CN105802981A - 基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒及其制备与应用 - Google Patents

基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域和生物工程技术领域，具体涉及一种基于聚乙二醇‑聚乳酸羟基乙醇酸‑聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒及其制备与应用。本发明的复合纳米材料包载的重组质粒为mPPP‑pSNAV2‑TGFβ1‑IRES‑TIMP1(PSTIT)，本发明还提供PSTIT的制备方法，以及在制备靶向治疗糖尿病足(DF)药物、糖尿病患者因周围神经病变(DPN)药物中的应用。本发明提出了DPN治疗的新靶点，并通过细胞实验、动物实验，证明本发明的PSTIT可以通过上调Bcl‑2蛋白，下调Caspase‑3、Bax蛋白的表达有效地减轻糖尿病神经病变大鼠神经细胞的凋亡，延缓DNP的进展。

Description

基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒 及其制备与应用
技术领域：
本发明涉及医药技术领域和生物工程技术领域，具体涉及一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒及其制备与应用。
背景技术：
糖尿病足(diabetic foot，DF)，足部是糖尿病这个多系统疾病的一个复杂的靶器官。糖尿病患者因周围神经病变(diabetic neuropathy，DPN)与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。如果积极治疗不能充分解决下肢出现的症状和并发症，则会造成灾难性的后果。临床上，对糖尿病足的治疗主要集中在溃疡的治疗、感染的治疗，以及Charcot关节病的治疗。糖尿病足的预防目前还是通过积极控制血糖从根本上降低糖尿病足的发病风险。
近年来研究显示，神经脱髓鞘改变是引发疼痛和感觉减退症状，导致糖尿病足发生的重要原因，但其发病机制尚不清楚(Malik RA.Pathology ofhuman diabetic neuropathy.Handbook of clinical neurology 2014；126:249-59.)。
本发明人所在的课题组前期研究中发现，DPN患者和糖尿病大鼠坐骨神经均存在显著脱髓鞘病理改变和CD8+T细胞浸润，与既往研究报道相符。在上海市科委基金的资助下，本发明人所在的课题组通过质谱技术对DPN患者外周血CD8+T细胞蛋白质表达进行了检测，结合分子生物学方法证实，高糖可激活CD8+T细胞p38MAPK信号通路，诱导趋化因子受体CXCR3显著高表达，同时诱导周围神经组织中神经膜细胞(SCs)趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11表达水平显著升高。进而，通过对体外高糖共培养体系SCs进一步验证，CD8+T细胞可MHCⅠ类限制髓鞘碱性蛋白(MBP)诱导分化为特异性细胞毒性T细胞(CTL)，进而受SCs趋化迁移至周围神经组织，并诱导SCs发生凋亡。研究结果发表在Cell Physiol Biochem及国内核心期刊(Tang W,Lv Q,Chen XF,Zou JJ,Liu ZM,Shi YQ.CD8(+)Tcell-mediated cytotoxicity toward Schwann cells promotes diabetic peripheralneuropathy.Cellular physiology and biochemistry:international journal ofexperimental cellular physiology,biochemistry,and pharmacology 2013；32(4):827-37.；汤玮,闾倩,梁翠,et al.高糖激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导CD8～+T淋巴细胞表达辅助性T淋巴细胞1型趋化因子受体3.上海医学2013；(5):438-41.)。本发明人的前期成果明确了高糖环境下SCs与CD8+T细胞间的相互影响，提出了两者在DPN中致病的作用和机制，对进一步阐明DPN的发病机制和寻找有效的治疗靶点有指导意义。
靶向治疗是现在疾病治疗领域的突破性和革命性的发展方向，其中分子靶向是靶向治疗中特异性最高的病因治疗。随着对机体分子生物学的深入了解，DNA重组技术、计算机控制的生产工艺和纯化等技术发展，分子靶向治疗新药研究进程大大加速，并取得了极好的社会与经济效益。
