CN103316333A - 一种具有广谱肿瘤细胞杀伤活性的重组人溶菌酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种具有广谱肿瘤细胞杀伤活性的重组人溶菌酶及其用途。具体地,公开了一种重组人溶菌酶(ghLZ)的新用途,所述重组人溶菌酶与天然人溶菌酶完全一致,没有任何变异体。所述ghLZ不仅保留有天然人溶菌酶的广泛革兰氏阳性菌的杀菌活性,同时它还具有独特的广谱性体外肿瘤细胞杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体地涉及一种具有广谱肿瘤细胞杀伤活性的重组人溶菌酶及其用途。
背景技术
肿瘤细胞有三个显著的基本特征即:不死性,迁移性和失去接触抑制。此外,肿瘤细胞还有许多不同于正常细胞的生理、生化和形态特征。肿瘤细胞周期不受正常生长调控系统的控制,能持续的分裂与增殖。通常根据肿瘤的实质形态分化成熟程度和异型性大小来确定肿瘤的良恶性和肿瘤的恶性程度。恶性肿瘤生长迅速,可转移到身体其它部位,还会产生有害物质,破坏正常器官结构,使机体功能失调,甚至威胁生命。
肿瘤治疗的常规方法有手术、放疗和化疗三种。手术切除肿瘤的治愈率,取决于肿瘤的位置、大小和性质,有些肿瘤长在深部无法触及,或位于要害部位则不能用手术方法治疗。放疗就是用放射线(如X、γ射线)杀死肿瘤细胞,可以对肿瘤细胞进行外照射,也可以置入放射源进行体内照射,放疗也会杀上正常的增殖较快的细胞,引起感染、出血、粘膜炎、脱发等。化疗主要是使用一些化学类药物,例如,使用DNA合成抑制剂(如5-氟尿嘧啶)或细胞分裂抑制剂(如长春新碱、紫杉酚)之类的细胞毒制剂物来抑制肿瘤细胞,同样对所有分裂细胞具有杀伤作用,因而也会引起上述副作用。
目前也使用了一些用于抑制肿瘤生长的蛋白类药物,如内皮抑素(Endostatin),对多种实体瘤的生长和转移都能产生抑制作用。
人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)是机体内非特异性免疫的重要组分,它广泛存在于外分泌液、多形性细胞和巨噬细胞内。溶菌酶能水解革兰氏阳性细菌胞壁的乙酰氨基多糖,使细胞壁破坏而导致细菌死亡,在体内补体等因素的作用下对多种革兰氏阴性菌也具有较强的抑菌作用,临床前数据表明它对1040株致病菌具有抗菌活性。溶菌酶可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活,因此,该酶具有抗菌、消炎、抗病毒作用。
研究表明,有许多种不同生物体会产生溶菌酶,近20年来国内外已开发出不同来源的新型溶菌酶。然而,各自不同的溶菌酶除了具有共同的溶菌特性之外,其他特性存在很大差异或各不相同。虽然有关于溶菌酶用于治疗肿瘤的研究,但是这些药理研究主要限于从蛋清中提取的蛋清溶菌酶,研究结果仅发现蛋清溶菌酶可作为一种较强的免疫调节因子用于预防和治疗恶性肿瘤,并没有发现其对肿瘤细胞的生长有直接抑制作用。
总之,迄今尚未发现人溶菌酶对肿瘤细胞有直接杀伤作用并应用于抗肿瘤研究的报道,更没有将人溶菌酶可用于直接预防和治疗肿瘤的报道。
发明内容
本发明提供了一种重组人溶菌酶的新用途,用于制备(a)预防或抑制人肿瘤生长、转移或人肿瘤细胞增长、迁移的药物组合物,或(b)诱导人肿瘤细胞凋亡的药物组合物,或(c)人肿瘤细胞的凋亡诱导剂。
本发明提供了一种体外抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的方法。
本发明提供了一种预防或抑制哺乳动物肿瘤生长、转移或肿瘤细胞增长、迁移的方法。
本发明还提供了一种测定待测人溶菌酶样品的活性的方法。
本发明第一方面提供了一种重组人溶菌酶的用途,用于制备
(a)治疗人肿瘤的药物,或抑制人肿瘤细胞的药物组合物,或抑制肿瘤或肿瘤细胞的抑制剂;或
(b)诱导人肿瘤细胞凋亡的药物组合物,或诱导人肿瘤细胞的凋亡诱导剂。
在另一优选例中,所述的抑制包括抑制人肿瘤的生长或转移,以及抑制人肿瘤细胞的生长或迁移。
在另一优选例中,所述重组人溶菌酶来源于转基因哺乳动物的乳汁。
在另一优选例中,所述转基因哺乳动物为山羊、绵羊、牛、猪、鼠或兔。
在另一优选例中,所述转基因哺乳动物为山羊。
在另一优选例中,所述重组人溶菌酶对正常的人血管内皮细胞无或基本无杀伤作用。
在另一优选例中,所述的重组人溶菌酶对正常的人血管内皮细胞生长的抑制率≤20%。
在另一优选例中,所述肿瘤或者肿瘤细胞选自以下肿瘤或肿瘤细胞:黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白细胞过多症、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、牙龈癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌或膀胱癌。
在另一优选例中,所述肿瘤或肿瘤细胞选自以下肿瘤或其细胞:人胃癌、人卵巢癌、人肺癌、人白血病或人结肠癌。
在另一优选例中,所述药物组合物含有
(a)1-99wt%的重组人溶菌酶;
(b)药学上可接受的载体;和
(c)任选的肿瘤生长抑制剂。
在另一优选例中,所述重组人溶菌酶选自下组:
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的野生型(wild-type)人溶菌酶,或
(ii)将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,具有诱导人肿瘤细胞凋亡功能的由(i)衍生的多肽。
在另一优选例中,所述重组人溶菌酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的野生型人溶菌酶。
在另一优选例中,所述药物组合物是单方制剂或复方制剂,其中,复方制剂还包含选自下组的抗肿瘤药物:烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、长春花碱类、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素或促性腺激素-释放激素类似物。
