CN107595778A - 一种紫杉醇口服功能化脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种载紫杉醇口服多功能脂质体及其制备方法，该紫杉醇口服功能化脂质体是以紫杉醇为原料药，脂质体为载体，采用外镶肠粘膜粘附材料、内嵌肠粘膜渗透兼抑制P‑糖蛋白外排材料的递药系统构建而成，其粒径为50～500nm，包封率为50～95%，载药量为2～10%。本发明的特点是载紫杉醇的口服功能化脂质体具有载药能力强、胃肠道稳定性佳、缓释释药的特点；可提高脂质体与胃肠道粘膜粘附‑渗透性，并经肠细胞摄取后，抑制胞内P‑糖蛋白外排作用，多功能集成协同提高紫杉醇的口服吸收，为肿瘤的口服化疗提供有效的治疗策略。

Description

一种紫杉醇口服功能化脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种紫杉醇口服功能化脂质体及其制备方法。

背景技术

临床一线抗癌药紫杉醇属于低溶解度、低渗透性药物，其水溶性和肠粘附-渗透性差是导致紫杉醇口服吸收差的主因；而肠腔中P-糖蛋白转运体的外排，进一步限制了紫杉醇的肠膜渗透性。

脂质体作为口服药物的理想载体，将难溶药物包裹在脂质双分子层中，使药物以载药传递体形式被肠道吸收，解决了因水溶性差导致药物口服吸收差的难题。另外，脂质体的类生物膜特性有助于药物的口服吸收，但肠膜对脂质体的渗透吸收作用有限。

脂质体经口服给药后，大部分粒子会被胃肠道粘液层清除，无法穿透肠粘膜到达胃肠道表面。以巯基壳聚糖为粘附材料构建的纳米粒表现出了良好的跨粘膜吸收特性。经巯基化壳聚糖修饰脂质体可与粘膜表面半胱氨酸富集区形成二硫键，特异性粘附于肠粘膜，并利用表面游离巯基克服胃肠道粘液层的阻塞，改变其流变学性质，逃避粘蛋白的缠绕到达胃肠道表面，提高脂质体对粘液层的粘附及穿透能力，延长其在肠粘膜上的滞留时间，促进脂质体经肠粘膜吸收。

肠上皮细胞膜上的P-糖蛋白转运体对已摄取入胞的紫杉醇的外排作用影响了口服紫杉醇的跨膜转运和吸收。应用具有P-糖蛋白外排抑制作用的功能性材料PF 127、PF 68和TPGS，可通过增加细胞膜的流动性和消除能量依赖性耐药等多种机制联合耐药，逆转紫杉醇在肠道上皮细胞膜的外排，促进紫杉醇的透膜转运与吸收，为提高紫杉醇口服吸收提供了一个新策略。

发明内容

鉴于紫杉醇的水溶性和肠粘膜粘附-渗透性差，以及P-糖蛋白外排是限制其口服吸收的主因，本发明提供了一种有效提高紫杉醇口服吸收能力，载药能力强、胃肠道稳定性佳、缓释释药功能强的紫杉醇口服功能化脂质体；

本发明的另一目的是提供上述紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法。

为实现本发明的目的所采取的技术方案为：

一种紫杉醇口服功能化脂质体，其特征在于该紫杉醇口服功能化脂质体是以紫杉醇为原料药，脂质体为载体，采用外镶肠粘膜粘附材料、内嵌肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料的递药系统构建而成，其粒径为50～500nm，包封率为50～95%，载药量为2～10%。

所述紫杉醇口服功能化脂质体中各物质配比为：

紫杉醇 2～15%，

磷脂 45～75%，

胆固醇 5～15%，

肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料 5～20%，

肠粘膜粘附材料 5～20%。

所述肠粘膜粘附材料为壳聚糖-巯基乙酸（CS-TGA）或壳聚糖-N-乙酰基-半胱氨酸（CS-NAC），上述物质中，壳聚糖（CS）分子量为1×10³～1×10⁷ Da，接枝的巯基乙酸（TGA）或N-乙酰基-半胱氨酸（NAC）中总巯基含量为50～500 μmol/g，其中游离巯基含量为30～300μmol/g，二硫键含量为20～200 μmol/g。

所述肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料为普朗尼克F127（PF 127）、普朗尼克F68（PF 68）和水溶性维生素E（TPGS）中的一种或几种。

