CN103320411A

CN103320411A - 海洋细菌lyg01产甲基对硫磷水解酶的方法

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Publication number: CN103320411A
Application number: CN2013102207666A
Authority: CN
Inventors: 李福后; 王伟霞; 陈丽; 安贤惠; 秦蕾
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-05
Also published as: CN103320411B

Abstract

本发明是海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法。本发明所产的酶属于胞内酶，该方法经超声波破碎、超速离心后可获得粗酶液；在温度37-40℃、pH6-8范围内，菌体具有较高的产酶能力。经(NH₄)₂SO₄盐析去除杂质蛋白以及MonoQ阴离子交换柱的纯化，可以获得初步纯化的酶；酶在35-45℃、pH7.0-8.5范围内具有较高的活力；金属离子K⁺，Fe³⁺，Mg²⁺以及二硫苏糖醇DTT、乙二胺四乙酸EDTA能够促进酶的活性。本发明方法可操作性强，所产的酶比菌体适应范围更广，酶在自然条件下同样具有较高的活力，农药的降解率接近90%，具有更好的实际应用价值。

Description

海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法

技术领域

本发明涉及一种海洋细菌的产酶方法，特别是海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法。

背景技术

甲基对硫磷在我国广泛使用，该农药对多种农业害虫具有强烈的杀虫效果，对提高农作物产量具有重要的意义。但是，该农药使用后残留在土壤、水体、大气以及农产品中，造成严重的环境污染与生态破坏，并对人体健康造成严重威胁。

微生物能够降解甲基对硫磷等有机磷农药，这主要得益于它们能够产生甲基对硫磷水解酶，该酶能够水解甲基对硫磷，生成硫代磷酸以及对硝基苯酚等。目前已报道的产酶菌株主要有黄杆菌ATCC27551、缺陷假单胞菌MG、邻单胞菌M6等。与产酶菌株相比，甲基对硫磷水解酶具有更广泛的适用性，其对温度、pH值等条件更接近于实际环境。

甲基对硫磷水解酶具有多方面的用途，如在医学方面，治疗甲基对硫磷中毒患者；在环境保护方面，修复被农药污染的土壤以及水体；在食品方面，应用于生物传感器，检测食品的农药残留，保护餐桌安全等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、操作简单、产酶效果好的海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是1．一种海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）制备酶诱导培养基：以海水LB培养基为基础，制备酶诱导培养基；其组成如下：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，0.1%甲基对硫磷乳油，甲基对硫磷乳油中乳油的质量含量为50%，陈海水1000mL；分别称取胰蛋白胨、酵母提取物以及NaCl，用1000 mL陈海水定容，分装500 mL三角瓶，装液量100mL，121℃灭菌30min；采用0.22μm过滤膜对甲基对硫磷乳油过滤，在菌体接种之前加入；

（2）产酶培养：按接种量2%向装液量为100mL的酶诱导培养基中接入海洋细菌LYG01，转速220r/min，37℃，培养36h，得发酵液；

（3）粗酶液的制备：取发酵液，4℃，4000g 离心10min，收集菌体；取5g菌体，加入20mL 25 mM pH8.0预冷至4℃的Tris-Cl缓冲液，超声波破碎，超声功率为150W，工作3s，间隔5s，超声时间为20min，得菌体破碎液，将菌体破碎液在4℃条件下，10000g 离心30min，保留上清液；将上清液进行超速离心，在4℃、100000 g条件下，离心60min，再次弃去沉淀，所得上清液即为粗酶液；

（4）酶的分离纯化：对粗酶液依次进行(NH₄)₂SO₄沉淀和Mono Q 阴离子交换层析处理；

a、(NH₄)₂SO₄沉淀：向粗酶液中加入pH8.0的100%饱和(NH₄)₂SO₄溶液，使其最终饱和度为50%；缓慢振荡20min，10000g 离心30min，保留上清液；将上清液透析到25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液中，透析袋截留分子量为3000，透析时间2h；

b 、Mono Q 阴离子交换层析：将(NH₄)₂SO₄沉淀后的酶液进一步采用Mono Q 阴离子交换柱分离纯化；采用25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液平衡Mono Q 阴离子交换柱，上样，梯度洗脱，A泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl，0.2 M NaCl，B泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl，1M NaCl，流速0.5mL/min，收集得到甲基对硫磷水解酶。

