CN103333253B

CN103333253B - 一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103333253B
Application number: CN201310236483.0A
Authority: CN
Inventors: 曹鹏; 张双全; 夏志南; 乔波
Original assignee: NANJING RUIBIDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING RUIBIDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103333253A

Abstract

本发明公开了一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白由人免疫球蛋白G的Fc片段和骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段相连构成的融合蛋白。本发明还公开了该融合蛋白的制备方法及其应用。本发明纳米抗体融合蛋白与原核表达的TNFa纳米抗体以及原核表达的Fc修饰化TNFa纳米抗体相比，具有更高的生物学活性；酵母表达anti-TNF-VHH-Fc蛋白形成完全的二聚体形式，表现出更高的稳定性及抗原结合活性；选择免疫球蛋白的Fc片段作为融合片段，避免副作用的产生；表达量高，易于放大生产，成本低。

Description

一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及人免疫球蛋白可结晶片段（crystalizable fragment，Fc）融合骆驼抗人TNFa纳米抗体的表达制备。用这种方法制备的融合纳米抗体蛋白anti-TNF-VHH-Fc，具有更高的抗原结合能力，可用于人类相关疾病的治疗。

背景技术

TNF超家族成员在各种人类疾病的发病机制中发挥着重要作用。因此，这一超家族代表了一种活跃的药物开发靶点。各种针对TNF家族成员的抗体药物及其受体已被FDA批准，还有一些正在进行临床试验。这些试剂可以有效预防风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎和克罗恩病。TNFa为肿瘤坏死因子，针对TNFa已被批准的治疗方法主要是两种：一种是可溶性受体，结合循环的TNFa以阻止TNFa与细胞表面受体相互作用；一种是TNFa的抗体，如Golimumab是一个完全人源化的TNFa单克隆抗体，可以特异性针对人的TNFa，并且已被批准治疗风湿性关节炎、银屑病关节炎以及强直性脊柱炎。与此类似，Certolizumab pegol，一种聚乙二醇化抗人TNFa抗体Fab片段也已用于疾病治疗。大多数TNFa阻滞剂的主要问题之一是它们会产生很多副作用。例如，英夫利昔单抗(Remicade)、依那西普(Enbrel)和阿达木单抗(Humira)都是免疫抑制剂，会增加严重感染风险（如肺结核）同时也会增加中枢神经系统脱髓鞘疾病的风险。使用英夫利昔单抗发生不良反应的患者已被研究和报道，风险包括严重的有时可以产生致命的血液疾病、严重感染、淋巴瘤和实体肿瘤、严重的肝损伤、乙型肝炎复发、肝脾的T细胞淋巴瘤、药物引起的狼疮等。使用英夫利昔单抗也会导致白细胞减少症、中性粒细胞减少症、血小板减少症和全血细胞减少症。除了安全问题，大部分的TNFa拮抗剂都十分昂贵。例如，每个病人一年的英夫利昔单抗费用可达22000美元。因此，更加安全、可负担的起的、有效的备选方案是迫切需要的。

骆驼重链抗体缺失轻链和CH1恒定区，其重链可变区(VHH)直接通过铰链与Fc结构域连接。虽然缺失轻链，HCAb却可正常识别和结合抗原，与抗原结合的亲和力达到纳摩尔(nmol)级，与scFv单链抗体亲和力相当。纳米抗体具有高结合亲和性，人癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)单域重链抗体对CEA的结合亲和性为0.34-55nmol/L，高于小鼠(2.5nmol/L)或人(7.7nmol/L)抗-CEA单链抗体对CEA的结合亲和性。而且FR2区保守序列中含有几个具有亲水性的氨基酸，使得VHH单域抗体具有水溶性好的特点。试验表明，原核表达的VHH抗体在高达10mg/mL浓度时，仍不发生聚集，具有良好的可溶性。由于VHH单域抗体具有可逆重折叠性质，在高温(80-92℃)和高浓度变性剂作用下仍保持抗原结合活性。对迄今得到的VHH单域抗体的稳定性分析表明这些抗体都相当稳定。筛选出的VHH单域抗体与传统抗体相比，在大肠杆菌中较易表达和纯化，摇瓶培养的表达水平通常为10mg/L；而用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)摇瓶培养可以达到100mg/L以上，10L补料分批发酵可以达到1g/L以上，15m³发酵可以达到1kg以上，表达稳定，适合于大规模生产，生产成本极大降低。

抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成Fc结构域。研究表明，与可溶性受体和抗体Fab片段相比较，TNFa的抗体能够通过膜结合TNFa在人T细胞和巨噬细胞中转导凋亡信号，并且交联Fab片段以增加抗体的稳定性也可以诱导细胞凋亡，暗示了多聚体的相互作用对于抗体诱发凋亡途径从而增强抗体效应具有重要作用。已有研究报道IgG抗体骨架能够诱导补体结合与抗体依赖的细胞毒性，而且Fc融合蛋白具有二价抗体的相似效应即在血液中有较长的半衰期和增强的抗原亲和力。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc(Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连，以避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造成的影响。此外，IgG的融合蛋白可以通过ProteinA亲和层析得到高效便捷的纯化。因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段，但是由于其高效性、半衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。

通过使用真核细胞，抗体片段能够通过分泌途径主要表达，这种方式不仅有利于二硫键的形成而且能够容易得到可溶和正确折叠的产品。无论是在细胞内产生或是分泌到培养基中，毕赤酵母适用于高水平表达各种异种蛋白。毕赤酵母具有的严谨、可诱导启动子利于重组蛋白的表达，而且毕赤酵母能够高密度发酵而不会像酿酒酵母产生甲醇累积毒性。因此本研究中将人TNFa纳米抗体片段（anti-TNF-VHH）连接到人免疫球蛋白的重链恒定区形成Ig抗体类似的二价结构，并利用酵母表达系统表达该抗体蛋白以得到具有高活性的纳米抗体融合蛋白（anti-TNF-VHH-Fc）用于检测试剂盒和慢性炎症治疗药物的研究。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白由骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段和人免疫球蛋白G的Fc片段相连构成的融合蛋白，其中，所述骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1、SEQID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ IDNo：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17或SEQ ID No：19中的任意一种序列所示，所述人免疫球蛋白G的Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No：21所示。

所述纳米抗体融合蛋白由人免疫球蛋白G的Fc片段通过一个连接肽和骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段相连。

该纳米抗体融合蛋白可直接连在IgG Fc蛋白（hinge铰链区+CH2+CH3）的N末端或C末端形成干扰素类似物，也可以通过连接肽来连接Fc与TNFa纳米抗体以形成任何蛋白，如TNFa纳米抗体-连接肽-Fc，或Fc-连接肽-TNFa纳米抗体。连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基酸。连接肽长度可短至Fc对干扰素形成的位阻保持最小，例如（G4S）3-4。连接肽有利于TNFa纳米抗体与TNFa结合。

制备所述的纳米抗体融合蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段基因即anti-TNF-VHH基因及人免疫球蛋白G的Fc片段基因即IgG1Fc基因的获得；

（2）利用重叠延伸PCR连接anti-TNF-VHH基因和IgG1Fc基因得到anti-TNF-VHH-Fc融合基因；

（3）将上述anti-TNF-VHH-Fc融合基因进行双酶切得到混合物，直接对混合物进行磷酸化得到anti-TNF-VHH-Fc磷酸化混合液，同时将pPICZaA载体进行双酶切后进行去磷酸化得到pPICZaA去磷酸化混合液，用连接酶将anti-TNF-VHH-Fc融合基因连接到pPICZaA载体上获得重组表达载体pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc；

（4）用上述（3）中得到的重组表达载体pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc线性化，线性化后进行纯化、浓缩、鉴定，最后电转化入酵母细胞得到重组菌株；

（5）培养重组菌株，筛选高抗性重组菌株，并进行重组融合蛋白的表达，然后回收和纯化得到纯化的重组融合蛋白。

（6）将步骤（5）纯化的重组融合蛋白进行质谱鉴定即为纳米抗体融合蛋白。

所述的纳米抗体融合蛋白在制备检测试剂、自身免疫性疾病等免疫调节药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：

1)与原核表达的TNFa纳米抗体以及原核表达的Fc修饰化TNFa纳米抗体相比，具有更高的生物学活性；

2)酵母表达anti-TNF-VHH-Fc蛋白形成完全的二聚体形式，表现出更高的稳定性及抗原结合活性；

3)选择免疫球蛋白的Fc片段作为融合片段，避免副作用的产生；

4)表达量高，易于放大生产，成本低。酵母菌株稳定表达该人TNFa纳米抗体，用ELISA方法检测上清中的表达量，统计50余次的数据，表达量在80mg/L以上。在纯化方面，由于融合蛋白在酵母细胞培养基上清中含量高，而纯化工艺中的亲和层析步骤具有很高的纯化效率，每毫升凝胶可以结合50mg的蛋白，易于放大生产。