在另一个优选例中,所述抗肿瘤药物选自下组的物质:5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇、多西紫杉醇、或其组合。
在另一优选例中,所述药物组合物的剂型包括:片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、或溶液剂。
在另一优选例中,所述药物组合物的用药方式包括:瘤内、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、滴眼、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
在另一个优选例中,所述用药方式包括:口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、滴眼、鼻腔喷雾、或口腔喷雾。
在另一个优选例中,所述用药方式包括:口服、静脉注射、或直肠灌注。
本发明第二方面提供了一种体外抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的方法,包括步骤:在培养体系中存在重组人溶菌酶的情况下,培养肿瘤细胞,从而抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡。
在另一优选例中,重组人溶菌酶选自下组:
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的野生型人溶菌酶;或
(ii)将SEQ ID NO.:1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,具有诱导人肿瘤细胞凋亡功能的由(i)衍生的多肽。
在另一优选例中,所述培养体系中重组人溶菌酶的浓度为0.01-10mg/ml,较佳地,0.1-5mg/ml,更佳地0.5-2mg/ml。
在另一优选例中,所述的肿瘤细胞是人肿瘤细胞,更佳地选自下组:人胃癌、人结肠癌、人白血病或人肺癌。
在另一优选例中,所述人肿瘤细胞的培养时间为20-100小时,较佳地为30-80小时,最佳地为48-72小时。
本发明第三方面提供了一种预防或抑制肿瘤生长、转移或肿瘤细胞增长、迁移的方法,包括步骤:将重组人溶菌酶或含有重组人溶菌酶的药物组合物施用于需要治疗的哺乳动物。
在另一优选例中,所述的哺乳动物是人。
在另一优选例中,重组人溶菌酶选自下组:
(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的野生型人溶菌酶;或
(ii)将SEQ ID NO.:1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,具有诱导人肿瘤细胞凋亡功能的由(i)衍生的多肽。
本发明第四方面提供了一种测定待测人溶菌酶样品的活性或浓度的方法,包括步骤:
(1)测定待测人溶菌酶样品对肿瘤细胞生长的抑制活性;
(2)将步骤(1)得到的所述待测样品的抑制活性与标准曲线或标准品的抑制活性进行比较,从而得出所述待测样品中人溶菌酶的活性或浓度。
在另一优选例中,所述的活性用蛋白酶活力单位(U)表示。
在另一优选例中,所述的标准曲线是如下制得的:
(2.1)测定已知浓度的重组人溶菌酶的标准品对肿瘤细胞生长的抑制活性;和
(2.2)将步骤(2.1)获得抑制活性与其对应的浓度绘制标准曲线。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为ghLZ的纯化过程中各个样品的SDS-PAGE图。1、低分子量蛋白标记(marker);2、脱脂奶;3、酸沉淀去酪蛋白后乳清;4、上样;5、穿液;6、纯化产物。
图2为ghLZ纯品的HPLC检测图。
图3为MTT法检测ghLZ对人胃癌MGC-803细胞的作用的图。
图4为MTT法检测ghLZ对人胃癌BGC-823细胞的作用的图。
图5为MTT法检测ghLZ对人结肠癌HCT-116细胞的作用的图。
图6为MTT法检测ghLZ对人结肠癌HT-29细胞的作用的图。
图7为MTT法检测ghLZ对人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的作用的图。
图8为MTT法检测ghLZ对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的作用的图。
图9为MTT法检测ghLZ对中国仓鼠卵巢细胞CHO的作用的图。
图10为MTT法检测ghLZ对人脐静脉内皮细胞HUVEC的作用的图。
图11为肿瘤细胞形态变化图。
图12为ghLZ不同作用时间对肿瘤细胞杀伤活性的比较。
图13为人溶菌酶和鸡溶菌酶纯度对比(SDS-PAGE)。M为蛋白分子量标记;1为重组人溶菌酶;2为鸡蛋清溶菌酶
图14为重组人溶菌酶和鸡蛋清溶菌酶对HL-60的抑制率比较。A为重组人溶菌酶作用72小时的结果;B为重组人溶菌酶作用48小时的结果;C为鸡蛋清溶菌酶作用72小时的结果。
具体实施方式
本发明人通过长期而深入的研究,意外地发现了人溶菌酶,不仅保留有天然人溶菌酶的广泛革兰氏阳性菌的杀菌活性,同时它还具有独特的广谱性体外肿瘤细胞的直接杀伤活性,而对正常人血管内皮细胞作用微弱,且对哺乳动物的发育或泌乳量几乎完全没有影响。在此基础上,发明人完成了本发明。
术语
活性成分
如本文所用,术语“活性成分”是指本发明所述的重组人溶菌酶。
本文所用“重组人溶菌酶”,优选自下组:(i)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的野生型(wild-type)人溶菌酶;或(ii)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,具有诱导人肿瘤细胞凋亡功能的由(i)衍生的多肽。
