CN103290093A

CN103290093A - 一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法

Info

Publication number: CN103290093A
Application number: CN2013102736212A
Authority: CN
Inventors: 祁金龙; 张海林; 杜肖娜; 贾庆忠
Original assignee: Hebei Medical University
Current assignee: Hebei Medical University
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103290093B

Abstract

本发明公开了一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法，包括以下步骤：a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液；b）将待筛选化合物溶于孵育液制成阳性孵育液，对细胞进行孵育；c）孵育后，加洗涤液洗涤3-4次，然后加入通道打开液静置反应得反应液；d）在反应液中加入硝酸银溶液，混合均匀后避光静置24h，取上清液进ICR8000测定银离子浓度。本发明将待测化合物加在孵育阶段，通过改变进入细胞中氯离子的多少，来衡量离子通道的开闭情况，从而既增大了细胞中的氯离子浓度，也即增大了灵敏度，又避免了测试药物与银离子直接接触发生反应。本发明灵敏度高，测试结果准确可靠，并且操作简单易行，是一种具有较好优势的简易高效CaCCs通道调节剂筛选方法。

Description

一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法

技术领域

本发明涉及细胞通道调节剂筛选方法，具体涉及一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法。

背景技术

钙激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs）最初发现于爪蟾的卵母细胞中，其在内皮细胞、上皮细胞、血细胞等非兴奋细胞及心肌细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞等可兴奋细胞上均有广泛分布。CaCCs的生理功能包括：①作为氯离子通过上皮细胞的通道，改变细胞内外电化学梯度；②参与神经兴奋和心脏兴奋性的调节，在心肌动作电位的去极化过程中起重要作用；③TMEM16A在肿瘤细胞中高表达，是潜在的治疗靶点和肿瘤生物的标记物。2008年，三个研究小组几乎同时用不同方法独立指出TMEM16A是CaCCs的分子基础后，其成为众多研究者的焦点，TMEM16A或许会成为治疗多种人类疾病如囊性纤维性病、高血压、胃肠蠕动障碍、哮喘和肿瘤的新型药物靶点。从而，筛选、发现特异性的CaCCs离子通道调节剂（包括开放剂与阻断剂），无论是作为CaCCs离子通道伸入研究的工具，还是作为以CaCCs为靶点的创新药物加以开发都具有重要意义。

自上个世纪80年代以来，在生物物理学的基础上，并随着生命科学、现代药理学、计算机技术和自动化技术等领域的各种新型检测仪器的出现，逐渐形成一种综合性高新技术——高通量筛选技术。经过二十多年的不断发展与完善，该技术的已经成为依据反向药理学理论寻找、筛选针对目标靶点的特异化合物的一种重要手段。新进发现的CaCCs调节剂即来源于高通量筛选的结果，其采用的筛选方法主要有荧光YFP法和双电极电压钳技术。前者是将TMEM16A和卤素敏感蛋白YFP-H148Q/I152L共同表达于FRT细胞（大鼠甲状腺滤泡上皮细胞），然后通过读取细胞内荧光强度的变化来反应进入细胞内碘离子的多少。这种方法需要在细胞上同时表达两种质粒，实验繁杂且荧光数据准确性差。后者是由双电极电压钳技术测定非洲爪蛙卵母细胞上的内源性CaCCs通道的开放，这种方法存在内源性CaCCs选择性差，效率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种简易、高效的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，以解决现有方法实验繁杂、准确性差、效率低的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法，包括以下步骤：

a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液：

孵育液：称取或量取氯化钠50mmol、氯化钾100mmol、氯化镁1mmol、二水合磷酸二氢钠0.8mmol、氯化钙4mmol、Hepes10mmol和钙离子载体15μmol溶于去离子水中，定容至1000ml，然后用氢氧化钠溶液调pH值到7.4；

洗涤液：称取葡萄糖酸钠150mmol、葡萄糖酸钾5.4mmol，葡萄糖酸镁1mmol、二水合磷酸二氢钠0.8mmol和Hepes20mmol溶于去离子水中，定容至1000ml，然后用氢氧化钠溶液调pH值到7.4；