上述载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：

1）肠粘膜粘附材料的合成

将壳聚糖（CS）溶于醋酸水溶液中，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）或羟基琥珀酰亚胺（NHS）或/和羟基苯并三唑（HOBT）为活化剂，加入巯基乙酸（TGA）或N-乙酰基-半胱氨酸（NAC），用氢氧化钠调节pH至4.0～5.0，室温下避光反应，反应液经透析、冷冻干燥，即得肠粘膜粘附材料壳聚糖-巯基乙酸（CS-TGA）或壳聚糖-N-乙酰基-半胱氨酸（CS-NAC）；

2）薄膜分散-超声法-静电复合法制备载紫杉醇口服功能化脂质体

将紫杉醇、磷脂、胆固醇和肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料（PF 127或/和PF 68或/和TPGS）溶于有机溶剂中，在25～45℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥、过夜，得聚合物薄膜，加入蒸馏水，在25～60℃下磁力搅拌，水化孵育，冰水浴超声处理，得到内嵌肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料（PF 127或/和PF 68或/和TPGS）的脂质体；

将过程1）所得的肠粘膜粘附材料（CS-TGA或 CS-NAC）加入到上述所得的内嵌肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料（PF 127或/和PF 68或/和TPGS）的脂质体中，在25～40℃下磁力搅拌，水化孵育，即得。

过程1）中，所述醋酸水溶液的质量百分比为0.5～3%。

过程1）中，所述巯基乙酸（TGA）或N-乙酰基-半胱氨酸（NAC）与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的摩尔比为1：0.5～2；巯基乙酸（TGA）或N-乙酰基-半胱氨酸（NAC）与羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为1：0.5～1.5；巯基乙酸（TGA）或N-乙酰基-半胱氨酸（NAC）与羟基苯并三唑HOBT的摩尔比为1：0.5～1.5；巯基乙酸（TGA）或N-乙酰基-半胱氨酸（NAC）与壳聚糖（CS）的摩尔比为1：0.5～3。

过程1）中，所述反应液的透析过程为：将反应液置于透析袋中，先用2～10 mmol/L的盐酸溶液室温避光透析1～5次，每次8～24 h，然后用2～10 mmol/L的含0.1～2% 氯化钠的盐酸溶液透析1～5次，每次8～24 h；最后以0.5～3 mmol/L的盐酸溶液透析1～5次，每次8～24 h。

过程1）中，所述室温下避光反应时间5～12 h，过程2）中，所述水化孵育时间0.5～2 h。

过程2）中，所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种组合，其用量为紫杉醇、磷脂、胆固醇和肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料（PF 127或/和PF 68或/和TPGS）总用量的1～5倍。

过程2）中，所述超声处理条件为：功率100～400 W，时间2～10 min。

向过程2）所得的载紫杉醇口服功能化脂质体混悬液中加入质量体积比（w/v）为2～10%冻干保护剂，即得脂质体冻干制剂。

所述冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖和乳糖中的一种或多种组合。

本发明结合胃肠道多阶段促吸收策略，将具有肠粘膜粘附-渗透和抑制P-糖蛋白外排特性的功能性材料，采用外镶和内嵌技术集成，联合应用到脂质体上，成功构建了粘液层高效穿透和肠细胞跨膜吸收的口服脂质体递药系统，多功能协同作用，实现粘液层高效穿透和细胞跨膜吸收，从而提高了紫杉醇口服吸收能力，且这种紫杉醇口服功能化脂质体具有载药能力强、胃肠道稳定性佳、缓释释药的特点。本发明为提高难溶性抗肿瘤药物口服抗肿瘤疗效提供一种新型的载体和制剂策略。

附图说明

图1为本发明中CS-TGA聚合物的合成路线图。

图2泰素溶液及载紫杉醇的壳聚糖-巯基乙酸-普朗尼克（CS-TGA-PF）脂质体的体外释药曲线。

图3香豆素6溶液，载香豆素6的CS-TGA-PF脂质体经灌胃给大鼠30 min后在十二指肠、 空肠、回肠吸收的激光共聚焦图。

具体实施方法

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

1）CS-TGA 聚合物的合成

500 mg CS溶于50 mL 的0.5%醋酸水溶液中，加入650 mg EDC和800 mg TGA，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至5.0，室温下避光反应12 h。将上述反应液置于透析袋中，以5mmol/L的盐酸溶液避光透析3次，每次12 h；然后用5 mmol/L的盐酸溶液（含1% 氯化钠）透析3次，每次12 h；再以1 mmol/L的盐酸溶液透析3次，每次12 h，经冷冻干燥可得CA-TGA聚合物。