新型靶向纳米微泡造影剂以其分子小、穿透力强的突出特性，可穿越血管内皮间隙，到达细胞外基质。大大提高超声对血管外病变的诊断治疗能力，成为近年来研究的热点。研究证明利用聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL，mPPP)阳离子纳米载体进行前列腺癌基因转染，可提高前列腺PC-3细胞转染率；用于视网膜组织基因转染中，可提高体内视网膜组织转染率。三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL是一种新型纳米载体，它是一种阳离子共聚物，PLL用于增加纳米粒子的正电性，通过静电相互作用有效包裹目的基因，起到保护递送的作用；mPEG增强共聚物的亲水性和组织相容性，提高载体稳定性，起到延长保护作用；载体材料中的PLGA是一种经典的可控缓释材料,通过调节各嵌段比及分子量大小等因素调节降解速度，mPEG-PLGA-PLL材料的生物可降解性降低了载体材料的细胞毒性。
目前，mPPP在心血管疾病的应用主要集中在心肌缺血方面。在动脉粥样硬化斑块方面，国内有报道，运用超声造影剂观察和评价易损斑块内的新生血管(熊莉,邓又斌.超声造影评价颈动脉易损斑块内新生血管.中华超声影像学杂志2008；17(4):990-3.)；国外有报道，制备双靶向磷脂微泡，将血管细胞黏附分子-1和P-选择素结合到微泡上，观察微泡在目的基因的显影(Jadeja RN,Thouaojam MC,Sankhari JM,Jain M,Devkar RV,Ramachandran AV.Standardized flavonoid-rich Eugenia jambolana seed extractretards in vitro and in vivo LDL oxidation and expression of VCAM-1 andP-selectin in atherogenic rats.Cardiovascular toxicology 2012；12(1):73-82.)。但用于治疗方面，报道很少。中国专利申请CN201310303193.3公开了一种重组抗高血压肽肠溶纳米粒，是一种载重组抗高血压肽的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒，用于制备降压药物(公开号为CN103341156A)。
目前尚无有关用mPPP复合纳米材料包载重组质粒靶向治疗DNP的文献报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，本发明的另一目的在于提供上述mPPP复合纳米材料包载的重组质粒的制备方法，本发明的另一目的在于提供上述mPPP复合纳米材料包载的重组质粒在靶向基因治疗糖尿病足中的应用。
本发明人所在的课题组拟在前期研究成果的基础上，采用内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites，IRES)把CXCR3和CXCL9联合构建于rAAV质粒上，再制成包含靶向基因的mPPP纳米材料，进而研究其临床应用前景。
本发明的技术方案是：
将CXCR3(NW_007906068.1)、CXCL9(NW_007905978.1)联合方式构建于rAAV质粒上，转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR扩增,结果是CXCR3和CXCL9联合构建的重组质粒可以得到两条基因带。
然后，再用聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸(mPPP)复合纳米材料来包载构建好的重组质粒，为了评价复合物mPPP-pSNAV2-TGFβ1-IRES-TIMP1(PSTIT)对于细胞毒性的影响，本文采用MTT法对转染后的sCS细胞进行相对活力检测可以靶向基因治疗DNP。
PLL用于增加纳米粒子的正电性，通过静电相互作用有效包裹目的基因，起到保护递送的作用；mPEG增强共聚物的亲水性和组织相容性，提高载体稳定性，起到延长保护作用；载体材料中的PLGA是一种经典的可控缓释材料,通过调节各嵌段比及分子量大小等因素调节降解速度，mPEG-PLGA-PLL材料的生物可降解性降低了载体材料的细胞毒性。
本发明的第一方面，提供一种纳米制剂(纳米粒)，、是一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒。
所述的重组质粒，包含IRES基因序列、CXCR3基因序列和CXCL9基因序列。
所述的质粒载体为pBR322、pUC118等，优选为rAAV质粒。
所述的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料与所述的重组质粒的D/P值为1--15(优选为3)。
其中N代表纳米材料中氨基基团摩尔数，P代表DNA中磷酸基团摩尔数(1μg DNA约含3nmol磷酸基团)。
本发明的重组质粒为pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9。
本发明的纳米制剂称为mPPP-pSNAV2-TGFβ1-IRES-TIMP1(PSTIT)。
本发明的第二方面，提供上述的mPPP复合纳米材料包载的重组质粒的制备方法。
所述的制备方法包括如下步骤：
A、pIRES-CXCL9的构建
将含CXCL9的pCXCL9 N1质粒用Sal和Not双酶切低熔点胶分离并回收CXCL9片段，克隆入已行相应酶切Sal、Not的pIRES的B多克隆位点中构建成pIRES-CXCL9质粒；