通道打开液：称取葡萄糖酸钠54mmol、葡萄糖酸钾100mmol，葡萄糖酸镁1mmol、葡萄糖酸钙4mmol、二水合磷酸二氢钠0.8mmol和Hepes20mmol溶于去离子水中，定容至1000ml后，用氢氧化钠溶液调pH值到7.4，然后加入钙离子载体使其终浓度为25μmol/L；

b）将待筛选化合物溶于所述孵育液，制成阳性孵育液，备用；将转染跨膜蛋白16A的细胞分为测试组和对比组，均植于细胞培养容器，分别加培养基培养24h，备用；

b-1）将测试组中培养基弃去，然后加入b）步所述阳性孵育液于37℃条件下孵育；

b-2）将对比组中培养基弃去，然后加入a）步所述孵育液于37℃条件下孵育；

c）孵育完毕后，分别弃去b-1）所加阳性孵育液和b-2）所加孵育液，然后分别用洗涤液冲洗3-4次、加入通道打开液、37℃条件下静置反应得反应液；

d）在所述反应液中加入硝酸银溶液，混合均匀后，室温条件下避光静置24h，然后取上清液进ICR8000以测定上清液中的银离子浓度，分别得到测试组和对比组银离子浓度并进行比较，由此判定所述待筛选化合物的开放或阻断效应。

如测试组银离子浓度大于对比组银离子浓度，表明待筛选化合物具有阻断作用；如测试组银离子浓度小于对比组银离子浓度，表明待筛选化合物具有开放效应。

步骤a）所述钙离子载体为离子霉素，其英文名称为Ionomycin。

步骤b）所述转染跨膜蛋白16A的细胞为稳定转染跨膜蛋白16A的中国仓鼠卵巢细胞，所加培养基为F-12K培养基。

步骤b）所述阳性孵育液中待筛选化合物浓度在0.3～300μM。

步骤b-1）和b-2）所述孵育的孵育时间为15min。

步骤c）所述静置反应的时间为12min。

步骤d）所述硝酸银溶液的浓度为50ppm，所加入硝酸银溶液的体积与反应液体积比为3︰19。

本发明方法将所培养的细胞依次经孵育→洗涤→通道打开→测定Ag⁺，并将待测化合物加在孵育阶段，通过改变进入细胞中氯离子的多少，来衡量离子通道的开闭情况，从而通过增大细胞中的氯离子浓度，既增大了灵敏度，又避免了测试药物与银离子直接接触发生反应。

本发明灵敏度高，测试结果准确可靠，并且操作简单易行，是一种具有较好优势的简易高效CaCCs通道调节剂筛选方法。

附图说明

图1表示本发明方法在筛选CaCCs通道阻断剂时所呈现的量效曲线。

图1中，■表示C38，●表示NPPB，▲表示Flu；横坐标表示阻断剂（化合物C38、NPPB和Flu）的浓度，以μM单位计，纵坐标表示氯离子流出抑制率（%）。

图2表示本发明方法在筛选CaCCs通道开放剂时所呈现的量效曲线。

图2中，◆表示Eact；横坐标表示开放剂（化合物Eact）的浓度，以μM单位计，纵坐标表示氯离子流出激活率（%）。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步阐述和验证。

本发明所用到的试剂和耗材均可通过市购获得，所用试剂的纯度级别为分析纯或以上。

以下实施例中所用到的阻断剂或开放剂的具体名称如下：

NPPB：5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoate）；

CaCCinh-A01：6-叔丁基-2-（呋喃-2-甲酰胺基）-4,5,6,7-四氢苯并噻吩-3-甲酸(6-(tert-butyl)-2-(furan-2-carboxamido)-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylic acid)；

氟芬那酸(Flu)：N-(3-三氟甲基苯基)邻氨基苯甲酸（N-(3-Trifluoromethylphenyl)anthranilicacid）；

Eact：3,4,5-三甲氧基-N-（2-甲氧乙基）-N-4-苯-2-噻唑甲酰胺(3,4,5-trimethoxy-N-(2-methoxyethyl)-N-(4-phenylthiazol-2-yl)benzamide)。

本发明实施例中转染跨膜蛋白16A（TMEM16A）的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞按常规方法构建：①将鼠源TMEM16A cDNA（30547439，购于Thermo Scientific Molecular Biology）克隆进入pEGFP N1载体（购于上海迪奥生物科技有限公司），建成pEGFP N1-TMEM16A质粒；②使用Lipofectin2000试剂盒将CHO细胞转染pEGFP N1-TMEM16A质粒，转染成功后进行抗G418阳性克隆筛选，挑选出单克隆细胞进行扩大培养即可。以上具体步骤可参考文献：Schroeder BC,Cheng T,Jan YN,Jan LY(2008)Expression cloning of TMEM16A as acalcium-activated chloride channel subunit.Cell134(6):1019–1029.Supporting Information。