所述重组人溶菌酶可以利用转基因技术在哺乳动物(如山羊)乳腺中表达,其在乳汁内有很高表达水平。优选地,所述重组人溶菌酶在山羊乳汁内表达水平平均为2.5g/L或更高。
药物组合物
由于本发明所述的重组人溶菌酶具有优异的对肿瘤细胞生长的抑制活性,因此本发明所述的重组人溶菌酶以及含有本发明所述的重组人溶菌酶为主要活性成分的药物组合物可用于(a)预防或抑制肿瘤生长、转移或肿瘤细胞增长、迁移,或(b)诱导人肿瘤细胞凋亡。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明所述的重组人溶菌酶及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是:重组人溶菌酶的量足以明显改善病情,而不至于产生严重的副作用。通常,药物组合物含有1-2000mg本发明所述的重组人溶菌酶/剂,更佳地,含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地,所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质,它们适合于人使用,而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份之间以及各组份和本发明所述活性成分能相互掺和,而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
施用方法
本发明所述的重组人溶菌酶或其药物组合物的施用方式没有特别限制,代表性的施用方式包括(但并不限于):口服、瘤内、直肠、和肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中,活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合,如柠檬酸钠或磷酸二钙,或与下述成分混合:(a)填料或增容剂,例如,淀粉、乳糖、蔗糖、和硅酸;(b)粘合剂,例如,羟甲基纤维素、明胶、蔗糖和阿拉伯胶;(c)保湿剂,例如,甘油;(d)崩解剂,例如,琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、和碳酸钠;(e)缓溶剂,例如石蜡;(f)吸收加速剂,例如,季胺化合物;(g)润湿剂,例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯;(h)吸附剂,例如,高岭土;和(i)润滑剂,例如,滑石、硬脂酸钙、十二烷基硫酸钠,或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中,剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备,如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂,并且,这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时,活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外,液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂,如水或其它溶剂,增溶剂和乳化剂,例知,乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油,特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外,组合物也可包含助剂,如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外,悬浮液可包含悬浮剂,例如,乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液,和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明所述的重组人溶菌酶可以单独给药,或者与其他药学上可接受的化合物(或肿瘤抑制剂)联合给药。
所述其他药学上可接受的化合物包含选自下组的抗肿瘤药物:烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、长春花碱类、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及或促性腺激素-释放激素类似物。
优选地,所述抗肿瘤药物选自下组的物质:5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇、多西紫杉醇、或其组合。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明所述的重组人溶菌酶适用于需要治疗的哺乳动物(如人),其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量,对于60kg体重的人而言,日给药剂量通常为1~2000mg,优选20~500mg。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
重组人溶菌酶的生产
生物技术的发展为重组人溶菌酶的生产提供了有效途径,通过基因工程的手段,构建乳腺反应器,能够在哺乳动物的乳汁中大量获得人溶菌酶蛋白,当然本领域的技术人员可以使用通用的方法在哺乳动物中生产人溶菌酶。
可用于本发明的人溶菌酶没有特别限制,可以是天然人溶菌酶,也可以是重组表达的人溶菌酶,本发明的哺乳动物可以是人、牛、羊、鼠或兔。
对于重组生产人溶菌酶而言,可以使用原核或真核细胞宿主细胞,也可以构建乳腺反应器生产重组溶菌酶。