2）薄膜分散-超声法-静电复合法制备载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体

将450 mg磷脂、90 mg胆固醇、90 mg紫杉醇、120 mg PF 127置于圆底烧瓶中，加入28mL氯仿溶解后，45℃下旋蒸-真空干燥除去氯仿，放置过夜，膜材在圆底烧瓶壁上形成薄膜；加入10 mL蒸馏水，37℃搅拌水化0.5 h，然后冰浴下用细胞破碎仪超声（超声功率400 W，时间5 min，超声3 s，间隔1 s)，得到粒径在50～120 nm范围内的载药脂质体混悬液，之后加入10 mL的0.3%（w/v）的CS-TGA水溶液，37 ℃水浴搅拌水化0.5 h，即为载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体。

实施例2

1）CS-TGA 聚合物的合成

500 mg CS溶于50 mL的2%醋酸水溶液中，加入502 mg EDC、150 mg NHS和150 mg TGA，用1 mol/L的氢氧化钠调pH至4.0，室温下避光反应5 h。将上述反应产物置于透析袋中，以10 mmol/L的盐酸溶液避光透析1次，每次24 h；用10 mmol/L的盐酸溶液（含1% 氯化钠）透析1次，每次24 h；再以3 mmol/L的盐酸溶液透析1次，每次24 h，经冷冻干燥可得CA-TGA聚合物。

2）薄膜分散-超声法制备载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体

将360 mg磷脂、56 mg胆固醇、44 mg紫杉醇、30 mg的PF127置于圆底烧瓶中，加入10 mL乙酸乙酯和15 mL乙醇溶解后，30℃下旋蒸-真空干燥除去乙酸乙酯和乙醇，放置过夜，膜材在圆底烧瓶壁上形成薄膜；加入20 mL蒸馏水，60℃搅拌水化2 h，然后冰浴下用细胞破碎仪超声（超声功率100 W，时间10 min，超声3 s，间隔1 s)，得到粒径在80~400 nm范围内的载药脂质体混悬液，之后加入10 mL的0.5%（w/v）CS-TGA水溶液，25℃水浴搅拌水化2 h，即为载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体。

实施例3

1）CS-NAC聚合物的合成

500 mg CS溶于50 mL的2%醋酸水溶液中，加入292 mg EDC和210 mg HOBT，磁力搅拌至溶解，加入250 mg溶于乙醇的NAC，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至5.0，室温下避光反应8h。将上述反应液置于透析袋中，以2 mmol/L的盐酸溶液室温避光透析2次，每次18 h, 然后用2 mmol/L的盐酸溶液（含1% 氯化钠）透析2次，每次18 h；再以0.5 mmol/L的盐酸溶液透析2次，每次18 h。经冷冻干燥可得CA-NAC聚合物。

）薄膜分散-超声法-静电复合法制备载紫杉醇的CS-NAC-TPGS脂质体

将400 mg磷脂、70 mg胆固醇、75 mg紫杉醇、120 mg的TPGS等材料置于圆底烧瓶中，加30 mL的甲醇溶解后，25℃下旋蒸-真空干燥除去甲醇，放置过夜，膜材在圆底烧瓶壁上形成薄膜；加入10 mL蒸馏水，45℃搅拌水化2 h，然后冰浴下用细胞破碎仪超声（超声功率200W，时间10 min，超声3 s，间隔1 s)，得到粒径在50~260 nm范围内的载药脂质体混悬液，之后加入10 mL的2%（w/v）的CS-NAC水溶液，25℃水浴搅拌水化2 h，即为载紫杉醇的CS-NAC-TPGS脂质体。

实施例4

1）CS-TGA 聚合物的合成

500 mg CS溶于50 mL 的1%醋酸水溶液中，加入800 mg EDC、500 mg NHS和500 mgTGA，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH至5.0，室温下避光反应8 h。将上述反应液置于透析袋中，以6 mmol/L的盐酸溶液避光透析2次，每次8 h，然后用6 mmol/L的盐酸溶液（含1% 氯化钠）透析2次，每次8 h；再以2 mmol/L的盐酸溶液透析2次，每次8 h。经冷冻干燥可得CA-TGA聚合物。