以下实施例中，使用ICR8000对上清液中银离子浓度进行测定时，参数设定为：检测波长328.1nm；平均电流（Average Current）5mA；入射狭缝宽度（Entrance Slit）0.6nm；波长自动优化（Peak WL）；电压自动调节（Auto gain）；积分时间（integration）10s；积分延迟（delay）0s；自动调零（autozero every）：每次进样100μl。随行标准曲线的浓度设置分别为0ppm,1ppm,2ppm,4ppm和8ppm，相关系数（r值）均大于0.998。

实施例1：CaCCs通道阻断剂的筛选及验证

a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液：

b）将CaCCinh-A01（简称C38）、NPPB和氟芬那酸（Flu）溶于孵育液，制成按表1给定的五个浓度梯度的C38阳性孵育液、NPPB阳性孵育液和Flu阳性孵育液，备用；将转染TMEM16A的CHO细胞分为测试组和对比组，按每孔4×10⁵个的细胞密度植于96孔板，然后加入F-12K培养基于37℃条件下培养24h，备用；

b-1）将测试组中培养基弃去，按每孔200μl分别加入各浓度的阳性孵育液（即C38阳性孵育液、NPPB阳性孵育液和Flu阳性孵育液），每个浓度设3个复孔，于37℃条件下孵育15min；

b-2）将对比组中培养基弃去，按每孔200μl加入孵育液，并设3个复孔，于37℃条件下孵育15min；

c）孵育完毕后，分别弃去测试组所加阳性孵育液和对比组所加孵育液，然后分别用洗涤液快速洗涤3次（每次200μl），按每孔200μl加入通道打开液，于37℃条件下静置反应12min得反应液；

d）吸取190μl反应液，加入30μl浓度为50ppm的硝酸银（AgNO₃）溶液，混合均匀后，室温（25℃）条件下避光静置24h，然后取100μl上清液进ICR8000以测定上清液中的银离子浓度，从而分别得到测试组和对比组银离子浓度，结果见表1。

进行测试组和对比组操作的同时，在同一块96孔板上增加无细胞组和未孵育组两组实验：

无细胞组：

a）空白96孔板，加入F-12K培养基于37℃条件下放置24h后，弃去培养基，然后按每孔200μl加入孵育液，设3个复孔，于37℃条件下孵育15min；

b）孵育完毕后，弃去a）步所加孵育液，然后用洗涤液快速洗涤3次（每次200μl），然后按每孔200μl加入通道打开液，于37℃条件下静置反应12min得反应液；

c）吸取190μl反应液，加入30μl浓度为50ppm的硝酸银溶液，混合均匀后，室温（25℃）条件下避光静置24h，然后取100μl上清液进ICR8000以测定上清液中的银离子浓度，结果见表1。

未孵育组：

a）转染有跨膜蛋白16A（TMEM16A）的中国仓鼠卵巢细胞，按每孔4×10⁵个的细胞密度植于96孔板，然后加入F-12K培养基于37℃条件下培养24h，备用；

b）弃去培养基，使用洗涤液将细胞快速洗涤三次（每次200μl）；洗涤完毕后，按每孔200μl加入通道打开液，设置3个复孔，放37℃条件下反应12min得反应液；

表1：测试组、对比组、无细胞组和未孵育组银离子浓度检测结果

对表1的统计结果进行分析：①不同浓度的三个测试组（C38、NPPB和Flu组）银离子浓度全部大于对比组银离子浓度，说明测试组的氯流出量小于对比组，从而可以判定C38、NPPB和Flu对CaCCs通道有阻断效应；②以上五个浓度梯度的C38测试组、NPPB测试组和Flu测试组的银离子浓度均大于对比组的银离子浓度，同时小于未孵育组的银离子浓度，且各组所测得的银离子浓度依次变大，即C38（1μM）＜C38（3μM）＜C38（10μM）＜C38（30μM）＜C38（100M）、NPPB（3μM）＜NPPB（10μM）＜NPPB（30μM）＜NPPB（100μM）＜NPPB（300μM）、Flu（3μM）＜Flu（10μM）＜Flu（30μM）＜Flu（100μM）＜Flu（300μM），表明测试药物C38、NPPB和Flu不仅减少了孵育时氯离子进入细胞内的量，同时也说明CaCCs通道的阻断程度对C38、NPPB和Flu的浓度均有依赖关系；③对比组的银离子浓度明显小于未孵育组银离子浓度，其原因是由于对比组在孵育过程中，通道打开，有大量的氯离子进入细胞内（细胞内氯离子浓度升高），从而在加入通道打开液后，对比组的氯离子流出量也较大，导致对比组的银离子浓度较未孵育组银离子浓度低。