较佳地,采用乳腺反应器技术获得含重组人溶菌酶的乳汁。例如,在申请号为CN200510110772.1的中国发明专利中,提供了一种在山羊乳汁中高效表达人溶菌酶蛋白的方法:首先构建人溶菌酶(hLZ)的乳腺特异性表达构件,所述构件包括但不限于:β乳球蛋白基因的5’调控序列、溶菌酶基因组DNA的全部序列。在另一优选例中,所述特异性表达构件还可以包括polyA加尾信号、抗性标记等。用含有hLZ的转基因细胞作为供核,山羊的卵母细胞作为供质,进行细胞克隆。对成活的克隆羊进行PCR和Southern-Blot分析,确认是否为转基因溶菌酶的山羊。对获得的转基因山羊进行人工激素泌乳诱导,收集乳汁,从而获得含有溶菌酶的原料。
重组人溶菌酶的纯化
重组人溶菌酶的纯化方法可以是本领域中任何适用于重组人溶菌酶纯化的方法。
优选地,可以包括(但不限于)如下步骤:
(1)原料及初步处理
适用于本发明的含溶菌酶的原料没有特别限制,代表性的例子包括(但并不限于):含溶菌酶的羊乳汁、含溶菌酶的牛乳汁。含溶菌酶的原料一般需要进行初步处理以便获得含有溶菌酶的脱脂乳清。
对于乳汁原料来说,一般使用离心的方法进行初处理,离心条件没有特限制,在一个优选例中,0-4℃低温离心,8000-10000rpm条件下,离心15-30分钟,下层为杂质,中层为含有溶菌酶的脱脂乳清,上层为脂肪,取中层进行下一步处理。
(2)离子交换法和阳离子树脂
离子交换法(ion exchange process)是液相中的离子和固相中离子间所进行的一种可逆性的化学反应,它是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术,具有简便、高效、成本低,且可自动化连续操作的优点。
阳离子树脂与溶菌酶的结合是一种典型的离子交换反应,阳离子树脂的反应基团包括但不限于:磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)等。适用于本发明的阳离子树脂可以是强酸性阳离子交换树脂(如-SO3H型)和弱酸性阳离子交换树脂(如-COOH,-OH型)。
一种优选的阳离子树脂是724树脂。724树脂是一种大孔弱酸性的阳离子交换树脂,主要成分为聚酰胺,含有-COOH基团,具有交换容量高、洗脱速度快、机械强度高、抗有机物污染能力强、再生能力好、价格低廉的特点。
724树脂使用前需要进行前处理,使用后可以进行再生。本发明提供了一种724树脂前处理方法,包括步骤:
(i)纯水洗涤树脂,得到无杂质的724树脂;
(ii)对步骤(i)处理后的树脂,用NaOH进行搅拌浸泡;
(iii)纯水洗涤步骤(ii)得到的树脂;
(iv)对步骤(iii)获得的树脂,用HCl进行搅拌浸泡;
(v)纯水洗涤步骤(iv)得到的树脂;
(vi)对步骤(v)获得的树脂,用NaOH进行搅拌浸泡;
(vii)纯水冲洗步骤(vi)获得的树脂;
(viii)用缓冲液处理步骤(vii)得到的树脂,获得待用的724树脂。
此外,本发明还提供了一种724树脂再生的方法,HCl溶液搅拌浸泡用过的724树脂,然后用纯水进行清洗,对得到的清洗后的树脂,用NaOH溶液进行浸泡处理,用纯水对NaOH处理后的树脂进行清洗,获得再生树脂。
(3)膜超滤技术
超滤技术通过膜表面的微孔结构对大小不同的物质进行选择性分离。当液体混合物在一定压力下流经膜表面时,小分子溶质透过膜(称为超滤液),而大分子物质则被截留,使原液中大分子浓度逐渐提高(称为浓缩液),从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。
与传统分离方法相比,超滤技术具有以下特点:
1.分离过程是在常温下进行,过滤条件温和,不会破坏超滤液和透过液的成分,特别适宜对热敏感的物质,如药物、酶等的分离、分级、浓缩与富集。
2.分离过程不发生相的变化,无需加热,能耗低,无需添加化学试剂,无污染。
3.超滤技术分离效率高,对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。
4.超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力,因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。
优选地重组人溶菌酶的纯化可以包括步骤:
1.将含有人溶菌酶的转基因哺乳动物(如山羊)乳汁冷冻离心,脱脂,去除沉淀杂质和上层的脂肪,取中间层液体用脱脂乳纱布过滤后,得到脱脂乳清。
2.向上述脱脂乳清加入缓冲液(如20mM PB缓冲液,pH7.4),调节pH(如调至约4.6)后,冷冻离心脱酪蛋白,收集上层脱脂脱酪的乳清,再调节pH(如调至约7.4),再次离心去除沉淀,过滤后,得到脱脂脱酪的乳清。
3.SP固相柱处理:将上述脱脂脱酪的乳清经滤膜(如0.22μm的滤膜)过滤后准备上柱。上样结束后用缓冲液(如200mM NaCl,20mM PB缓冲液,pH7.4)过柱,得到含有纯化后乳清的收集液。
4.将收集液经超滤管(如3kDa的)离心浓缩脱盐,得到含有重组人溶菌酶样品。上述样品经SDS-PAGE和HPLC分析,确认为纯品。
重组人溶菌酶对细胞的体外实验
重组人溶菌酶对细胞的体外实验的操作方法可以是本领域任何适合所述体外抑制实验的方法。
优选地,可以包括步骤:在培养体系中存在重组人溶菌酶的情况下,培养肿瘤细胞,从而抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡。
所述培养体系中重组人溶菌酶的浓度为0.01-10mg/ml,较佳地,0.1-5mg/ml,更佳地0.5-2mg/ml。
所述的肿瘤细胞是人肿瘤细胞,更佳地选自下组:人胃癌、人结肠癌、人白血病或人肺癌。
所述人肿瘤细胞的培养时间为20-100小时,较佳地为30-80小时,最佳地为48-72小时。
所述培养体系可以采用RPMI 1640培养基、IMDM培养基或DMEM培养基。
优选地,本发明所述重组人溶菌酶对细胞的体外实验,包括以下步骤:
