CN103339251A - 褐化葡萄糖作为进料基质的用途 - Google Patents

褐化葡萄糖作为进料基质的用途 Download PDF

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Abstract

一种在培养基中发酵微生物、产生目的化合物的方法，包括：向培养基中添加褐化葡萄糖溶液，其中褐化葡萄糖溶液是经过酸处理并加热到至少90摄氏度的温度的葡萄糖溶液，并且其中葡萄糖溶液的浓度为至少500g/l。

Description

褐化葡萄糖作为进料基质的用途
技术领域
本发明涉及使用褐化葡萄糖（browned glucose）作为进料基质，在发酵中提高目的化合物的产率的方法。
背景技术
从商业上而言，使工业规模的微生物发酵所产生的目的化合物的产率持续提高是十分重要的。
如果可以提高产率，这会解放对其它化合物的生产能力并降低对生产的新投入需要。
已知酸水解的淀粉可以作为经由里氏木霉（Trichoderma reesei）产生纤维素酶的诱导剂（Process Biochemistry,vol.27,no.6,1992,page327-334）。
发明内容
令人惊讶地发现，通过向培养基中添加褐化葡萄糖溶液，可以非常显著地提高目的化合物的产率，所以我们要求保护：
一种在培养基中发酵微生物、产生目的化合物的方法，该方法包括：
向培养基中添加褐化葡萄糖溶液，其中褐化葡萄糖溶液是经过酸处理并加热到至少90摄氏度的温度的葡萄糖溶液，并且其中葡萄糖溶液的浓度为至少500g/L。
具体实施方式
本发明涉及，在工业发酵中提高目的产物的产率。
微生物可以是可用于工业发酵的任何微生物，特别是细菌或真菌。
细菌
根据本发明的表达目的化合物的细菌可以是任何属的细菌。
在优选实施方式中，目的化合物可以得自革兰氏阳性细菌，特别是得自芽孢杆菌属（Bacillus）或链霉菌属（Streptomyces）的菌株。
在优选实施方式中，芽孢杆菌属的菌株选自嗜碱芽孢杆菌（Bacillusalkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、短芽孢杆菌（Bacillus brevis）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、灿烂芽孢杆菌（Bacillus lautus）、迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。
在另一优选实施方式中，链霉菌属的菌株选自疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）、变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）、肿痂链霉菌（Streptomyces turgidiscabies）、鼠链霉菌（Streptomyces murinus）和酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）；特别地，链霉菌属的菌株选自疮痂病链霉菌、酸疮痂链霉菌和肿痂链霉菌；特别地，链霉菌属的菌株是酸疮痂链霉菌菌株。
目的化合物可以得自革兰氏阴性细菌，特别是得自埃希氏菌属（Escherichia sp.）菌株例如大肠杆菌（Escherichia coli），或得自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）菌株。
真菌
根据本发明的表达目的化合物的真菌可以是任何属的真菌，包括酵母。在优选实施方式中，真菌是丝状真菌。
根据本发明，真菌可以特别是选自绵霉属（Achlya）、枝顶孢属（Acremonium）、曲霉属（Aspergillus）、短梗霉属（Aureobasidium）、头孢霉属（Cephalosporium）、旋孢腔菌属（Cochliobolus）、隐球菌属（Cryptococcus）、内座壳属（Endothia）、Filibasidium属、镰刀菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、稻瘟菌属（Magnaporthe）、毛霉属（Mucor）、毁丝菌属（Myceliophthora）、新丽鞭毛菌（Neocallimastix）、脉孢菌属（Neurospora）、拟青霉属（Paecilomyces）、青霉属（Penicillium）、瘤胃壶菌属（Piromyces）、柄孢壳菌属（Podospora）、梨孢属（Pyricularia）、裂褶菌属（Schizophyllum）、篮状菌属（Talaromyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、梭孢壳属（Thielavia）、弯颈霉属（Tolypocladium）和木霉属（Trichoderma）的丝状真菌菌株，特别地，真菌可以选自绵霉属、曲霉属、头孢霉属、旋孢腔菌属、内座壳属、镰刀菌属、腐质霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、柄孢壳菌属、梨孢属和木霉属。