根据以上各组银离子（Ag⁺）浓度（银离子浓度平均值）数据，计算96孔板每孔流出的氯离子总浓度，由于在低浓度范围内需要考虑到氯化银沉淀的溶解度积的问题，计算公式为：

Cl^-（总）=[(X-Y)/108+0.01916/Y]×35.5

其中：Cl^-（总）表示测试组（或对比组、未孵育组）细胞流出的氯离子总浓度；Y表示测试组（或对比组、未孵育组）所测得上清液中Ag⁺浓度，X表示无细胞组所测得上清液Ag⁺浓度。以上所有浓度均以ppm单位计。

根据测试组、对比组和未孵育组计算出的中Cl^-（总）的数值，计算测试药物（即C38、NPPB和Flu）对CaCCs通道氯离子流出抑制率，计算公式为：

根据得到的五个浓度梯度的各测试药物的氯离子流出抑制率数据，采用Origin pro7.0（美国Origin Lab公司）软件和Adobe Illustrator10软件进行数据分析及图像处理，根据logistic方程拟合量效关系曲线，IC₅₀值用平均数±标准误表示。

结果表明，三个阳性对照药（即C38、NPPB和Flu）均表现出了对TMEM16A的抑制作用，并呈现剂量依赖关系，如图1所示。NPPB与C38的IC50分别为39.35±4.72μM和6.35±0.27μM，与文献报道相符（Small-Molecule Screen Identifies Inhibitors of a Human IntestinalCalcium-Activated Chloride Channel.Ricardo De La Fuente,Wan Namkung,Aaron Mills,and A.S.Verkman.Mol Pharmacol73:758–768,2008）。

上述实验均表明，本发明方法可方便、快捷、有效地筛选出具有CaCCs通道阻断作用的化合物，由此也证明本发明方法可有效筛选出CaCCs通道阻断剂。

实施例2：CaCCs通道开放剂的筛选及验证

a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液：

b）将Eact溶于孵育液，制成0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM和100μM六个浓度梯度的Eact阳性孵育液，备用；将转染跨膜蛋白16A的中国仓鼠卵巢细胞分为测试组和对比组，按每孔4×10⁵个的细胞密度植于96孔板，然后加入F-12K培养基于37℃条件下培养24h，备用；

b-1）将测试组中培养基弃去，按每孔200μl分别加入各浓度的Eact阳性孵育液，每个浓度设3个复孔，于37℃条件下孵育15min；

c）孵育完毕后，分别弃去测试组所加Eact阳性孵育液和对比组所加孵育液，然后用洗涤液快速洗涤4次（每次200μl），然后按每孔200μl加入通道打开液，于37℃条件下静置反应12min得反应液；

d）吸取190μl反应液，加入30μl浓度为50ppm的硝酸银（化学式为AgNO₃）溶液，混合均匀后，室温（25℃）条件下避光静置24h，然后取100μl上清液进ICR8000以测定上清液中的银离子浓度，从而分别得到测试组和对比组银离子浓度，结果见表2。

进行测试组和对比组操作的同时，在同一块96孔板上增加无细胞组实验：

无细胞组：

a）空白96孔板，加入F-12K培养基于37℃条件下放置24h后，弃去培养基，然后按每孔200μl分别加入孵育液，设3个复孔，于37℃条件下孵育15min；

c）吸取190μl反应液，加入30μl浓度为50ppm的硝酸银溶液，混合均匀后，室温（25℃）条件下避光静置24h，然后取100μl上清液进ICR8000以测定上清液中的银离子浓度，结果见表2。