1.调整细胞(如人胃癌MGC-803细胞)密度,在96孔培养板中加入一定量的上述细胞溶液(如50-100μL),用培养液(如RPMI 1640培养液或IMDM培养液)稀释ghLZ冻干粉至终浓度(如8mg/mL),滤膜(如0.22μm的滤膜)过滤除菌。
2.用培养液稀释(如4倍稀释)后,每孔加入一定体积的上述细胞溶液(如50μL-100/μL孔),每个浓度三个平行。
3.顺铂(如1mg/mL)为阳性对照,正常培养液为阴性对照。
4.96孔培养板四周孔中加入水或PBS减少边缘孔中液体蒸发。37℃、5%CO2培养,其间注意观察。一段时间(如72h或48h)后,避光加入MTT(母液浓度5mg/mL)10μL-20μL/孔,继续培养4h,弃去上清,加入DMSO 150μL/孔,充分溶解后读取570nm(参考波长630nm)波长的光密度值,分别为OD570和OD630,并计算抑制率或者存活率。
按下列公式计算细胞存活率:
存活率=(实验孔OD570-OD630)/(阴性对照OD570-OD630)×100%,
抑制率=1-存活率
其中,所述培养液的配置方法按照本领域常规的方法配置。
待测人溶菌酶样品活性测定
本发明所述的活性用蛋白酶活力单位(U)表示。通常溶菌酶活力单位的测定以标准溶菌酶的检测条件为固定的标准测定条件。在25℃,pH=6.24条件下,每分钟能使溶壁小球菌悬浮液在450nm处的吸光度下降0.001,为1个蛋白酶活力单位(U)。
本发明所述待测人溶菌酶样品活性或浓度测定,包括(但不限于)步骤:
(a)测定待测人溶菌酶样品对肿瘤细胞生长的抑制活性;
(b)将步骤(a)得到的所述待测样品的抑制活性与标准曲线或标准品的抑制活性进行比较,从而得出所述待测样品中人溶菌酶的活性或浓度。
优选地,所述的标准曲线是如下制得的:(i)测定已知浓度的重组人溶菌酶的标准品对肿瘤细胞生长的抑制活性;和(ii)将步骤(i)获得抑制活性与其对应的浓度绘制标准曲线。
本发明的主要优点有:
(1)本发明提供了一种重组人溶菌酶的新用途,用于制备(a)预防或抑制人肿瘤生长、转移或人肿瘤细胞增长、迁移的药物组合物,或(b)诱导人肿瘤细胞凋亡的药物组合物,或(c)人肿瘤细胞的凋亡诱导剂,所述重组人溶菌酶可利用转基因技术在山羊乳腺中表达,与天然人溶菌酶完全一致,没有任何变异体,不易产生导致病人死亡的有毒物质。不仅保留有天然人溶菌酶的广泛革兰氏阳性菌的杀菌活性,同时它还具有独特的广谱性体外肿瘤细胞杀伤活性。
(2)本发明提供了一种体外抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的方法。
(3)本发明提供了一种预防或抑制哺乳动物肿瘤生长、转移或肿瘤细胞增长、迁移的方法。
(4)本发明还提供了一种测定待测人溶菌酶样品的活性的方法。
下面结合具体实施,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例
1.试验材料
1.1 细胞株
实验涉及的所有细胞株均购自上海中科院细胞库。
1.2 主要试剂材料:
DMEM、IMDM、RPMI 1640、MTT、顺铂、DMSO、SP-sepharose柱、3KDa超滤管。
1.3 主要仪器设备
二氧化碳培养箱、超净工作台、显微镜、离心机、酶标仪、水浴锅。
1.4 主要试剂的配制:
MTT:称0.5g MTT粉末溶于100mL PBS中,0.22μm滤膜过滤,1mL分装,-20℃避光保存。配制过程中注意避光。
实施例1
转基因羊产生的人溶菌酶(简称为ghLZ)及其纯化
人溶菌酶转基因山羊羊奶(其制备过程同CN200510110772.1)400mL,4℃冷冻离心,8000-10000rpm,离心15-30min脱脂。去除沉淀杂质和上层的脂肪,取中间层液体用脱脂乳纱布过滤后得到脱脂乳清(SDS-PAGE分析如图1中泳道2所示)300mL。向其中加入等体积的20mM pH7.4的PB缓冲液,调节pH至4.6,40℃水浴30min。4℃冷冻离心,8000-10000rpm,离心15-30min脱酪蛋白。收集上层脱脂脱酪的乳清(SDS-PAGE分析如图1中泳道3所示),NaOH调节pH至7.4,再次离心去除沉淀,纱布过滤后收集。
SP柱(柱体积5mL)处理:5个柱体积的1M NaCl,20mM PB,pH7.4和5个柱体积的20mM PB,pH7.4依次过柱,将脱脂脱酪的乳清经0.22μm滤膜过滤后得到准备上柱的样品(SDS-PAGE分析如图1中泳道4所示)。上样结束后依次用10个柱体积的20mM PB,pH7.4和5个柱体积的200mM NaCl,20mM PB,pH7.4过柱,最后用10个柱体积的1M NaCl洗脱,将收集液(SDS-PAGE分析如图1中泳道5所示)经3kDa的超滤管4500rpm 25min离心浓缩脱盐,缓冲液替换为生理盐水。纯品经SDS-PAGE和HPLC分析(如图1中泳道6和图2所示),纯化蛋白纯度>95%。其氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
将所述纯品按常规方法制成ghLZ冻干粉,待用。
实施例2
ghLZ对人胃癌MGC-803细胞的体外抑制作用
调整人胃癌MGC-803细胞密度为1×104/mL,96孔培养板中加100μL即1000个/孔。RPMI 1640培养液稀释ghLZ冻干粉至终浓度8mg/mL,0.22μm滤膜过滤除菌。用RPMI 1640培养液4倍稀释为4mg/mL、1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.016mg/mL,50μL/孔。每个浓度三个平行。
同时顺铂(1mg/mL)为阳性对照、未加ghLZ的RPMI 1640组为阴性对照、培养液(无细胞)和药物组(无细胞)为空白对照,96孔培养板四周孔中加入水减少边缘孔中液体蒸发。37℃、5%CO2培养,其间注意观察。72h后,避光加入MTT 20μL/孔,继续培养4h,小心弃去上清,加入DMSO 150μL/孔,充分溶解后读取OD570(参考波长OD630)。计算抑制率。