在另一个优选实施方式中，真菌是曲霉属菌株，特别地，真菌选自棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、臭曲霉（Aspergillus foetidus）、日本曲霉（Aspergillus japonicus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。
在特别优选的实施方式中，真菌是木霉属菌株，特别是里氏木霉菌株。
这些种的细菌和真菌，公众容易在多个培养保藏中心得到，例如美国标准生物品收藏中心（ATCC）、德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）、荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）、和农业研究服务部专利生物品保藏所北方地区研究中心（NRRL）。
目的化合物
根据本发明的目的化合物可以是由微生物产生的任何有价值的化合物，特别是次生代谢物。
化合物可以是植物毒素，例如赛克斯托敏（thaxtomin）。目的化合物也可以是治疗性蛋白、或酶（例如，水解酶、转移酶、裂解酶、异构酶或连接酶；特别是纤维素酶）。
根据本发明的目的化合物可以是抗生素例如青霉素或头孢菌素或红霉素，或日用化学品例如柠檬酸。
赛克斯托敏
根据本发明的目的化合物可以是赛克斯托敏。赛克斯托敏是已知的植物毒素类。
赛克斯托敏包括环二肽家族的任何种类，例如含有4-硝基吲哚-3-基的2,5-二氧代哌嗪。合适的赛克斯托敏包括，描述为具有基础结构环-(L-4-硝基色氨酰基-L-苯丙氨酰基)的环二肽的试剂。在实施方式中，合适的二酮哌嗪部分可以是N-甲基化的，且包括携带苯丙氨酰基α-和环-碳羟基的同类物。根据本发明使用的合适赛克斯托敏的非限制性实例包括赛克斯托敏A、赛克斯托敏A邻位异构体、赛克斯托敏B、和C-14去氧赛克斯托敏B（赛克斯托敏D）、以及其中任一的衍生物。
赛克斯托敏包括下式：
Figure BDA00003598055700041
在实施方式中，R1是甲基或H。
在实施方式中，R2是羟基或H。
在实施方式中，R3是甲基或H。
在实施方式中，R4是羟基或H。
在实施方式中，R5是羟基或H。
在实施方式中，R6是羟基或H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是甲基、R4是H、R5是羟基且R6是H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是甲基、R4是羟基、R5是H且R6是H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是H、R3是H、R4是H、R5是H且R6是H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是甲基、R4是H、R5是H且R6是H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是H、R3是甲基、R4是H、R5是H且R6是H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是H、R4是H、R5是H且R6是H。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是甲基、R4是H、R5是H且R6是羟基。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是甲基、R4是H、R5是羟基且R6是羟基。
在实施方式中，R1是甲基、R2是羟基、R3是H、R4是H、R5是羟基且R6是H。
在实施方式中，R1是H、R2是羟基、R3是甲基、R4是H、R5是羟基且R6是H。
在实施方式中，R1是H、R2是H、R3是H、R4是H、R5是H且R6是H。
赛克斯托敏A由含4-硝基吲哚-3-基的2,5-二氧代哌嗪构成，且是由疮痂病链霉菌、酸疮痂链霉菌和肿痂链霉菌产生的主要赛克斯托敏，具有苯丙氨酰基m-环和α-C羟基添加（addition）。化学组成包括下式，或由下式构成：
Figure BDA00003598055700051
蛋白
根据本发明的目的化合物可以是蛋白。
在优选实施方式中，目的蛋白是酶，特别是水解酶（根据酶系统命名法的EC3类；国际生物化学联盟命名委员会的推荐标准）。
在特别优选的实施方式中，优选以下的水解酶：
淀粉葡糖苷酶：淀粉葡糖苷酶（也称为葡糖淀粉酶和葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，EC3.2.1.3）是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的还原端释放D-葡萄糖的酶。
合适的淀粉葡糖苷酶包括真菌来源的那些，特别是得自丝状真菌或酵母，例如埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）、黑曲霉和泡盛曲霉的那些。包括化学改性突变体或蛋白工程突变体。
可用的埃默森蓝状菌淀粉葡糖苷酶的实例在WO99/28448中有记载。市售的淀粉葡糖苷酶的实例为AMGTM（Novozymes A/S）。