以下对本发明海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法进行更为详细的说明。

1 材料

1.1 菌株

海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01，分离自连云港海域。该菌株已于2010年6月9号在Genbank公开，登录号为HM116540，登陆网址为：（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HM116540）。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。

1.2 酶诱导培养基

以海水LB培养基为基础，制备酶诱导培养基。其组成如下：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，0.1%甲基对硫磷乳油（50%），陈海水1000mL。分别称取胰蛋白胨、酵母提取物以及NaCl，用1000 mL陈海水定容，分装500 mL三角瓶，装液量100mL，121℃灭菌30min。甲基对硫磷乳油采用过滤除菌，菌体接种之前临时加入。

2 方法

2.1 产酶培养

按照上述方法配制酶诱导培养基，采用500 mL三角瓶，装液量100mL，接种量2%，转速220r/min，37℃，培养36h。

2.2 粗酶液的制备

取上述发酵液，4℃，4000g 离心10min，收集菌体。取5g菌体，加入20mL 25 mM pH8.0预冷的Tris-Cl缓冲液，超声波破碎得菌体破碎液，将菌体破碎液在4℃条件下，10000g 离心30min，保留上清液。将上清液进行超速离心，在4℃、100000 g条件下，离心60min，再次弃去沉淀，所得上清液即为粗酶液。

2.3 酶活力的测定

以甲基对硫磷为底物测定甲基对硫磷水解酶酶活力。反应体系中分别加入950μl 25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液、50μg甲基对硫磷以及50μl粗酶液，40℃保温5min；然后加入1mL 10% 的三氯乙酸溶液终止反应，再加入1mL 10%的 Na₂CO₃溶液显色，在波长405nm处测定OD值，计算对硝基苯酚的生成量，1个酶活单位定义为每分钟生成1μmol 对硝基苯酚所需的酶量。

2.4 酶的分离纯化

（1）(NH₄)₂SO₄沉淀

基于粗酶液中甲基对硫磷水解酶的初始量较低，首先采用(NH₄)₂SO₄盐析去除杂质蛋白。向粗酶液中加入pH8.0的100%饱和(NH₄)₂SO₄溶液，使其最终饱和度分别为40%，50%，60%，80%；缓慢振荡20min，10000g 离心30min，保留上清液。为了去除残余的(NH₄)₂SO₄，将上清液透析到25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液中（截留分子量3000），时间2h，然后分别取样测定酶活力。

（2）Mono Q 阴离子交换层析

将(NH₄)₂SO₄沉淀后的酶液进一步采用Mono Q 阴离子交换柱分离纯化。首先采用25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液平衡Mono Q 阴离子交换柱，然后采用梯度洗脱，A泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl，0.2 M NaCl，B泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl，1M NaCl，流速0.5mL/min，每0.5mL收集一管并取样测定酶活力。

2.5 SDS-PAGE电泳分析

采用SDS-PAGE电泳。10%分离胶（1.5M pH8.8 Tris-Cl、0.4%SDS缓冲溶液1.25mL，30%丙烯酰胺溶液1.7mL，水2.05 mL，10%过硫酸铵溶液50μl，TEMED 5μl），4%浓缩胶（0.5M pH8.8 Tris-Cl、0.4%SDS缓冲溶液1.25mL，30%丙烯酰胺溶液0.65mL，水3.1 mL，10%过硫酸铵溶液50μl，TEMED 5μl）考马斯亮蓝R250染色，醋酸-甲醇脱色液脱色。

3 结果

3.1 不同培养温度对产酶的影响

采用酶诱导培养基，分别在16℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃以及48℃条件下培养菌体，培养时间36h，制备粗酶液并测定酶活力。结果发现，在37-40℃范围内，菌体具有较高的产酶能力，低于25℃或超过45℃，菌株的产酶能力明显下降。参照图1。

3.2 不同培养基pH值对产酶的影响

采用酶诱导培养基，调节pH值分别为4、5、6、7、8、9，考察初始pH对产酶的影响，培养温度37℃，培养时间36h，制备粗酶液并测定酶活力。结果发现，在pH值6-8范围内，菌体具有较高的产酶能力，pH值低于5或超过8，菌体的产酶能力明显下降。参照图2。

