以进一步的说明，但是不限制本发明的内容。
实施例1、聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL）的制备
（1）mPEG-PLGA的制备：抽真空加热干燥耐热玻璃管，加入一定摩尔质量比的丙交酯和乙交酯原料（比例为8∶2、7∶3或5∶5），加入占原料总量质量百分比为1%～15%、分子量范围为350～5000的PEG，再加入催化剂，通氮气，加热溶解抽真空，冷却固化抽真空2h后封管，120～150℃反应8～50h。
（2）mPEG-PLGA-Boc(Z)的制备：一定量mPEG-PLGA溶于干燥有机溶剂，搅拌加入Boc-Phe（1～15eqv.）、N,N-二环己基碳二亚胺（1～15eqv.），0～40℃缓慢滴加4-二甲氨基吡啶，氮气保护，室温搅拌1～3天，过滤，碱洗水洗（或透析），浓缩，加冰甲醇或冰乙醚沉淀出产物，过滤，真空干燥。
（3）mPEG-PLGA-NH2的制备：取mPEG-PLGA-Boc(Z)溶于干燥有机溶剂中，氮气保护，0℃搅拌滴加干燥的三氟乙酸，滴加10～60min，继续反应1～3h，旋蒸去除溶剂与未反应三氟乙酸，残渣溶于有机溶剂，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。
（4）mPEG-PLGA-PZLL的制备：取PEG-PLGA-NH2溶于干燥有机溶剂中，加入NCA（1～60eqv.），氮气保护，室温反应1～5天，浓缩，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。
（5）mPEG-PLGA-PLL的制备：取mPEG-PLGA-PZLL溶于定量三氟乙酸中，加入少量体积分数为33%的HBr醋酸溶液，0℃反应0.5～8h，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。
实施例2、包载重组抗高血压肽(VLPVPR)药物的mPEG-PLGA-PLL纳米粒的制备
采用复乳法制备，取4mg或100mg材料mPEG-PLGA-PLL溶于200μl或1000μl二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂中，加入0.2mg或7.5mg VLPVPR水溶液，超声乳化（200W，5s×5），再加入2.2mL浓度为0.5%或1%的PVA水分散介质中，再次超声乳化（200W，5s×2），在搅拌下立即注入50mL0.3%的PVA溶液中。然后室温下搅拌0.5～5h除去有机相，即得粒径为50～600nm的纳米粒溶液。
采用薄膜乳化法制备,取4mg或100mg材料mPEG-PLGA-PLL溶于400μl或2000μl丙酮溶剂中，旋转蒸发成膜，随后加入含0.2mg或7.5mg VLPVPR的4mL或20mL的水溶液，室温下搅拌0.5～6h，即得粒径为50～600nm的纳米粒溶液。
采用透析法制备，取4mg或100mg材料mPEG-PLGA-PLL溶于200μl或1000μl二甲亚砜溶剂中，加入0.4mg或者6mg VLPVPR药物，将搅拌均匀的溶液在搅拌的条件下滴入2mL或10mL水中，之后将溶液装入透析袋（截留分子量为7000）中透析3～72h，除去有机溶剂，即得粒径为50～600nm的纳米粒溶液。
采用乳化蒸发法制备，取4mg或20mg材料mPEG-PLGA-PLL溶于400μl或2000μl丙酮/二氯甲烷的混合溶剂中，加入2.2mL或44mL、含0.2mg或4mg VLPVPR、浓度为0.5%或2%的含聚乙烯醇（PVA）的水分散介质中，超声或高压乳匀乳化，乳液在室温下搅拌2～4h，挥尽有机溶剂，即得粒径为50～600nm的纳米粒溶液。
采用界面沉淀法制备，取4mg或100mg材料mPEG-PLGA-PLL溶于400μl或2000μl丙酮溶剂中，在不断的搅拌条件下，将上述溶液注入2.2mL或44mL、含0.2mg或4mgVLPVPR、浓度为0.5%或2%的PVA水分散介质中，加压挥发去除丙酮，即得粒径为50～600nm的纳米粒溶液液。
采用自组装法制备，取4mg或100mg材料mPEG-PLGA-PLL溶于200μl或1000μl水溶液中，加入0.4mg或8mg VLPVPR药物，将搅拌均匀的溶液在搅拌的条件下滴入2mL或者10mL水中，之后将溶液装入透析袋（截留分子量为3000或7000）中透析3～72h，除去有机溶剂；即得粒径为50～600nm的纳米粒溶液。
实施例3、包载重组抗高血压肽(VLPVPR)药物的mPEG-PLGA-PLL肠溶纳米粒的制备
采用界面沉淀法制备，取实施例2中纳米粒溶液，在搅拌下滴入1mg/mL的Eudragit S100无水乙醇溶液，在室温下搅拌0.5～5h除去乙醇，或减压除去乙醇；冻干，即得肠溶纳米粒溶液。
同时还可将包载重组抗高血压肽药物的纳米递送载体制备成不同类型的胶囊剂、片制剂、丸剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂和膜剂等。
实施例4、包载重组抗高血压肽(VLPVPR)药物的mPEG-PLGA-PLL纳米粒的口服降压作用
采用无创伤性大鼠尾动脉血压测量法，取实施例3中制备的肠溶纳米粒溶液，分别溶于水制成高(13mg/kg)、中(6.5mg/kg)、低(3.25mg/kg)三个剂量（分别相当于原药VLPVPR800、400和200μg/kg）。
采用口服给药的方式，分别给予按体质量和血压均衡分组的自发性高血压大鼠（SHR）包载重组抗高血压肽(VLPVPR)药物的mPEG-PLGA-PLL纳米粒。实验分为空白对照组、VLPVPR原药组、mPEG-PLGA-PLL纳米粒高、中、低剂量组。结果显示，大鼠口服VLPVPR原药后2h，血压降至最低点（和空白对照组相比，P<0.01），之后血压开始回升，至给药后8h，和空白组相比已无明显差异（P>0.05）。大鼠口服mPEG-PLGA-PLL纳米粒高、中剂量2h后，SHR血压开始明显降低（和空白对照组相比，P<0.05），至给药后6h药效达到最高（和空白对照组相比，P<0.01），且可以持续30h（和空白对照组相比，P<0.05）。和VLPVPR原药药效维持6h相比，具有显著的缓释效果。
VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL缓释纳米粒粒径分布图（Nicomp-380ZLS粒度测定仪，美国Particle Sizing Systems公司）参见图1。VLPVPR-mPEG-PLGA-PLL缓释纳米粒口服给药高血压大鼠降血压效果参见图2。

Claims (10)

1.载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，其特征在于以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸聚合物为载体，以重组抗高血压肽为模型药。
2.如权利要求1所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，其特征在于采用Eudragit树脂为包衣材料；所述Eudragit树脂可采用Eudragit L100、Eudragit S100中的至少一种；所述包衣材料与聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸聚合物的质量比可为（1～100）∶（1～50）。
3.如权利要求1所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，其特征在于其粒径为10～2000nm，分子量可为1.5×103～9.5×106Da，优选为3×103～5×106Da。
4.如权利要求1所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，其特征在于所述聚合物中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为（1～80）∶（1～80），优选为（50～80）∶（2～50）；羟基乙酸与赖氨酸的摩尔比为（90～50）∶（10～50），优选为（50～70）∶（10～20）；VLPVPR和mPEG-PLGA-PLL的摩尔比为（1～60）∶（1～60），优选为（1～10）∶（10～60）。
5.如权利要求1所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，其特征在于所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸聚合物的制备方法如下：
（1）mPEG-PLGA的制备：抽真空加热干燥耐热玻璃管，加入丙交酯和乙交酯原料，再加入占原料总量质量百分比为1%～15%、分子量范围为350～5000的mPEG和催化剂，通氮气，加热溶解抽真空，冷却固化抽真空2h后封管，120～150℃反应8～50h；所述催化剂可选自辛酸亚锡、乳酸锌、SnCl2·2H2O、对甲苯磺酸等中的一种，所述mPEG与催化剂的摩尔比为（1～20）∶（1～20）；
（2）mPEG-PLGA-Boc(Z)的制备：在有机溶剂中和0～40℃下，mPEG-PLGA、Boc-Phe（eqv.）、N,N-二环己基碳二亚胺（eqv.）和4-二甲氨基吡啶反应1～3天；该反应推荐常压氮气保护；所述mPEG-PLGA、Boc-Phe（1～15eqv.）、N,N-二环己基碳二亚胺（1～15eqv.）和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶（1～15）∶（1～15）∶（1～15）；反应产物可以进行纯化，具体方法可采用过滤，碱洗水洗或透析，浓缩，加冰甲醇或冰乙醚沉淀出产物，过滤，真空干燥；所述Boc-Phe为Boc-苯丙氨酸；
（3）mPEG-PLGA-NH2的制备：在有机溶剂中和0℃下，将步骤（2）制得的mPEG-PLGA-Boc(Z)与三氟乙酸反应1～4h，反应推荐采用氮气保护，所述mPEG-PLGA-Boc(Z)与三氟乙酸的摩尔比为（1～50）∶（1～80）；产物纯化，旋蒸去除溶剂与未反应三氟乙酸，残渣溶于有机溶剂，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥；
（4）mPEG-PLGA-PZLL的制备：在有机溶剂中和室温下，PEG-PLGA-NH2和NCA反应1～5天，所述PEG-PLGA-NH2和NCA的摩尔比为1～60，反应推荐在氮气保护下进行；反应产物进一步纯化，具体方法可采用浓缩，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥；
（5）mPEG-PLGA-PLL的制备：在0℃下，mPEG-PLGA-PZLL、三氟乙酸和33%的HBr醋酸溶液反应0.5～8h，所述mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸为等摩尔，33%的HBr醋酸溶液占mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸的总体积的1%～50%；反应产物纯化，具体方法可采用冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。
6.如权利要求1所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒的制备方法，其特征在于采用复乳法、薄膜水化法、透析法、乳化蒸发法、界面沉淀法、自组装法中的一种；
所述复乳法的具体步骤如下：
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于溶剂中，加入含VLPVPR的水溶液，10～1000W和5s×1～5s×5的条件下进行超声乳化，再加入聚乙烯醇水分散介质，再次在10～1000W和5s×1～5s×3的条件下进行超声乳化，然后立即注入聚乙烯醇中，除去有机相，得载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒；
所述薄膜水化法的具体步骤如下：
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于丙酮中，旋转蒸发成膜，随后加入含VLPVPR的水溶液，搅拌后得载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒；
