CN103315985A - Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用 - Google Patents

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丁义涛
王忠夏
曹胤
江春平
李尔广
张广
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Nanjing Drum Tower Hospital
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Abstract

本发明公开了Fingolimod（代号FTY720）在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用，属于药物新用途技术领域。本发明通过建立人肝癌细胞裸鼠原位移植瘤模型，成瘤后随机分为对照组及Fingolimod治疗组，2周后处死，记录肿瘤大小及肝内转移情况，发现Fingolimod能够在肝癌原位移植瘤模型中可以抑制肝癌的增长并减少肝内转移。因此，Fingolimod可以用于制备抑制肝癌肝内转移的药物，具有良好的开发应用前景。本发明涉及Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的用途属于首次公开。

Description

Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用
技术领域
本发明涉及化合物Fingolimod的新用途，尤其涉及Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用。 
技术背景
Fingolimod（代号Fingolimod)，作为一种可以抑制淋巴细胞归巢的免疫抑制剂，已被美国FDA 批准其作为口服药用于治疗多发性硬化症 ( multiple sclerosis，MS)，以减少复发和延迟残疾进展。作用机制是Fingolimod在体内磷酸化，成为S1P的类似物，通过竞争性的与S1PR1结合从而抑制S1P的作用，发挥其免疫抑制和免疫调控功能。 
在肝癌的发生发展过程中，往往会发生肝内转移，从而实现逃避免疫、放化疗和利于自身的生长，肝癌肝内转移成为肝癌有效治疗和预后的一个重要障碍，因此能够找到一个对肝癌肝内转移具有抑制作用的化合物，具有重要的应用价值。我们的研究首次发现Fingolimod可以抑制肝癌肝内转移，因此Fingolimod可以用于制备抑制肝癌肝内转移药物。 
发明内容
本发明提供化合物Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用。 
本发明采用如下技术方案：Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用，Fingolimod的结构式如式（Ⅰ）所示： 
Figure DEST_PATH_GDA0000357297371
式（Ⅰ） 
本发明通过建立人肝癌细胞裸鼠原位移植瘤模型，成瘤后随机分为对照组及Fingolimod治疗组，2周后处死，记录肿瘤大小及肝内转移情况，发现Fingolimod能够在肝癌原位移植瘤模型中可以抑制肝癌的增长并减少肝内转移。因此，Fingolimod可以用于制备抑制肝癌肝内转移的药物，具有良好的开发应用前景。 
本发明涉及Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物的用途属于首次公开，具备突出 的实质性特点，同时用于肝癌的防治显然具有显著的进步。 
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。 
附图说明
图1是裸鼠人肝癌细胞原位移植瘤模型的建立过程。 
A 麻醉固定；B 纵行开腹；C 暴露肝脏；D 注射成瘤；E 连续缝合。 
图2是Fingolimod对肝脏原位移植瘤的影响，图A：对照组。 
图3是Fingolimod对肝脏原位移植瘤的影响，图B：Fingolimod治疗组。 
图4 Fingolimod治疗组与对照组有明显统计学差异。 
将治疗组与对照组肿瘤体积进行统计学分析：两组之间有明显统计学差异（P=0.006）。 
具体实施方式
 本发明所涉及化合物Fingolimod购买自R&D公司。 
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。 
实施例1：本发明所涉及化合物Fingolimod片剂的制备： 
取20克化合物Fingolimod，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。 
实施例2：本发明所涉及化合物Fingolimod胶囊剂的制备： 
取20克化合物Fingolimod，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000片。 
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。 
实验例：建立人肝癌细胞裸鼠原位移植瘤模型，观察Fingolimod在肝癌原位移植瘤模型中对肝癌的抑制和对肝内转移的抑制情况。 
一、材料与方法 
1、材料 
1.1 动物 Balb/c裸鼠12只，雄性，体重25g左右（由鼓楼医院动物中心提供） 
1.2 试剂 
1.3 细胞系 
人肝癌细胞系SMMC-7721 南京凯基生物科技发展有限公司，由本实验室焦洪波硕士以含10%胎牛血清高糖DMEM培养基培养后冻存于液氮中，人肝癌细胞系Huh7购买于湘雅医学院。 
2．实验方法 