附图说明

图1：显示PCR扩增Anti-TNF-VHH-Fc融合基因。M:2000bp DNA ladder。

图2：显示融合基因pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc表达载体构建示意图。

图3：Western blot鉴定转化菌株目的蛋白诱导表达。M：蛋白Marker；lane1-5：1-5号转化菌株；lane6：对照菌株。

图4：SDS-PAGE分析proteinA柱纯化后蛋白。M：蛋白marker。

图5：SDS-PAGE分析anti-TNF-VHH-Fc蛋白二聚体形成情况。M：蛋白Marker；1：还原性蛋白样品；2：非还原性蛋白样品。

图6：Anti-TNF-VHH-Fc蛋白质图谱。

图7：ELISA法检测anti-TNF-VHH-Fc的抗原结合活性。

图8：CCK-8检测TNFa介导的L929细胞毒性。

图9：流式细胞术检测TNFa介导的L929细胞凋亡。a：cell对照组；b：100ng/ml hTNFa处理组；c：100ng/ml hTNFa+10nM anti-TNF-VHH-Fc；d：100ng/ml hTNFa+10nM hIgG图10：显示融合蛋白anti-TNF-VHH-Fc结构示意图

具体实施方式

实施例1

融合基因anti-TNF-VHH-Fc的获得

1、PCR反应获得anti-TNF-VHH基因：

在25μl PCR反应管中建立如下反应体系：

反应条件如下：

anti-TNF-VHH-F为anti-TNF-VHH基因的上游引物，其核苷酸序列为：CCGGCTCGAGAAAAGAGAGGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGT

anti-TNF-VHH-R为anti-TNF-VHH基因的下游引物，核苷酸序列TTTGTCACAAGATTTGGGCTCAGAGGAGACGGTGACTTG

2、PCR反应获得Fc基因：

反应体系如下：

反应条件如下：

Fc-F是Fc基因的上游引物，其核苷酸序列CAAGTCACCGTCTCCTCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA；

Fc-R是Fc基因的下游引物，其核苷酸序列GCCTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGGA。

3、连接anti-TNF-VHH和人IgG1 Fc基因，进行重叠延伸拼接技术(over-lap)：

反应体系如下：

反应条件如下：

反应结束后，取5μl进行1%Agarose电泳鉴定。全长基因anti-TNF-VHH-Fc的电泳图如图1所示，我们得到了预计大小的DNA片段（约1083bp）。

实施例2

pPICZa-anti-TNF-VHH-Fc/GS115真核表达菌株的构建

1、PCR产物经电泳分离后，切胶回收目的片段，与载体分别建立如下酶切反应体系：

37℃反应4h。

2、对酶切后的混合物不进行纯化，直接对目的基因进行磷酸化，对载体进行去磷酸化，步骤如下。

磷酸化体系(Takara公司试剂)：

去磷酸化体系(Takara公司试剂)：

随后建立如下连接反应体系：

16℃反应12h。

经过双酶切，将anti-TNF-VHH-Fc基因连接到酵母表达载体pPICZaA载体上，获得成功构建的酵母表达载体pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc，载体构建示意图见图2。

实施例3

pPICZa-anti-TNF-VHH-Fc/GS115真核表达菌株的构建

1、质粒的线性化:

将测序正确的重组质粒pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc/对照质粒pPICZaA用Sac?单酶切。

反应体系如下：

10个平行实验体系，共200uL，反应条件：37℃，5h

2、线性化质粒的纯化、浓缩与鉴定:

把质粒的酶切反应液合并到一个灭菌的1.5mL EP管中，加入3倍体积的无水乙醇，1/3体积的3M NaAc混匀；-70℃静置30min以沉淀DNA；4℃、12000rpm离心30min，弃上清，室温放置，等乙醇挥发后，加入10uL灭菌的双蒸水溶解，-20℃保存备用。

3、酵母菌的转化：

（1）酵母GS115宿主感受态细胞的制备：

划平板，挑取毕赤酵母GS115单克隆，30℃、230rpm振荡培养过夜，作为种子瓶；转接，摇菌2-3h，检测OD值在1.0-1.3之间；在500ml离心瓶中加入100ml菌液，4℃离心，3000g，5min，弃去上清；加入20ml YPD/HEPES(40ml YPD/8ml1M HEPES)，重悬细胞沉淀；加入0.5ml1M二硫苏糖醇轻柔混合，30℃，15min，勿振荡；加入100ml预冷的山梨醇，3000g，4℃离心5min，弃上清；加入5ml预冷的山梨醇重悬沉淀，转移至50ml离心管，3000g，4℃离心5min，弃上清；100-500μl预冷的1M山梨醇重悬沉淀，保持在冰上，分装感受态每管50μl。