2）薄膜分散-超声法-静电复合法制备载紫杉醇的CS-TGA-TPGS脂质体

将300 mg磷脂、45 mg胆固醇、12 mg紫杉醇、30 mg的TPGS置于圆底烧瓶中，加30 mL的二氯甲烷或丙酮溶解后，35℃下旋蒸-真空干燥除去二氯甲烷或丙酮，放置过夜，膜材在圆底烧瓶壁上形成薄膜；加入15 mL蒸馏水，37℃搅拌水化2 h，然后冰浴下用细胞破碎仪超声（超声功率300 W，时间5 min，超声3s，间隔1 s)，得到粒径在50～450 nm范围内的载药脂质体混悬液，之后加入15 mL的0.1%（w/v）的CS-TGA水溶液，35℃水浴搅拌水化1 h，即为载紫杉醇的CS-TGA-TPGS脂质体。

实施例5

1）CS-NAC聚合物的合成

500 mg CS溶于50 mL的3%醋酸水溶液中，加入600 mg EDC 和450 mg HOBT，磁力搅拌至溶解，加入1200 mg溶于水的NAC，用1 mol/L的氢氧化钠调pH至4.0，室温下避光反应12h。将上述反应液置于透析袋中，以5 mmol/L的HCl室温避光透析5次，每次15 h, 然后用用5mmol/L的HCl溶液（含1% NaCl）透析5次，每次15 h；再以1 mmol/L的盐酸溶液透析5次，每次15 h。经冷冻干燥可得CA-NAC聚合物。

）薄膜分散-超声法制备载紫杉醇的CS-NAC-PF脂质体

将420 mg磷脂、60 mg胆固醇、60 mg紫杉醇、60 mg PF 127置于圆底烧瓶中，加30 mL的乙醇溶解后，45℃下旋蒸-真空干燥除去乙醇，放置过夜，膜材在圆底烧瓶壁上形成薄膜；加入20 mL蒸馏水，60℃搅拌水化1.5 h，然后冰浴下用细胞破碎仪超声（超声功率350 W，时间8 min，超声3 s，间隔1 s)，得到粒径在80~350 nm范围内的载药脂质体混悬液，之后加入15mL的0.5%（w/v）CS-NAC水溶液，35℃水浴搅拌水化1.5 h，即为载紫杉醇的CS-NAC-PF脂质体。

实施例6

载药脂质体的体外释放实验

分别量取1 mL的市售泰素溶液与载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体（实施例1所获得），置于透析袋内，先投入含2%（w/v）聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）pH 1.2的80 mL模拟胃液中，于37℃振摇，2 h后取样并立刻转移于pH 6.8的模拟肠液中，其他条件不变，分别于6、12、24、36、48、72和96 h取样同时补充相同的释放介质；泰素溶液取样时间点为0.5、1、2、4、6、8、12和16 h，其他条件同上。将样品过滤，采用高效液相色谱法测定紫杉醇含量，并计算累积释放百分数，结果见图2。前2 h在模拟胃液中，泰素溶液释放了50.2%，载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体释放了2.8%；在模拟肠液里泰素溶液10 h释放接近100%，载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体在96 h只释放了18%。结果表明，载紫杉醇的CS-TGA-PF脂质体在模拟胃液和肠液中具有缓释释药特性。

实施例7载香豆素6脂质体肠道组织分布

SD大鼠灌胃载香豆素6的CS-TGA-PF脂质体（香豆素6给药剂量为10 mg/kg），麻醉后分别取出十二指肠、空肠和回肠，将其冷冻后切片置于阳离子树脂的载玻片上，并用4%多聚甲醛固定15 min后用磷酸盐缓冲液清洗，加入曲拉通100溶液进行透化，再用磷酸盐缓冲液清洗。晾干后加入罗丹明鬼笔环肽溶液，然后用微丝蛋白荧光染料罗丹明鬼笔还肽进行F-actin染色，90 min后，弃去罗丹明鬼笔环肽溶液，再用磷酸盐缓冲液清洗。加入4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色液进行染色，再用磷酸盐缓冲液清洗。晾干后用抗焚光猝灭封片液封片，采用激光共聚焦显微镜观察，结果见图3。香豆素的溶液与脂质体各组在十二指肠、空肠、回肠各个肠段均有吸收。而溶液组在各肠段的吸收均较少，其中十二指肠的吸收较好。与溶液组相比，载香豆素6的CS-TGA-PF脂质体在各肠段的吸收比香豆素6溶液的更好，不仅在小肠上皮细胞处吸收明显，而且小肠绒毛中渗入了更多的绿色荧光脂质体。