2.1 细胞复苏、培养、传代、计数 
2.1.1 细胞复苏 
1、从液氮罐中取出细胞冻存管，放在事先准备好的37℃水浴恒温箱中尽快融化。 
2、紫外灯照射超净台20min，以滴管取出细胞悬液注入离心管中，滴加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液到10 ml，轻轻吹打。 
3、4℃下低速离心（1200 rpm）5min，弃去上清。 
4、离心后的细胞沉淀以含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液轻轻吹打混匀重悬，在37℃含95% O2、5% CO2培养箱里培养，24h后在超净台内弃去培养基，无菌PBS轻轻冲洗2次，重新加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养继续培养。 
2.1.2 细胞传代 
1、待培养瓶细胞密度达90%左右时弃去旧培养液，无菌PBS轻轻冲洗两次。 
2、加入适量0.25%胰酶溶液，润湿培养瓶后弃去多余胰酶，于培养箱放置2~3min，在显微镜下观察，当原来贴壁的细胞逐渐散开趋于圆形时加入适量含10%胎牛血清高糖DMEM培养基终止消化，滴管轻轻吹打使贴壁细胞脱落，加入离心管内。 
3、4℃下低速离心（1200 rpm）5min，弃去上清。 
4、 加入适量10%胎牛血清高糖DMEM培养基轻轻吹打重悬，分装到培养瓶中放入孵箱里继续培养。 
2.1.3  细胞计数 
1、酒精擦洗记数板和盖玻片后超净台内晾干。 
2、把盖玻片覆盖在计数板上，稍微移向一侧，露出记数板面少许。 
3、按照细胞传代步骤1-3步骤收集细胞沉淀。 
4、加入3ml高糖DMEM，用滴管轻轻反复吹打混匀细胞液。 
5、取干净记数板，用滴管稍微吹打细胞悬液后，立即用100ml枪吸取20ul细胞悬液从盖片边缘沾少许细胞悬液，使之充满记数板和盖玻片间的间隙，无气泡。 
6、镜下观察，要求细胞均匀分布各处。计算四角大格的细胞数。压中线者只记左侧和上方者，右和下不计算在内。 
7、然后按下公式计算：细胞数/毫升=四角大格细胞个数÷4×104×稀释倍数。 
2.2  裸鼠人肝癌细胞原位移植瘤模型的建立 
1．按第一部分方法培养并选取对数期SMMC-7721细胞，胰酶消化离心，PBS重悬细胞使得细胞浓度为1*108个/ml备用； 
2．将氯胺酮与地西泮1:1混匀，肌肉注射麻醉裸鼠，待翻正反射消失后固定于手术台上，连接维持麻醉吸管，备皮，常规消毒。 
3．于腹正中线剑突下作一长约1cm左右的纵行切口，暴露肝脏，轻挤双侧肋骨，挤出左肝叶，湿纱布垫于肝叶下方。 
4．用1ml 胰岛素注射器针头沿肝叶长轴方向与肝脏呈45°角斜刺入肝实质内，缓慢注入SMMC-7721细胞40μl，避免外溢。在注射时用棉棒将肝叶向上托起，约成30°角，可减少细胞悬液外溢。 
5．缓慢退出针头，用无菌棉棒压迫2~3min防止出血及细胞悬液反流。 
6．将肝脏轻柔回纳入腹腔，逐层缝合关腹（连续缝合）。 
7．术后置于暖灯下复温，小鼠苏醒后保温1~2h后继续予SPF级环境中饲养，自由饮水进食。 
2.3 裸鼠人肝癌细胞原位移植瘤模型的治疗 
2.31实验分组：原位移植瘤模型的建立一个月后，随机将裸鼠分为两组：治疗组腹腔注射5mg/（kg·day）的Fingolimod生理盐水溶液，对照组腹腔注射等量的DMSO对照，每天进行一次治疗，持续14天，观察裸鼠的活动情况。 
2.3.2 标本采集：14天后，麻醉处死裸鼠并完整取下肝脏，游标卡尺测量肿瘤大小 后将每块肿瘤分为两块，一块以甲醛固定，常温保存，另一块则置于RNAlatter中4°过夜，第二天置于液氮保存。 
二、实验结果 
1裸鼠人肝癌细胞原位移植瘤模型的建立 
本实验建立原位移植瘤模型使用12只裸鼠，术后第2天死亡1只，解剖未发现肿瘤形成，成瘤率92%。 
2裸鼠人肝癌细胞原位移植瘤模型的治疗 
裸鼠人肝癌原位移植瘤模型建立后，随机分为两组：Fingolimod组及对照组。结果可以发现，所有裸鼠均已成瘤，另外Fingolimod以5mg/(kg·day)腹腔注射14天后，肿瘤组织出现坏死，且体积明显减小（表1、图2B），肿瘤大小较对照组有明显差异（图3）。对照组发现3例肝内转移，Fingolimod组未见肝内转移（图2，表2）。 
表1 Fingolimod组与对照组原位移植瘤大小 
Figure DEST_PATH_GDA0000357297373
表2 Fingolimod组与对照组肝内转移数目 
Figure DEST_PATH_GDA0000357297374
由上述实施例表明，本发明公开了Fingolimod （代号Fingolimod）在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用，属于药物新用途技术领域。本发明通过建立人肝癌细胞裸鼠原位移植瘤模型，成瘤后随机分为对照组及Fingolimod治疗组，2周后处死，记录肿瘤大小及肝内转 移情况，发现Fingolimod能够在肝癌原位移植瘤模型中可以抑制肝癌的增长并减少肝内转移（由对照组60%的肝内转移率降到0%）。因此，Fingolimod可以用于制备抑制肝癌肝内转移的药物，具有良好的开发应用前景。本发明涉及Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的用途属于首次公开。 

Claims (1)

1.Fingolimod在制备抑制肝癌肝内转移药物中的应用，所述化合物Fingolimod结构如式（Ⅰ）所示：
Figure FDA0000319850331
式（Ⅰ）。
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