结果如图3所示,在1mg/mL时抑制率为51.66%,大于50%,判定为有活性。
实施例3
ghLZ对人胃癌BGC-823细胞的体外抑制作用
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人胃癌BGC-823细胞。
结果如图4所示,在1mg/mL时抑制率为50.24%,大于50%,判定为有活性。
实施例4
ghLZ对人结肠癌HCT-116细胞的体外抑制作用
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人结肠癌HCT-116细胞。
结果如图5所示,在1mg/mL时抑制率为60.20%,大于50%,判定为有活性。
实施例5
ghLZ对人结肠癌HT-29细胞的体外抑制作用
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人结肠癌HT-29细胞。
结果如图6所示,在1mg/mL时抑制率为67.22%,大于50%,判定为有活性。
实施例6
ghLZ对人早幼粒白血病细胞HL-60的体外抑制作用
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人早幼粒白血病细胞HL-60,调整细胞密度为1.4×105/mL,96孔培养板中加25μL即3500个/孔。用IMDM培养液稀释,CO2培养48h。
结果如图7所示,在1mg/mL时抑制率为66.12%,大于50%,判定为有活性。
实施例7
ghLZ对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的体外抑制作用
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人大细胞肺癌NCI-H460细胞。
结果如图8所示,在1mg/mL时抑制率为95.53%,大于50%,判定为有活性。
实施例8
ghLZ对中国仓鼠卵巢细胞CHO的体外抑制作用
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO,调整细胞密度为4×104/mL,96孔培养板中加100μL即4000个/孔,3h贴壁后,用DMEM培养液稀释,100μL/孔,CO2培养48h。
结果如图9所示,在1mg/mL时抑制率为21.68%,这表明ghLZ对永生化但非癌变的中国仓鼠卵巢细胞CHO的直接杀伤活性很微弱。
实施例9
ghLZ对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外抑制作用。
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人脐静脉内皮细胞HUVEC,调整细胞密度为5×104/mL,96孔培养板中加100μL即5000个/孔,用DMEM培养液稀释为2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL,CO2培养20h。
结果如图10所示,在1mg/mL时抑制率为17.80%,小于50%,判定为无活性。这表明,ghLZ对人脐静脉内皮细胞基本无杀伤活性。
实施例10
ghLZ作用于肿瘤细胞引发的细胞形态学变化。
所有肿瘤细胞均发生一致的形态学变化,表现为细胞圆缩、破裂,细胞碎片使视野背景变暗。结果如图11所示。
实施例11
ghLZ不同作用时间对肿瘤细胞杀伤活性的比较
我们选用了人大细胞肺癌NCI-H460对作为试验株系用于检测ghLZ不同作用时间对肿瘤细胞杀伤活性的比较。
结果如图12所示,加入不同剂量的ghLZ,在48和72小时的最终作用效果无显著差异。
实施例12
ghLZ对白血病L1210体内抑制作用
模型构建:小鼠腹腔接种小鼠白血病L1210细胞,制备小鼠白血病模型,用于ghLZ体内药效试验。L1210经腹水活化后,腹腔接种于Balb/c小鼠。106/mL细胞浓度,0.5ml/只。
分组给药:腹腔接种白血病L1210细胞后24小时,按表1给药。
实验分为5组,每组10只老鼠。
一组为阴性:腹腔注射生理盐水,不给药。
其余4组分别按如下剂量腹腔注射给药:
(1)50mg/kg/次,1次/天;
(2)100mg/kg/次,1次/天;
(3)200mg/kg/次,1次/天;
(4)100mg/kg/次,2次/天。
实验结果:小鼠单独给药和单独接种肿瘤都没有发现严重的毒性反应。各组ghLZ给药的小鼠生存期均有显著延长,延长率在10-25%之间,其中100mg/kg,一天两次给药组的延长率最大,为25.06%。结果见表1。
表1.ghLZ对白血病L1210体内抑制作用
实施例13
测定人溶菌酶活性或浓度
13.1 测定不同浓度的重组人溶菌酶标准品对肿瘤细胞的抑制率
方法同实施例7所述,分别测得已纯化的重组人溶菌酶(纯化步骤如实施例1)在不同浓度或不同酶活力单位下对人大细胞肺癌NCI-H460细胞(也可用其他人肿瘤细胞代替。)的抑制率。
13.2绘制标准曲线:以重组人溶菌酶浓度(mg/mL)或其酶活力单位(U)为X轴,以测得对应的抑制率为Y轴,绘制“浓度-抑制率”或“酶活力单位-抑制率”标准曲线。
13.3 测定待测人溶菌酶样品对肿瘤细胞的抑制率
方法同13.1,测得待测样品中人溶菌酶对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的抑制率。
13.4 确定待测样品中人溶菌酶的浓度或活性
将步骤13.3测定的抑制率和13.2绘制的标准曲线比较,从而得到待测样品中人溶菌酶的浓度或活性。
实施例14
鸡蛋清溶菌酶(ewLYZ)和ghLZ的抑菌实验对比
1.1 鸡蛋清溶菌酶和ghLZ来源
将来自鸡蛋清的商品溶菌酶(SIGMA公司,L6876-1G,纯度如图13中泳道2所示)作为对照,与实施例1制备的利用来自转基因山羊乳汁中纯化来的重组人溶菌酶ghLZ(纯度如图13中泳道1所示),进行对比试验。
1.2 抑菌实验
供试品溶液的制备