表2：测试组、对比组和无细胞组银离子浓度检测结果

对表2的统计结果进行分析：①六个浓度梯度的测试组最终测得的银离子浓度全部小于对比组银离子浓度，说明测试组在加入通道打开液后，氯离子流出量大于对比组，从而证明在孵育过程中，测试组有更多的氯离子流入细胞内，由此可以判定Eact具有通道开放效应；②以上五个浓度梯度的Eact测试组所测得的银离子浓度依次变小，即Eact（0.3μM）＞Eact（1μM）＞Eact（3μM）＞Eact（10μM）＞Eact（30μM）≈Eact（100μM），表明测试药物Eact不仅增加了孵育时氯离子进入细胞内的量，同时也说明CaCCs通道的开放程度对Eact的浓度有依赖关系。

Cl^-（总）=[(X-Y)/108+0.01916/Y]×35.5

其中：Cl^-（总）表示测试组（或对比组）细胞流出的氯离子总浓度；Y表示测试组（或对比组）所测得上清液中Ag⁺浓度，X表示无细胞组所测得上清液Ag⁺离子浓度。以上所有浓度均以ppm单位计。

根据测试组和对比组计算出的Cl^-（总）的数值，计算测试药物（Eact）对CaCCs通道氯离子流出激活率，计算公式为：

根据得到的六个浓度梯度的Eact的氯离子流出激活率数据，采用Originpro7.0（美国OriginLab公司）和Adobe Illustrator10软件进行数据分析及图像处理，根据logistic方程拟合量效关系曲线，EC₅₀值用平均数±标准误表示。

结果表明，化合物Eact表现出了对TMEM16A的开放作用，并呈现剂量依赖关系，如图2所示。Eact的EC₅₀为3.92±0.87μM，与文献报道相符（Small-Molecule Screen IdentifiesInhibitors of a Human Intestinal Calcium-Activated Chloride Channel.Ricardo De La Fuente,WanNamkung,Aaron Mills,and A.S.Verkman.Mol Pharmacol73:758–768,2008）。

上述实验均表明，本发明方法可方便、快捷、有效地筛选出具有CaCCs通道开放作用的化合物，由此也证明本发明方法可有效筛选出CaCCs通道开放剂。

本方法在设置较少浓度梯度，例如1～3个浓度时，可进行CaCCs通道调节剂（开放剂和阻断剂）的高通量初步筛选及定性；当设置的浓度梯度大于等于5个时，可以得到CaCCs通道调节剂的量效曲线，对不同调节剂的活性进行比较。

Claims

1.一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，包括以下步骤：

a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液：

孵育液：称取或量取氯化钠50 mmol、氯化钾100 mmol、氯化镁1 mmol、二水合磷酸二氢钠0.8 mmol、氯化钙4 mmol、Hepes10 mmol和钙离子载体15 μmol溶于去离子水中，定容至1000ml，然后用氢氧化钠溶液调pH值到7.4；

洗涤液：称取葡萄糖酸钠150 mmol、葡萄糖酸钾5.4 mmol，葡萄糖酸镁1mmol、二水合磷酸二氢钠0.8 mmol和Hepes20 mmol溶于去离子水中，定容至1 000 ml，然后用氢氧化钠溶液调pH值到7.4；

通道打开液：称取葡萄糖酸钠54 mmol、葡萄糖酸钾100 mmol，葡萄糖酸镁1 mmol、葡萄糖酸钙4 mmol、二水合磷酸二氢钠0.8 mmol和Hepes 20 mmol溶于去离子水中，定容至1000 ml后，用氢氧化钠溶液调pH值到7.4，然后加入钙离子载体使其终浓度为25 μmol/L；

b）将待筛选化合物溶于所述孵育液，制成阳性孵育液，备用；将转染跨膜蛋白16A的细胞分为测试组和对比组，均植于细胞培养容器，分别加培养基培养24 h，备用；

2.根据权利要求1所述的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，步骤a）所述钙离子载体为离子霉素。

3.根据权利要求1所述的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，步骤b）所述转染跨膜蛋白16A的细胞为稳定转染跨膜蛋白16A的中国仓鼠卵巢细胞，所加培养基为F-12K培养基。

4.根据权利要求1所述的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，步骤b）所述阳性孵育液中待筛选化合物浓度在0.3～300 μmol/L。

5.根据权利要求1所述的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，步骤b-1）和b-2）所述孵育的孵育时间为15min。

6.根据权利要求1所述的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，步骤c）所述静置反应的时间为12min。

7.根据权利要求1所述的钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，步骤d）所述硝酸银溶液的浓度为50ppm，所加入硝酸银溶液的体积与反应液体积比为3︰19。