（2）电转化：

清洗电转杯，将10μl重组质粒/对照质粒DNA（5-20μg）加入感受态中，轻柔混匀，放在冰上10min；按照Invitrogen提供的电转参数:25μF,200Ω,2.2kV,5ms。将DNA-Cell转入电转杯中，轻拍至底部，放入孔中，关上盖子，热击；取出杯，加入1mL预冷的1M山梨醇,然后将电转杯中的混合液轻柔转入无菌管中；将试管放置在30℃培养箱中，静置1小时；加入1ml山梨醇继续敷育1h；取200μL电转液涂布于YPDS平板上（100μg/mL zeocin），30℃培养箱中培养2天以上，至单克隆出现。

（3）筛选高抗性重组菌株：

用灭菌的牙签挑取的100μg/mL博来霉素（zeocin）YPDS平板上的单菌落，将其分别点到500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL zeocin的YPD平板上，平板倒置，30℃培养箱中培养2～3天。将2000μg/mL抗性的克隆挑出来，分别划线于zeocin浓度为100μg/mL的YPDS平板上，以纯化单克隆。

（4）PCR鉴定阳性克隆：

分别挑取单克隆接种于3mL YPD液体培养基中，30℃、230rpm振荡培养过夜；取1mL菌液，室温、2500g离心5min，弃上清，沉淀加入500μL PBS洗涤；室温，2500g离心3min，弃上清，沉淀溶于100uL ddH2O中；沸水浴10min；-80℃冷冻30min；沸水浴10min；室温，1500g离心5min，取上清1μL作为模板，进行PCR。醇氧化酶AOX1基因上下游引物分别为5’AOX1和3’AOX1。

反应体系如下：

反应条件如下：

取PCR鉴定为阳性的克隆菌株，进行蛋白的预诱导表达。

实施例4

anti-TNF-VHH-Fc蛋白在毕赤酵母GS115中的预表达

诱导酵母菌株表达目的蛋白步骤如下：

（1）挑取筛选出来的阳性高拷贝重组酵母菌株1-5号菌株（pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc/GS115，Mut+）的单克隆和pPICZaA/GS115对照菌株，于25mL BMGY（250mL锥形瓶）培养基中，30℃、220r/min振荡培养至OD600≈2～6，16-18个小时。在50ml离心管中，3000g离心5min，弃上清；

（2）于100ml BMMY（1L锥形瓶）培养基重悬菌至OD600为1左右，30℃、220r/min振荡培养，甲醇诱导表达；

（3）每隔24h补加100%甲醇至终浓度为0.5%，60h后取诱导菌液1mL，4℃、12000r/min离心5min；

（4）取上清进行Western blotting鉴定；

Western blotting鉴定过程如下：

（1）蛋白上清液于100℃的废水中煮5分钟，然后12000rpm离心4min后上样。

（2）跑SDS-PAGE电泳，先100V跑15min，然后电压调到200V跑45min。

（3）将蛋白胶，硝酸纤维素膜，六张与胶大小相同的滤纸在转移缓冲液（39mM Glycine，48mM Tris-HCl，0.037%（w/v）SDS，20%（v/v）甲醇）中浸泡15-20min。

（4）转移：按照三层滤纸、SDS-PAGE胶、硝酸纤维素膜、三层滤纸从下到上的顺序置于Bio-Rad的标准湿式转膜装置上，15V电压进行20-25min。

（5）将转膜后的硝酸纤维膜放于TBST（20mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.05%(v/v)Tween-20,pH8.0）中清洗3次，每次5min，快速振摇。

（6）用5%（w/v）的脱脂奶粉缓慢振荡封闭硝酸纤维素膜1h。

（7）将硝酸纤维素膜放入1:2500稀释的HRP标记的兔抗人IgG抗体，室温，2h，慢摇。

（8）硝酸纤维素膜用TBST洗3次，每次5min。用清水清洗后，向硝酸纤维素膜上喷上DAB显色，曝光，拍照。

经过Western blot鉴定甲醇诱导1-5号菌株及对照菌株蛋白表达情况。由预测软件分析目的蛋白大小为45Kd。Western blot结果显示（如图3），1号和2号菌都有目的蛋白大小的条带，而3-5号菌目的蛋白的位置上几乎没有条带。说明1、2号菌株构建成功并成功表达目的蛋白，选用1号阳性表达菌株进行蛋白的表达、纯化实验。