3.3 酶的分离纯化

（1）采用(NH₄)₂SO₄盐析去除杂质蛋白，然后测定上清液的酶活力，结果如下表：

Figure 2013102207666100002DEST_PATH_IMAGE001

由上表可知，采用40%-50%饱和(NH₄)₂SO₄溶液可以去除一些杂质蛋白，甲基对硫磷水解酶则保留在溶液中；而采用80%饱和(NH₄)₂SO₄溶液，甲基对硫磷水解酶的析出量接近90%。为了后续Mono Q 阴离子交换柱的纯化，采用50%饱和(NH₄)₂SO₄溶液去除部分杂质蛋白。

（2）为了提高纯化效果，样品进样后，首先采用25mM pH8.0 的Tris-Cl，0.2 M NaCl溶液洗脱去除部分杂质蛋白，然后梯度洗脱，收集并测定酶活力。酶在0.3-0.4M NaCl浓度下被洗脱下来。

（3）酶的纯化效果以及分子量测定

采用SDS-PAGE电泳技术检测(NH₄)₂SO₄盐析、Mono Q 阴离子交换的纯化效果，结果如图所示。由该电泳图可见，经过(NH₄)₂SO₄盐析去除杂质蛋白以及Mono Q 阴离子交换柱的纯化，可以获得初步纯化的酶，其分子量约为40kDa。参照图3。

3.4酶的基本性质

将以上纯化步骤后得到的酶，超滤管浓缩后(截留分子量10kDa)，4℃保存备用。

（1）酶的最适反应温度

将酶反应体系分别置于不同温度下进行，测定酶的活力。结果表明，酶在35-45℃范围内都具有较高的活力，超过50℃，酶的活力开始下降。参照图4。

（2）酶的最适反应pH

将酶液置于不同pH的25 mM Tris-Cl缓冲液中，测定酶的活力。结果表明，酶在pH 7.0-8.5范围内都具有较高的活力。pH值低于6或高于9，酶的活力下降明显。参照图5。

（3）金属离子、二硫苏糖醇DTT 以及乙二胺四乙酸EDTA对酶活的影响

选取多种金属离子，分别在2mM浓度下测定酶的活力。结果表明，K⁺，Fe³⁺，Mg²⁺能够促进酶的活性，而Cu²⁺、Ag⁺、Ca²⁺对酶的活性具有抑制作用。

在酶反应体系中添加1mM的二硫苏糖醇DTT溶液，测定二硫苏糖醇DTT对酶活力的影响，结果表明，1mM的二硫苏糖醇DTT能够促进酶的活性。

在酶反应体系中添加0.1mM的乙二胺四乙酸EDTA溶液，测定乙二胺四乙酸EDTA对酶活力的影响，结果表明，0.1mM的乙二胺四乙酸EDTA同样能够促进酶的活性。

4 酶的应用

海洋细菌LYG01不仅能够高效降解甲基对硫磷，该细菌还能够降解乙基对硫磷；表明海洋细菌LYG01所产甲基对硫磷水解酶能广泛应用于对硫磷类农药的降解。酶在温度35-45℃、pH 7.0-8.5范围内都具有较高的活力，由此可见，酶比菌体适应范围更广，具有更好的实际应用价值。

酶在自然条件下对甲基对硫磷的降解实验。10mL酶反应体系中加入1mL粗酶液、10μL甲基对硫磷乳油（50%），9mL陈海水，40℃保温12、24、36h，测定总磷和可溶性磷含量，计算降解率。结果表明，酶处理36h后，农药的降解率接近90%，说明该酶在自然条件下同样具有较高的活力。

Figure 2013102207666100002DEST_PATH_IMAGE003

与现有技术相比，本发明方法可操作性强，所产的酶比菌体适应范围更广，酶在自然条件下同样具有较高的活力，农药的降解率接近90%，具有更好的实际应用价值。

附图说明

图1为不同培养温度对产酶的影响图；

图2为不同培养基pH值对产酶的影响图；

图3为酶的纯化效果图；其中：泳道1为(NH₄)₂SO₄盐析去除杂质蛋白；泳道2为Mono Q 阴离子交换柱的纯化；

图4为酶的最适反应温度图；

图5为酶的最适反应pH图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，1．一种海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法，其特征在于，其步骤如下：

Claims

1.一种海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法，其特征在于，其步骤如下：