取鸡蛋清溶菌酶或本发明的重组人溶菌酶ghLZ冻干粉,加磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g,加水溶解使成1000ml,调节pH值至6.2)适量使溶解,并稀释成每1ml中含溶菌酶50μg的溶液。
底物悬浮液的制备
称取溶酶小球菌(Sigma,M3770-5G)15~20mg,加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5~1ml,在研钵内研磨3分钟,再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量,使总体积约为50ml,使悬浮液于25±0.1℃时,在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。
精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3ml,置1cm比色池中,在450nm的波长处测定吸收度,作为零秒的读数A<[0]>,然后精密量取25±0.1℃的供试品溶液0.15ml(两种溶菌酶浓度均为50μg/ml),加到上述比色池中,迅速混匀,用秒表计时,至60秒时再测定吸收度A;
同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.15ml,同上操作,做为空白试验,测得零秒的读数A′<[0]>及60秒的读数A′。
效价单位定义:在室温25℃、pH值6.2时,在波长450nm处,每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。按下式计算:
式中,W为测定液中供试品的重量(μg)。
结果:
如图13所示,两种溶菌酶均有较好的纯度。
活性检测结果如表2所示:重组人溶菌酶活性是鸡蛋清溶菌酶活性的2.9倍。
表2 鸡蛋清溶菌酶与ghLZ的效价比较(针对溶酶小球菌)
A′<[0]> | A′ | A<[0]> | A | 效价单位数U/mg | |
ghLZ | 0.7232 | 0.7207 | 0.7208 | 0.3599 | 47786.67 |
ewLYZ | 0.7227 | 0.7215 | 0.7278 | 0.6042 | 16320.00 |
实施例15
鸡(蛋清)溶菌酶和ghLZ对HL-60肿瘤细胞的体外抑制作用对比
2.1 鸡溶菌酶和ghLZ来源
同实施例14的1.1。
2.2 体外抑制实验
方法同实施例2,不同点在于,所述细胞为人早幼粒白血病细胞HL-60,调整细胞密度为1.4×105/mL,96孔培养板中加25μL即3500个/孔。用IMDM培养液稀释,CO2培养48h。用IMDM培养液稀释鸡蛋清溶菌酶和重组人溶菌酶至4mg/mL、1mg/mL、0.25mg/mL和0.0625mg/ml,作用48h和72h后,避光加入MTT10μL/孔,继续培养4h,离心后弃去上清,加入DMSO 100μL/孔,充分溶解后读取OD570(OD630),计算抑制率。
实验结果见图14,结果ghLZ在1mg/mL时的抑制率均大于50%,判定为有活性。与之相反,对照品蛋清溶菌酶1mg/ml时,对HL-60细胞株的72小时抑制率为0,判定为无活性。
实施例16
乳汁中高表达ghLZ对转基因山羊的泌乳性能的影响
试验对象:
试验组:6只ghLZ转基因整合羊(G0代2头、F1代2头、F2代2头);
对照组:2只转基因非整合羊(F2代)及3只普通奶山羊。
共计11只,羊只情况如表3所示,其中,编号5,6,7,8四只羊(F2代)为半同胞姐妹。
表3 乳汁成分检测羊只信息
编号 | 耳号 | 整合情况说明 | 代次 | 初乳时间 |
1 | ChLYZ4 | 整合 | G0 | 2011.2.20 |
2 | ChLYZ6 | 整合 | G0 | 2011.4.16 |
3 | ChLYZ3-82 | 整合 | F1 | 2011.2.24 |
4 | ChLYZ6-18 | 整合 | F1 | 2011.3.19 |
5 | ChLYZ3-32 | 整合 | F2 | 2011.2.24 |
6 | ChLYZ3-92 | 整合 | F2 | 2011.3.25 |
7 | ChLYZ3-30 | 非整合 | F2 | 2011.2.23 |
8 | ChLYZ3-84 | 非整合 | F2 | 2011.2.17 |
9 | DG68 | 普通奶山羊 | / | 2011.2.22 |
10 | DG174 | 普通奶山羊 | / | 2011.3.12 |
11 | DG87 | 普通奶山羊 | / | 2011.4.2 |
试验方法:
试验羊自泌乳开始,每日无菌采集乳汁两次,用Corning 50mL离心管收集,至泌乳期结束。采集时间为上午(8:00)和下午(16:00);每次采集乳汁不少于30mL。
新鲜采集的乳汁-20℃冻存,每10天检测一次。羊乳成分分析利用LACTOSCAN乳成分分析仪检测,每个样品重复测定3次,取平均值,打印记录数据。
结果:
表4和表5分别为初乳和泌乳期其他阶段乳汁主要成分含量测定的结果。
由表4和表5可知,无论转基因羊还是正常羊乳成分的含量和变化是一致的。在1-4天的初乳中:乳糖、乳蛋白、SNF(非脂乳固体)含量逐渐降低,直至泌乳第4天后基本保持相对稳定水平;乳脂含量(平均7.1%)在第一天最高,第4天后含量稳定在3-5%内。乳糖、乳蛋白及SNF的含量变化趋势在泌乳期内比较一致,而乳脂肪含量变化与其他营养成分高低变化无太大关系。
表4 初乳主要营养成分含量
表5 泌乳期其他阶段乳汁主要营养成分含量
表6是综合不同泌乳阶段各营养成分含量,试验组与对照组平均含量如表6所示。
由表6可知,乳脂肪、SNF、乳糖和蛋白质含量在1-10天乳汁中试验组均略高于对照组,对其进行差异显著性分析,结果显示各营养成分在试验组与对照组之间差异均不显著(P>0.05);11-140天常乳中各成分除乳糖外,其他成分含量试验组均略低于对照组,差异显著性分析结果亦显示,两组间差异不显著。