实施例5

anti-TNF-VHH-Fc在毕赤酵母中的表达、纯化

根据优化结果的条件进行蛋白制备，具体步骤如下:

（1）将BMGY酵母培养基中酵母菌转接于2L BMMY酵母培养基中，每瓶500ml，OD600为0.6，28℃，0.5%甲醇，诱导72h后收集培养基。

（2）培养基4℃、20000g，离心30min，以尽量除去细胞及杂质。

（3）将离心后培养基上清先过两层滤纸后再过0.22μm微孔滤膜。

（4）利用Pellicon2实验室超滤系统，将上清液浓缩八倍至500ml。

（5）利用AKTA purifier900蛋白纯化系统，proteinA柱纯化目的蛋白。

纯化蛋白制成还原性样品和非还原性样品进行SDS-PAGE分析。根据优化结果的条件（28℃，0.5%甲醇，72h）进行蛋白制备。蛋白浓缩液过proteinA柱纯化后，蛋白纯度大于95%（图4），表达量达到80mg/l(培养基)。对纯化得到的anti-TNF-VHH-Fc蛋白进行二聚体结构分析（图5），结果与预期相一致蛋白全部以二聚体形式存在，表明通过酵母表达系统获得的Fc修饰化抗体蛋白能够形成完整的二硫键，以二聚体形式存在。

实施例6

anti-TNF-VHH-Fc质谱鉴定

将纯化的anti-TNF-VHH-Fc蛋白脱盐，用逐级稀释透析液PBS的方法最终透析到纯水中。利用MALDI串联飞行时间质谱仪测定精确蛋白分子量。参数设置：laser,80%；frequency,1,000；shots,500/500。如图6所示，纯化得到的anti-TNF-VHH-Fc蛋白的质谱分子量为42582道尔顿，与预测蛋白的理论分子量一致。

实施例7

Elisa检测anti-TNF-VHH-Fc抗原结合活性

步骤如下：

（1）在每个聚苯乙烯板的反应孔中加入100μl1μg/ml人可溶性TNFa蛋白（hsTNFa）hsTNFa蛋白（0.02M，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液），4℃包被过夜。

（2）次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST（NaCl40mM，KCl mM,Na₂HPO₄8mM,KH₂PO₄2mM）洗3次，每次3min。

（3）每孔加入5％脱脂牛奶300μl，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液PBST洗涤3遍。

（4）每个孔中分别加入浓度为0.15625nM，0.3125nM，0.625nM，1.25nM，2.5nM，5nM，10nM，20nM的anti-TNF-VHH-Fc抗体及人IgG蛋白（hIgG），所有孔设三个重复，37℃反应2h，弃去孔内液体，PBST洗3次，每次3min。

（5）HRP-rabbit-antihuman抗体1：2000稀释，分别加入到anti-TNF-VHH-Fc抗体及hIgG对照蛋白孔中，置37℃孵育2h，PBST洗5次，每次3min。清水洗一遍。

（6）各反应孔中加入100μl TMB酶底物孵育30min后，加入50μl2M硫酸终止反应5-10min。酶联免疫检测仪检测450nm处吸光值。

用Elisa法对anti-TNF-VHH-Fc抗体的hsTNFa抗原结合活性进行分析。以1μg/mlTNFa包被酶标板，anti-TNF-VHH-Fc表现出剂量依赖效应，而人IgG没有此效应，说明这种抗体具有抗原结合活性（图7）。

实施例8：

小鼠成纤维瘤（L929）细胞毒性分析

1、CCK-8法检测细胞毒性

步骤如下：

（1）接种3×105个L929细胞于96孔细胞培养板中，5%CO2，37℃过夜培养。

（2）加入放线酮素D使其终浓度达到0.5μg/ml，敷育30min，敏化细胞。同时，将100ng/ml TNFa分别与0.4、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100nM浓度的anti-TNF-VHH-Fc及人IgG蛋白37℃混合30min。

（3）吸去培养基上清，将蛋白混合物培养基加入到敏化的细胞中，只加入TNFa蛋白孔作为阳性对照孔，不加蛋白孔为细胞对照孔。所有孔设三个重复。37℃，5%CO₂培养24h。