淀粉酶：合适的淀粉酶（α和/或β）包括细菌或真菌来源的那些。包括化学改性突变体或蛋白工程突变体。淀粉酶包括，例如，从芽孢杆菌属例如地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）的特定菌株得来的α-淀粉酶，在GB1,296,839中有更详细的描述。
可用的淀粉酶的例子是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873、WO97/43424和WO01/66712中记载的变体，特别是在一个或更多个以下位置有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
特别合适的淀粉酶是真菌来源的酸性淀粉酶，例如，得自黑曲霉的酸性淀粉酶。
市售的淀粉酶是DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYL LCTM、TERMAMYL SCTM、LIQUIZYME-XTM和BANTM（Novozymes A/S）、RAPIDASETM和PURASTARTM（Genencor International Inc.）。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学改性突变体或蛋白工程突变体。合适的纤维素酶包括得自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属、枝顶孢属和木霉属的纤维素酶，例如，由特异腐质霉（Humicola insolens）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的真菌纤维素酶；特别地，优选得自里氏木霉的纤维素酶；（实例在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259中有过公开）。
市售的纤维素酶包括CELLUCLASTTM、CELLUZYMETM、CAREZYMETM、和CAREZYME CORETM（Novozymes A/S）、CLAZINASETM、和PURADAX HATM（Genencor International Inc.）、和KAC-500(B)TM（Kao Corporation）。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学改性突变体或蛋白工程突变体。可用的脂肪酶的实例包括得自腐质霉属（与Thermomyces（嗜热真菌属）同义）的脂肪酶，例如得自EP258068和EP305216中记载的柔毛腐质霉（H.lanuginosa或T.lanuginosa）或得自WO96/13580中记载的特异腐质霉；假单胞菌属脂肪酶，例如得自产碱假单胞菌（P.alcaligenes）或假产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）（EP218272）、洋葱假单胞菌（P.cepacia）（EP331376）、斯氏假单胞菌（P.stutzeri）（GB1,372,034）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）、假单胞菌属菌株SD705（WO95/06720和WO96/27002）、P.wisconsinensis（WO96/12012）；芽孢杆菌属脂肪酶，例如得自枯草芽孢杆菌（Dartois等人(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360）、嗜热脂肪芽孢杆菌（JP64/744992）、或短小芽孢杆菌（B.pumilus）（WO91/16422）。
其它实例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中记载的脂肪酶变体。
优选的市售脂肪酶包括LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM（Novozymes A/S）。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学改性突变体或蛋白工程突变体。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰岛素类蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168（在WO89/06279中有过记载）。胰岛素类蛋白酶的实例是（例如猪或牛来源的）胰岛素以及WO89/06270和WO94/25583中记载的镰刀菌属蛋白酶。
优选的市售蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM（Novozymes A/S）、MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OXPTM、FN2TM、和FN3TM（Genencor International Inc.）。
其它优选的水解酶：其它优选的水解酶是碳水化合物水解酶（carbohydrolase），包括MANNAWAYTM（Novozymes A/S）。