B、pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9的构建
以含cMyc标签序列的pSNAV2 cMyc质粒为模版，设计引物如下：
5’-ACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:1)，PCR扩增条件为94℃4min 94℃30s 60℃30s 72℃10s共30个循环，扩增产物采用Nhe和Xho双酶切低容点胶分离并回收cMyc片段，定向克隆入已行相应酶切Nhe、Xho的表达载体pIRES CXCL9的多克隆位点中，从而得到pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9载体；
C、mPPP复合纳米材料包载pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9
按照D/P值为1--15(优选为3)，将mPPP复合纳米材料等体积稀释后缓慢滴加至DNA(重组质粒)稀释液中，充分混匀后室温静置10-60分钟。
本发明的第三方面，提供上述的mPPP复合纳米材料包载的重组质粒在制备靶向治疗糖尿病足(DF)药物、糖尿病患者因周围神经病变(DPN)药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提出了DPN治疗的新靶点，并结合纳米材料、rAVV介导的基因治疗在DNP中实属首创。本发明通过细胞实验、动物实验，证明本发明构建的PSTIT可以通过上调Bcl-2蛋白，下调Caspase-3、Bax蛋白的表达有效地减轻糖尿病神经病变大鼠神经细胞的凋亡，延缓DNP的进展。
本发明为DF、DPN治疗提供了新的临床手段。
本发明也获得了以下基金资助：(1)基金号：81170728，miR-143靶向调控TSHR基因促进甲状腺相关性眼病发病的机制研究，国家自然基金面上项目；(2)基金号：81300672，CD8+细胞毒性T细胞诱导神经膜细胞凋亡致糖尿病周围神经病变的作用与机制，国家自然科学基金青年项目；(3)基金号：14QB1403000，纳米材料介导CXCR3趋化因子多靶点基因载体的构建及在治疗糖尿病周围神经病变中的应用，上海市科技人才计划项目启明星。
附图说明：
图1为pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9的CXCR3和CXCL9基因酶切鉴定；
图2为分子的粒径(a,其中a1是mPPP，a2是PSTIT)、Zeta电位(b)和透射电镜观测结果(c,其中c1和c2是mPPP，c3和c4是PSTIT)；
图3为mPPP和PSTIT细胞活力检测；
图4为对照组、糖尿病对照组和PSTIT组大鼠坐骨神经凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3表达的变化的Western-blot结果。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9的构建
1.采用分子克隆的方法，以内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysites，IRES)序列连接CXCR3和CXCL9联合克隆到rAAV表达质粒pSNAV2.0，构建重组质粒pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9并检测重组质粒的活性。
①pIRES-CXCL9的构建
将含CXCL9的pCXCL9 N1质粒(购自prospec，CHM-333)用Sal和Not双酶切低熔点胶分离并回收CXCL9片段，克隆入已行相应酶切Sal、Not的pIRES(购自Clontech，631605)的B多克隆位点中构建成pIRES-CXCL9质粒。
②pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9的构建
以含cMyc标签序列的pSNAV2 cMyc质粒(购自Invitrogen，VPI0017)为模版，设计引物如下：
5’-ACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:1)，PCR扩增条件为94℃4min 94℃30s 60℃30s 72℃10s共30个循环，扩增产物采用Nhe和Xho双酶切低容点胶分离并回收cMyc片段，定向克隆入已行相应酶切Nhe、Xho的表达载体pIRES CXCL9的多克隆位点中，从而得到pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9载体。
图1证明pIRES-CXCL9构建成功，pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9构建成功。
实施例2：mPPP复合纳米材料包载pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9(mPPP-pSNAV2-TGFβ1-IRES-TIMP1,PSTIT)。