（4）每孔加入10μl CCK-8细胞毒性检测试剂，37℃，2h。酶联免疫检测仪检测450nm处吸光值。利用originPro8.0软件绘制曲线，并计算EC50值。

L929细胞，小鼠成纤维瘤细胞是一种对TNFa敏感的细胞株，已有研究利用抗体对TNFa毒性的抵消效应来确定其活性。我们首先用CCK毒性检测试剂盒检测了L929细胞毒性，如图8所示，anti-TNF-VHH-Fc抗体蛋白能够以剂量依赖方式抑制TNFa诱导的L929细胞死亡，通过OriginPro8软件进行拟合分析，anti-TNF-VHH-Fc的EC50(半数效应浓度)为3.76nM。

2、流式细胞术检测细胞凋亡

步骤如下：

（1）接种3×105个L929细胞于96孔细胞培养板中，5%CO₂，37℃过夜培养。

（2）加入放线酮素D使其终浓度达到0.5μg/ml，敷育30min，敏化细胞。

（3）100ng/ml TNFa分别与10nM anti-TNF-VHH-Fc及人IgG蛋白37℃混合30min。

（4）将混合物加入到敏化的细胞中，只加入TNFa蛋白孔作为阳性对照孔，不加蛋白孔为细胞对照孔。37℃，5%CO₂培养24h。

（5）胰酶消化收集细胞，1000r/min离心5min，弃去培养液后用0.5ml预冷的PBS重悬细胞，1000r/min离心5min，弃去PBS。

（6）用500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC混匀后再加入5μL Propidium Iodide，混匀。

（7）室温、避光、反应5～15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

为了检测抗体对细胞凋亡的影响，我们用细胞凋亡双染试剂盒annexinV/fluorescein isothiocyanate(FITC)-propidium iodide(PI)对细胞染色。应用FACS检测细胞凋亡（如图9），结果显示0.5μg/ml ActD预处理细胞后，加入100ng/ml TNFa后细胞发生凋亡,凋亡率可达到40%。当加入10nM浓度的抗体时，anti-TNF-VHH-Fc蛋白显示出明显的抑制效应，凋亡率为8.48%（图8）。说明anti-TNF-VHH-Fc蛋白都能够有效地阻断TNFa诱导的细胞凋亡。

将目的基因anti-TNF-VHH-Fc和载体pPICZaA分别用XhoI和XbaI双酶切后连接构建pPICZaA-anti-TNF-VHH酵母表达载体，并进行碱基序列测序验证。对pPICZaA-anti-TNF-VHH质粒SacI单酶切后电转到毕赤酵母Picha pastoris菌株GS115中表达，本发明通过多次预表达实验摸索出了合适的表达条件（甲醇诱导浓度、诱导时间以诱导产生尽可能多的目的蛋白），培养基上清经超滤浓缩后，蛋白过ProteinA柱纯化，经醋酸（pH3.0）洗脱之后我们得到了酵母表达Anti-TNF-VHH-Fc纳米抗体融合蛋白，并进行二聚体蛋白及质谱鉴定。ELISA酶联免疫吸附亲和力检测和CCK-8染色细胞毒性及annexin V/FITC-PI染色细胞凋亡流式检测结果显示，该蛋白能够高亲和力结合人TNFa，并且可以抑制TNFa对于L929细胞的毒性从而抑制其凋亡，呈现剂量依赖效应。结论为酵母表达hTNFa纳米抗体可以作为有效的人TNFa抑制剂，不仅可以生产一些TNFa检测试剂盒如流式、ELISA试剂盒等，而且可以用于TNFa相关自身免疫性疾病治疗药物的研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种纳米抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段基因即anti-TNF-VHH基因及人免疫球蛋白G的Fc片段基因即IgG1 Fc基因的获得；

（2）利用重叠延伸PCR连接anti-TNF-VHH基因和IgG1 Fc基因得到anti-TNF-VHH-Fc融合基因；

（5）培养重组菌株，筛选高抗性重组菌株，并进行重组融合蛋白的表达，然后回收和纯化得到纯化的重组融合蛋白；

（6）将步骤（5）纯化的重组融合蛋白进行质谱鉴定即为纳米抗体融合蛋白；

所述纳米抗体融合蛋白由骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段和人免疫球蛋白G的Fc片段相连构成的融合蛋白，其中，所述骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：3 、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17或SEQ ID No：19中的任意一种序列所示，所述人免疫球蛋白G的Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No：21所示，所述纳米抗体融合蛋白由人免疫球蛋白G的Fc片段通过一个连接肽和骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段相连。