还可以根据本发明产生其它水解酶，例如转移酶、裂解酶、异构酶和连接酶。
目的微生物的改性
产生目的化合物的微生物通常已经被包括与编码目的化合物的基因可操作地连接的启动子的表达构建体转化。在现有技术中使用并记载了多种启动子。
具有多于一个拷贝的对目的化合物进行编码的化合物通常也是有利的，以使产率尽可能高。
启动子优选为可诱导的启动子。
发酵
本发明可以用于工业规模的任何发酵，例如用于培养基为至少50升的任何发酵，优选为至少100升，更优选为至少500升，甚至更优选为至少1000升，特别是至少5000升。
微生物可以通过本领域已知的任何方法进行发酵。发酵培养基可以是包括复合氮和/或碳源的复合培养基，复合氮和/或碳源为例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解物、糖蜜等。发酵培养基可以是在化学上限定的培养基，例如WO98/37179中限定的。
可以以分批、分批补料、反复分批补料或连续的发酵过程来进行发酵。
有限碳条件
根据本发明，使用有限碳发酵可能是优势。
有限碳条件是指，微生物具有以特定生长速率生长的刚刚足够的碳，其中所述特定生长速率低于最大特定生长速率。
褐化葡萄糖
本发明公开，通过向培养基中添加褐化葡萄糖溶液，来代替仅向培养基中添加葡萄糖溶液，会达到令人惊讶的优势。
褐化葡萄糖溶液是经过酸处理并加热到至少90摄氏度的温度的葡萄糖溶液，且其中葡萄糖溶液的浓度为至少500g/l。
在优选实施方式中，葡萄糖溶液首先经酸处理然后加热到至少90摄氏度的温度。
葡萄糖溶液应该具有高浓度的葡萄糖。在优选实施方式中，葡萄糖溶液的浓度为至少500g/l；优选浓度为至少550g/l；优选浓度为至少600g/l；优选浓度为至少650g/l；优选浓度为至少700g/l；优选浓度为至少750g/l；优选浓度为至少800g/l；优选浓度为至少850g/l；优选浓度为至少900g/l；优选浓度为至少900g/l；优选浓度为至少950g/l；优选浓度为至少1000g/l；优选浓度为至少1050g/l；优选浓度为至少1100g/l；特别地，葡萄糖溶液的浓度为500g/l至1200g/l；特别地，葡萄糖溶液的浓度为600g/l至1200g/l；特别地，葡萄糖溶液的浓度为700g/l至1200g/l；甚至更优选地，葡萄糖溶液的浓度为800g/l至1200g/l。
本领域已知的任何酸均可以用于酸处理。优选的酸为磷酸、硫酸、盐酸、硝酸、或柠檬酸；特别地为磷酸或硫酸。
酸处理使得葡萄糖溶液在热处理前的pH小于4.5；特别地，pH小于4.0；特别地，pH小于3.5；特别地，pH小于3.0；特别地，pH小于2.5；特别地，pH小于2.0；特别低，pH小于1.5；特别地，pH小于1.0；特别地pH在pH0.5至pH4.5的范围内；且甚至更优选地，pH在PH0.5至pH3.5的范围内。
将经过酸处理的葡萄糖溶液加热到至少90摄氏度的温度；特别地，加热到至少95摄氏度的温度；特别地，加热到至少100摄氏度的温度；特别地，加热到至少101摄氏度的温度；特别地，加热到至少102摄氏度的温度；特别地，加热到至少103摄氏度的温度；特别地，加热到至少104摄氏度的温度；特别地，加热到至少105摄氏度的温度；特别地，加热到至少106摄氏度的温度；特别地，加热到至少107摄氏度的温度；特别地，加热到至少108摄氏度的温度；特别地，加热到至少109摄氏度的温度；特别地，加热到至少110摄氏度的温度；特别地，加热到至少111摄氏度的温度；特别地，加热到至少112摄氏度的温度；特别地，加热到至少113摄氏度的温度；特别地，加热到至少114摄氏度的温度；特别地，加热到至少115摄氏度的温度；特别地，加热到至少116摄氏度的温度；特别地，加热到至少117摄氏度的温度；特别地，加热到至少118摄氏度的温度；特别地，加热到至少119摄氏度的温度；特别地，加热到至少120摄氏度的温度；特别地，加热到至少121摄氏度的温度；特别地，加热到至少122摄氏度的温度；特别地，加热到至少123摄氏度的温度；特别地，加热到至少124摄氏度的温度；特别地，加热到至少125摄氏度的温度；特别地，加热到至少130摄氏度的温度；特别地，加热到至少135摄氏度的温度；优选地，加热到90至135摄氏度的温度范围；特别地，加热到100至135摄氏度的温度范围；甚至更优选地，加热到110至130摄氏度的温度范围。
通常通过使用高压釜来获得高温。多种类型的高压釜在领域内已知。
回收目的化合物
根据本发明的产物可以是粗产物；例如，产物可以直接得自发酵液。
本发明的另一方面涉及发酵液的下游操作。在结束发酵过程之后，可以使用针对目的化合物而开发的标准技术，从发酵液中回收目的化合物。
将要应用的相关下游操作技术取决于目的化合物的性质。
用于从发酵液中回收目的化合物的方法通常涉及（但不限于）一个或更多个以下步骤：
1）发酵液的预处理（例如，pH处理和/或絮凝）
2）从发酵液中除去细胞和其它固体材料（初级分离）
3）过滤
4）浓缩
5）过滤
6）稳定化和标准化
除以上列出的单元操作外，可以应用多个其它回收过程和步骤，例如温度的变化、结晶、用活性碳处理包括目的化合物的溶液、和使用多种吸附剂。
本发明进一步示出在以下实施例中，实施例不意在以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实施例1