所述透析法的具体步骤如下：
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于二甲亚砜溶剂中，加入VLPVPR，再加入水中，将溶液装入透析袋中透析，除去有机溶剂，得载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒；
所述乳化蒸发法的具体步骤如下：
取mPEG-PLGA-PLL溶于丙酮/二氯甲烷的混合溶剂中，加入含VLPVPR的聚乙烯醇水分散介质中，超声或高压乳匀乳化，再除去乳液中的有机溶剂，即得载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒；
所述界面沉淀法的具体步骤如下：
取mPEG-PLGA-PLL溶于丙酮溶剂中，然后注入含VLPVPR的PVA水分散介质中，加压挥发去除丙酮，即得载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒；
所述自组装法的具体步骤如下：
取聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于水溶液中，加入VLPVPR，再加入水中，将溶液装入透析袋中透析，除去有机溶剂，即得载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒。
7.如权利要求6所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒的制备方法，其特征在于，
所述复乳法中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、溶剂、含VLPVPR的水溶液、聚乙烯醇水分散介质和聚乙烯醇的配比可为10～500mg∶0.2～1mL∶0.1～0.4mL∶2.2mL∶50mL，其中，聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸以质量计算，溶剂、含VLPVPR的水溶液、聚乙烯醇水分散介质和聚乙烯醇以体积计算；所述溶剂可选自二氯甲烷、丙酮等中的至少一种；所述含VLPVPR的水溶液中含有0.2～20mg VLPVPR；所述聚乙烯醇水分散介质的浓度可为0.01w/v%～10w/v%；所述聚乙烯醇的百分浓度为0.3%；所述除去有机相的条件是在室温下搅拌0.5～5h；
在薄膜水化法中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、丙酮和含VLPVPR的水溶液的配比可为0～500mg∶0.4～2mL∶4～20mL，其中聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸以质量计算，丙酮和含VLPVPR的水溶液以体积计算；所述搅拌的时间可为0.5～6h；
在透析法中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、二甲亚砜溶剂、VLPVPR、水的配比可为10～500mg∶0.2～1mL∶0.2～20mg∶2～10mL，其中聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸和VLPVPR以质量计算，二甲亚砜溶剂和水以体积计算；所述透析的时间可为3～72h；所述透析袋的截留分子量可为100～10000；
在乳化蒸发法中，所述mPEG-PLGA-PLL、丙酮/二氯甲烷的混合溶剂、含VLPVPR的聚乙烯醇水分散介质的配比可为10～500mg∶0.4～2mL∶2.2～44mL，其中，mPEG-PLGA-PLL以质量计算，丙酮/二氯甲烷的混合溶剂、含VLPVPR的聚乙烯醇水分散介质以体积计算；所述含VLPVPR的聚乙烯醇水分散介质中的VLPVPR含量为0.2～20mg，含VLPVPR的聚乙烯醇（PVA）水分散介质的浓度可为0.01%w/v～10%w/v；所述除去乳液中的有机溶剂可采用搅拌的方法除去乳液中的有机溶剂，所述搅拌的时间为2～4h；
在界面沉淀法中，所述mPEG-PLGA-PLL、丙酮、含VLPVPR的PVA水分散介质的配比可为10～500mg∶0.4～2mL∶2.2～44mL，其中，mPEG-PLGA-PLL以质量计算，丙酮、含VLPVPR的PVA水分散介质以体积计算；所述含VLPVPR的PVA水分散介质中VLPVPR的含量可为0.2～20mg，所述含VLPVPR的PVA水分散介质的百分浓度可为0.01w/v%～10w/v%；
在自组装法中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸、水溶液、VLPVPR和水的配比可为10～500mg∶0.2～1mL∶0.2～20mg∶2～10mL，其中聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸和VLPVPR以质量计算，水溶液和水以体积计算；所述透析的时间可为3～72h，所述透析袋的截留分子量可为100～10000。
8.如权利要求1所述载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒在制备降压药物中应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述降压药物包括静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂、皮内注射制剂、口服给药制剂或经皮给药制剂，优选口服给药制剂，所述口服给药制剂可采用胶囊剂、片制剂、丸剂、散剂、颗粒剂、滴丸剂或膜剂。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述降压药物采用冻干剂，所述冻干剂的支架剂包括海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇或聚乙二醇，冻干支架剂的含量可为冻干剂的0.01w/v%～20w/v%。
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