将1.0g的mPPP复合纳米材料在PBS中分散，调节pH至7.2，用0.22μm的Millipore膜过滤除菌后在4℃保存备用。然后将1.5g的pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9用PBS(pH＝7.2)配制成50μL(24孔板)或者25μL(96孔板)的DNA稀释液。按照D/P值为3，将mPPP复合纳米材料等体积稀释后缓慢滴加至DNA稀释液中，充分混匀后室温静置30分钟，可用于表征或细胞转染实验。其中N代表纳米材料中氨基基团摩尔数，P代表DNA中磷酸基团摩尔数(1μg DNA约含3nmol磷酸基团)。细胞表征实验，用90Plus Zeta型Zeta电位及粒度分析仪检测，结果如图2所示，PSTIT的粒径为230±5nm(图2a)。Zeta电位为181±10nm(图2b)。
透射电镜检测表明mPPP和PSTIT均为球形，mPPP平均分子粒径为150nm，PSTIT为220nm(图2c)。
实施例3：体外实验，培养sCS细胞，检测复合纳米材料的疗效；
为了评价复合物mPPP-pSNAV2-TGFβ1-IRES-TIMP1,PSTIT)对于细胞毒性的影响，本发明采用MTT法对转染后的sCS细胞进行相对活力检测(MTT法，见吕秋军主编《新药药理学研究方法》，2007：242-243)。
mPPP和PSTIT细胞活力检测结果如图3所示，mPPP和PSTIT的均无明显细胞毒性，可见纳米粒表面PEG链段可以很好的屏蔽过量的正电荷，从而大大降低细胞毒性。在所测试N/P比条件下，空白聚合物纳米粒mPPP基本不会对细胞产生毒性，而PSTIT在高N/P条件下细胞毒性比较明显。
实施例4：动物实验，构建DM及DPN小鼠模型为研究对象，探讨坐骨神经局部注射多靶点小分子药物对糖尿病周围神经病理与功能改变的影响。
DM及DPN小鼠模型的构建方法如下：20只8周龄Wistar雄性大鼠，体重180—200g，适应性喂养1周,禁食24h后，模型组按60mg/kg剂量腹腔注射STZ(购自美国sigma公司，S0130),浓度为1％，溶解于pH值为4.5的柠檬酸－二水合柠檬酸纳缓冲液中。STZ注射48h后,尾静脉取血测定血糖。成模和8周后分别采用von Frey丝测定大鼠缩足反应阈值，缩足反应阈值下降较基础值超过两个von Frey标号，即认为DPN大鼠。
SD大鼠随机分为对照组、DPN对照组和PSTIT组，各10只，DPN对照组和PSTIT组按照以上方法制备DPN模型。
PSTIT组予以坐骨神经局部注射PSTIT，两对照组均注射同等量PBS，Western-blot检测坐骨神经凋亡相关蛋白表达。
检测结果如图4所示，各组大鼠坐骨神经凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3表达的变化。Western-blot结果显示：与对照组相比，糖尿病对照组和PSTIT组大鼠坐骨神经的Bax、Bcl-2蛋白表达增强(P<0.05)；与DPN对照组相比，PSTIT组大鼠坐骨神经的Bax、Caspase-3的表达增加，Bcl-2表达减弱(P<0.05)。
以上实验结果说明PSTIT可以通过上调Bcl-2蛋白，下调Caspase-3、Bax蛋白的表达有效地减轻糖尿病神经病变大鼠神经细胞的凋亡，延缓DNP的进展。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒包含IRES基因序列、CXCR3基因序列和CXCL9基因序列。
2.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，所述的载体质粒为rAAV质粒。
3.根据权利要求1或2所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料与重组质粒的D/P值为1～15。
4.根据权利要求1或2所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒，其特征在于，聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料与重组质粒的D/P值为3。
5.如权利要求1所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
A、pIRES-CXCL9的构建
将含CXCL9的pCXCL9 N1质粒用Sal和Not双酶切低熔点胶分离并回收CXCL9片段，克隆入已行相应酶切Sal、Not的pIRES的B多克隆位点中构建成pIRES-CXCL9质粒；
B、pSNAV2-CXCR3-pIRES-CXCL9的构建
以含cMyc标签序列的pSNAV2 cMyc质粒为模版，设计合成引物如SEQ ID NO:1所示，PCR扩增条件为94℃4min 94℃30s 60℃30s 72℃10s共30个循环，扩增产物采用Nhe和Xho双酶切低容点胶分离并回收cMyc片段，定向克隆入已行相应酶切Nhe、Xho的表达载体pIRES CXCL9的多克隆位点中，从而得到pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9载体；
C、mPPP复合纳米材料包载pSNAV2-CXCR3-IRES-CXCL9