褐化葡萄糖对由酸疮痂链霉菌产生赛克斯托敏A的作用
以下实施例示出褐化葡萄糖溶液（而非葡萄糖溶液）的使用，对酸疮痂链霉菌产生赛克斯托敏A引起强烈的诱导。
培养基：
2g/L       Difco酵母提取物
0.025g/L   CuSO45H2O
2.44g/L    Na2HPO4单水合物
7.5g/L     K2HPO4
2.5g/L     (NH4)2SO4
2g/L       柠檬酸
2.5g/L     MgSO47H2O
0.25g/L    CaCO3
3g/L       K2SO4
100mM      MES缓冲液（20g/l）
预混合物（微量元素溶液-参见以下配方）10mL/L
pH～6.0
使用具有2个挡板的500ml玻璃摇瓶，内装100ml培养基。
向各个烧瓶中加入0.1ml的P2000消泡剂。
预混合微量元素溶液配方
0.4g/L  ZnSO47H2O
0.2g/L  CuSO45H2O
1.5g/L  FeSO47H2O
0.6g/L  MnSO4H2O
20g/L   柠檬酸
在热处理（121摄氏度；20min）之后，向摇瓶中加入碳水化合物来源。
碳水化合物来源
2.44ml   葡萄糖溶液
820g/l   葡萄糖1H2O；在121摄氏度，热处理（高压釜）1hr。
或者
2.13ml   褐化葡萄糖溶液–按以下方式进行酸和热处理：
940g/l   葡萄糖1H2O
87.2g/l  16%H3PO4
0.6g/l   SB2121（消泡剂）
在121摄氏度，热处理（高压釜）1.5hr。
用1ml生长强烈的接种物培养物（详情参见以下）对摇瓶进行接种。
制作接种物以进行培养
从冷冻管接种菌株，且首先在28摄氏度在PDA琼脂上生长3天。从琼脂上切割出单个集落，用于对具有上述培养基以及作为碳水化合物来源的葡萄糖的摇瓶进行接种。摇瓶在28摄氏度、200RPM孵育2天；1天后，通过短时间的有力的手动摇晃，将壁生长摇晃到培养基/培养物中。该培养物用作上述摇瓶的接种物。
在2天的培养之后，测量生长和赛克斯托敏A的产生。
结论
基于与细胞干质密切相关的OD650，两种碳源引起几乎相同水平的生物质，而在褐化葡萄糖作为碳水化合物来源的培养物中的赛克斯托敏A水平令人惊讶地更高。
与葡萄糖作为碳水化合物来源的培养物相比，产率为170%。

Claims (15)

1.一种在培养基中发酵微生物、产生目的化合物的方法，包括：
向所述培养基中添加褐化葡萄糖溶液，其中所述褐化葡萄糖溶液是经过酸处理并加热到至少90摄氏度的温度的葡萄糖溶液，并且其中所述葡萄糖溶液的浓度为至少500g/l。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是细菌或真菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌选自芽孢杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属和假单胞菌属。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述真菌选自绵霉属、曲霉属、头孢霉属、旋孢腔菌属、内座壳属、镰刀菌属、腐质霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、柄孢壳菌属、梨孢属和木霉属。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述目的化合物是次生代谢物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述目的化合物是蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白是酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵是分批、分批补料、反复分批补料或连续的发酵。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸处理使得葡萄糖溶液的pH小于pH4.5。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖溶液经过酸处理并在之后加热到至少90摄氏度的温度。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖溶液的浓度为500g/l至1200g/l。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物已经被含有与编码所述目的化合物的基因可操作地连接的启动子的表达构建体转化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述启动子是可诱导的启动子。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在除去所述微生物后回收所述目的化合物。
15.根据权利要求5所述的方法，其中所述次生代谢物是赛克斯托敏。
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