Claims (13)

1.一种紫杉醇口服功能化脂质体，其特征在于该紫杉醇口服功能化脂质体是以紫杉醇为原料药，脂质体为载体，采用外镶肠粘膜粘附材料、内嵌肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料的递药系统构建而成，其粒径为50～500nm，包封率为50～95%，载药量为2～10%。

2.按照权利要求1所述的紫杉醇口服功能化脂质体，其特征在于所述紫杉醇口服功能化脂质体中各物质配比为：

紫杉醇 2～15%，

磷脂 45～75%，

胆固醇 5～15%，

肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料 5～20%，

脂质体外镶的肠粘膜粘附材料 5～20%。

3.按照权利要求1或2所述的紫杉醇口服功能化脂质体，其特征在于所述肠粘膜粘附材料为壳聚糖-巯基乙酸或壳聚糖-N-乙酰基-半胱氨酸，上述物质中，壳聚糖分子量为1×10³～1×10⁷ Da，接枝的巯基乙酸或N-乙酰基-半胱氨酸中总巯基含量为50～500 μmol/g，其中游离巯基含量为30～300 μmol/g，二硫键含量为20～200 μmol/g。

4.按照权利要求1或2所述的紫杉醇口服功能化脂质体，其特征在于所述肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料为普朗尼克F127、普朗尼克F68和水溶性维生素E中的一种或几种。

5.一种如权利要求1或2所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：

1）肠粘膜粘附材料的合成

将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺或/和羟基琥珀酰亚胺或/和羟基苯并三唑为活化剂，加入巯基乙酸或N-乙酰基-半胱氨酸，用氢氧化钠调节pH至4.0～5.0，室温下避光反应，反应液经透析、冷冻干燥，即得肠粘膜粘附材料壳聚糖-巯基乙酸或壳聚糖-N-乙酰基-半胱氨酸；

2）薄膜分散-超声法-静电复合法制备载紫杉醇口服功能化脂质体

将紫杉醇、磷脂、胆固醇和肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料溶于有机溶剂中，在25～45℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥、过夜，得聚合物薄膜，加入蒸馏水，在25～60℃下磁力搅拌，水化孵育，冰水浴超声处理，得到内嵌肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料的脂质体；

将过程1）所得的肠粘膜粘附材料壳聚糖-巯基乙酸或壳聚糖-N-乙酰基-半胱氨酸加入到上述所得的内嵌肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料的脂质体中，在25～40℃下磁力搅拌，水化孵育，即得。

6.按照权利要求5所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于过程1）中，所述醋酸水溶液的质量百分比为0.5～3%。

7.按照权利要求6所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于过程1）中，所述巯基乙酸或N-乙酰基-半胱氨酸与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺的摩尔比为1：0.5～2；巯基乙酸或N-乙酰基-半胱氨酸与羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为1：0.5～1.5；巯基乙酸或N-乙酰基-半胱氨酸与羟基苯并三唑的摩尔比为1：0.5～1.5；巯基乙酸或N-乙酰基-半胱氨酸NAC与壳聚糖CS的摩尔比为1：0.5～3。

8.按照权利要求5所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于过程1）中，所述反应液的透析过程为：将反应液置于透析袋中，先用2～10 mmol/L的盐酸溶液室温避光透析1～5次，每次8～24 h，然后用2～10 mmol/L的含0.1～2% 氯化钠的盐酸溶液透析1～5次，每次8～24 h；最后以0.5～3 mmol/L的盐酸溶液透析1～5次，每次8～24 h。

9.按照权利要求5所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于过程1）中，所述室温下避光反应时间5～12 h，过程2）中，所述水化孵育时间0.5～2 h。

10.按照权利要求5所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于过程2）中，所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种组合，其用量为紫杉醇、磷脂、胆固醇和肠粘膜渗透兼抑制P-糖蛋白外排材料总用量的1～5倍。

11.按照权利要求5所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于过程2）中，所述超声处理条件为：功率100～400 W，时间2～10 min。

12.按照权利要求5所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于，向过程2）所得的载紫杉醇口服功能化脂质体混悬液中加入质量体积比为2～10%冻干保护剂，即得脂质体冻干制剂。

13.按照权利要求12所述的载紫杉醇口服功能化脂质体的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖和乳糖中的一种或多种组合。