按照D/P值为1～15，将mPPP复合纳米材料等体积稀释后缓慢滴加至重组质粒稀释液中，充分混匀后室温静置10-60分钟。
6.如权利要求1至4任一项所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒在制备治疗糖尿病足药物中的应用。
7.如权利要求1至4任一项所述的基于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸复合纳米材料包载的重组质粒在制备治疗糖尿病患者因周围神经病变药物中的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732723A (zh) * 2009-12-30 2010-06-16 上海市肿瘤研究所 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米递送系统、制备方法及其应用
CN103341156A (zh) * 2013-07-18 2013-10-09 深圳职业技术学院 重组抗高血压肽肠溶纳米粒及其制备方法与应用
CN103599075A (zh) * 2013-11-26 2014-02-26 山东大学 聚乙二醇—聚乳酸包载倍他米松二丙酸酯的缓释微球及其制备方法
WO2014126796A2 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 Indiana University Research & Technology Corporation Methods of diagnosing, treating and monitoring diabetic retinopathy
WO2015058173A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-23 Abbvie Inc. Stable solid units and methods of making the same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732723A (zh) * 2009-12-30 2010-06-16 上海市肿瘤研究所 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米递送系统、制备方法及其应用
WO2014126796A2 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 Indiana University Research & Technology Corporation Methods of diagnosing, treating and monitoring diabetic retinopathy
CN103341156A (zh) * 2013-07-18 2013-10-09 深圳职业技术学院 重组抗高血压肽肠溶纳米粒及其制备方法与应用
WO2015058173A1 (en) * 2013-10-18 2015-04-23 Abbvie Inc. Stable solid units and methods of making the same
CN103599075A (zh) * 2013-11-26 2014-02-26 山东大学 聚乙二醇—聚乳酸包载倍他米松二丙酸酯的缓释微球及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JING DU ET AL.: ""Enhanced delivery of monomethoxypoly(ethyleneglycol)-poly(lactic-co-glycolic acid)-poly L-lysine nanoparticles loading platelet-derived growth factor BB small interfering RNA by ultrasound and/or microbubbles to rat retinal pigment epithelium cells"", 《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》 *
WEI TANG ET AL.: ""CD8+ T Cell-Mediated Cytotoxicity toward Schwann Cells Promotes Diabetic Peripheral Neuropathy"", 《CELLULAR PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY》 *
张喜锐 等: "《外科护理1248问》", 31 March 2012 *
汤玮 等: ""高糖激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导CD8+T淋巴细胞表达辅助性T淋巴细胞1型趋化因子受体3"", 《上海医学》 *

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