表6 奶山羊泌乳期各阶段乳汁主要营养成分含量
可见,泌乳期间,ghLZ转基因羊乳汁中主要营养成分含量与正常非转基因羊的差异不显著,ghLZ的高含量表达对山羊乳腺的正常发育和泌乳性能无不良影响。
实施例17
药物组合物
在洁净的条件下,将重组人溶菌酶10.0g,投入配液器中,加入注射用水500mL,搅拌溶解,加入甘露醇1g溶解,加入0.3wt%针用炭搅拌均匀吸附热原,过滤脱炭,加水至足量,经0.22微米孔滤膜过滤,获得浓度为20mg/mL的重组人溶菌酶溶液,分装于7.0ml的西林瓶中,2.5ml/瓶,冷冻干燥,制成无菌冻干粉针剂。规格为5mg/瓶。
实施例18
ghLZ与5-FU联用对人胃癌BGC-823细胞的体外抑制作用
方法同实施例3,不同点在于,将1mg/mL的ghLZ与5-FU (浓度为5mg/L和10mg/L)联用。
结果表明,在联用情况下,对人胃癌BGC-823细胞生长的抑制率均大于60%,高于仅用ghLZ时的抑制率。
讨论:
1.实施例2-7的结果表明:ghLZ对人胃癌、结肠癌、早幼粒细胞白血病、肺癌等瘤株具有明显的增殖抑制作用,浓度剂量效应相似,IC50平均在0.5mg/ml左右。
2.实施例8-9的结果表明:ghLZ对正常细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO或人脐静脉内皮细胞HUVEC)没有抑制作用或抑制作用很小。
3.实施例10的结果表明:ghLZ对肿瘤细胞杀伤很迅速,通常作用24小时内即可导致敏感肿瘤细胞70-100%的活性抑制,72小时可观察到细胞大面积死亡,细胞裂解成碎片。细胞DNA电泳显示有明显的阶梯分布,说明ghLZ能够引发肿瘤细胞凋亡。
4.实施例11的结果表明:比较ghLZ不同作用时间对肿瘤细胞杀伤活性的,我们发现加入不同剂量的ghLZ,在48和72小时的最终作用效果无显著差异。
5.动物实验表明,ghLZ对白血病L1210负瘤小鼠有较好的治疗效果,尤其是,以100mg/kg,一天两次给药小鼠生存期可延长25.06%。
6.实施例14和实施例15的结果表明:重组人溶菌酶不仅具有抑菌活性,还具有非常优异的抑制肿瘤细胞生长的作用。
7.乳汁中高效表达ghLZ(2.4mg/ml)的转基因山羊乳腺发育和泌乳量均正常,目前已繁育至第5代,表明:生理条件下,ghLZ未对正常体细胞产生毒害作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种重组人溶菌酶的用途,其特征在于,用于制备
(a)治疗人肿瘤的药物,或抑制人肿瘤细胞的药物组合物,或抑制肿瘤或肿瘤细胞的抑制剂;或
(b)诱导人肿瘤细胞凋亡的药物组合物,或诱导人肿瘤细胞的凋亡诱导剂。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述重组人溶菌酶来源于转基因哺乳动物的乳汁。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述重组人溶菌酶对正常的人血管内皮细胞无或基本无杀伤作用。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述肿瘤或者肿瘤细胞选自以下肿瘤或肿瘤细胞:黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白细胞过多症、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、牙龈癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌或膀胱癌。
5.如权利要求1所述的用途,所述药物组合物含有
(a)1-99wt%的重组人溶菌酶;
(b)药学上可接受的载体;和
(c)任选的肿瘤生长抑制剂。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物组合物是单方制剂或复方制剂,其中,复方制剂还包含选自下组的抗肿瘤药物:烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、长春花碱类、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素或促性腺激素-释放激素类似物。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物组合物的剂型包括:片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、或溶液剂。
8.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物组合物的用药方式包括:瘤内、口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、滴眼、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
9.一种体外抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的方法,其特征在于,包括步骤:在培养体系中存在重组人溶菌酶的情况下,培养肿瘤细胞,从而抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述培养体系中重组人溶菌酶的浓度为0.01-10mg/ml,较佳地,0.1-5mg/ml,更佳地0.5-2mg/ml。
11.一种测定待测人溶菌酶样品的活性或浓度的方法,其特征在于,包括步骤:
(1)测定待测人溶菌酶样品对肿瘤细胞生长的抑制活性;
(2)将步骤(1)得到的所述待测样品的抑制活性与标准曲线或标准品的抑制活性进行比较,从而得出所述待测样品中人溶菌酶的活性或浓度。
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