CN103289679A

CN103289679A - 一种具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料及其制备方法

Info

Publication number: CN103289679A
Application number: CN2013102206254A
Authority: CN
Inventors: 孔林; 吴杰颖; 田玉鹏
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-06-04
Also published as: CN103289679B

Abstract

本发明公开了一种具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料及其制备方法，其中具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料，其特征在于：是由苯胺衍生物与纳米银原位复合得到的复合材料；复合材料中所述苯胺衍生物与所述纳米银的物质的量之比为1∶1；所述苯胺衍生物的结构式为：

Description

一种具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种双光子吸收材料及其制备方法，具体地说是一种具有低毒性、活体组织细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料及其制备方法。

二、背景技术

有机/无机纳米复合材料在自然界广泛存在，在生命活动过程中起着非常重要的作用。有机/无机纳米复合材料是通过纳米尺度的功能性有机材料和无机纳米粒子通过共价键/非共价键结合而产生，复合过程伴随着组分性能的匹配、整合、协同等效应，可以带来性质的增强甚至全新的改变。

近年来，随着双光子吸收材料的迅速发展，双光子荧光技术在应用方面有了重大突破。由于双光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；采用近红外或红外波段的激光作为光源，能大大降低生物组织对激发光的吸收，避免组织自发荧光的干扰，获得较强的样品荧光。生物内源分子的双光子吸收截面大都很小，故而能够实现暗场成像，背景干扰很小。同时，由于双光子技术使用的是长波激发(近红外)，具有激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小等特点，在光电子集成、生物分子探测、医疗诊断和荧光显微成像技术等领域中有巨大应用潜力和广阔应用前景。

随着纳米技术的深入开发和广泛应用，纳米材料作为双光子吸收材料在细胞显影、生物分子探测和医疗诊断等领域迅速发展，有机/无机纳米复合双光子吸收材料的制备及性质研究成为一个新的研究热点(L.Wang,X.T.Tao,J.H.Shi,X.Q.Yu,M.H.Jiang,J.Phys.Chem.B,2006,110,19711-19716)。

苯胺衍生物具有结构刚性、共平面性强、发光效率高等特点，一直吸引着人们的广泛关注。在光致、电致发光材料以及生物标记方面都表现出潜在的应用前景(J.Kido,Y.Okamoto,Chem.Rev.,2002,102,2357-2368)。近年来，人们对于具有双光子活性的苯胺衍生物作为双光子敏化材料表现出了较大的兴趣。

发明人对本申请的相关内容作了如下检索：

1、http://scholar.google.com网检索结果：（2013/5/30）

2、中国知网检索结果：（2013/5/30）

检索方式一：

篇名-----具有双光子细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合材料 2项，均与目标化合物无关。

篇名-----苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料 38项，均与目标化合物无关。

篇名-----苯胺衍生物/银纳米复合材料 104项，均与目标化合物无关。

检索方式二：

全文-----具有双光子细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合材料 101项，均与目标化合物无关。

全文-----苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料 292项，其中一项与本发明有关，为发明人的博士论文。

全文------苯胺衍生物/银纳米复合材料 6560项，均与目标化合物无关。

检索方式三：

关键词----具有双光子细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合材料无相关文献。

关键词-----苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料无相关文献。

关键词-----苯胺衍生物/银纳米复合材料无相关文献。

三、发明内容

本发明旨在提供一种具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料(简称HABDN/Ag纳米复合材料)及其制备方法，所要解决的技术问题是：遴选合适的具有双光子吸收性质的有机结构，并使其与纳米银原位复合，优化材料的双光子吸收性能，并使其具备低毒性和强双光子显影功能，从而适于生物学应用细胞显影。

本发明以具有双光子吸收性质的苯胺衍生物（HABDN）作为有机组分，以金属银为无机组分，通过原位自组装方式制备有机/无机纳米复合材料，简洁高效地制备了具有较高荧光量子产率的HABDN/银纳米复合材料，并测得其具有较低的生物毒性和活体组织细胞双光子吸收荧光显影的特性。

本发明具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料，是由苯胺衍生物与纳米银原位复合得到的复合材料；

复合材料中所述苯胺衍生物与所述纳米银的物质的量之比为1：1；

所述苯胺衍生物的结构式为：

本发明具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料的制备方法，按以下步骤操作：

a、将10mL苯胺、30mL溴乙烷、2g碳酸钠和5mg催化剂碘化钾混合，升温至150-170℃反应10-14h，得到中间体1；

b、在冰浴下将12.55g中间体1加入溶剂DMF中，随后在30min之内滴加5mL三氯氧磷，滴完后撤去冰浴，升温至60-80℃反应10-14h，反应结束后向反应液中加入200mL水，析出淡黄色固体，用NaOH调pH值至中性，用乙酸乙酯萃取析出的固体2-3次，合并有机相，再用饱和食盐水洗涤所述有机相2-3次，加无水MgSO₄干燥，抽滤，旋干溶剂，残余物经色谱柱分离，用石油醚为洗脱剂，得到黄红色液体即为中间体2；

c、将1.26g中间体2、0.8g Na₂CO₃和0.59g丙二腈置于研钵中，研磨，薄层色谱跟踪至反应完全。用300mL CH₂Cl₂溶解，每次用50mL水洗涤4次，加入无水MgSO₄干燥2h，蒸除溶剂，真空干燥，得1.40g淡黄色固体即为HABDN。

d、将16.8mg HABDN、9.0mg AgNO₃和40mg PVP-K30溶于10mL乙二醇中，微波辐射2分钟，微波辐射参数为464W、70%功率，自然冷却至室温，离心过滤、蒸馏水洗涤5次，真空干燥后得到目标产物HABDN/Ag纳米复合材料。

本发明以苯胺为起始原料，先制备中间体1——N,N-二己基苯胺，然后由中间体1制备中间体2——4-(N,N-二已氨基)苯甲醛基，再由中间体2合成4-(2,2′-二氰基-乙烯基)-N,N-二己基苯胺（HABDN），最后由乙二醇在微波辐射条件下还原硝酸银制得纳米银，继而发生原位复合自组装得到HABDN/Ag纳米复合材料，具体路线如下：

1、中间体1的制备：

在250mL圆底烧瓶中，加入10mL苯胺、30mL溴乙烷、2g碳酸钠和5mg催化剂碘化钾，升温至160℃，反应12h后，真空蒸除未参与反应的溴乙烷，得到40g黄色中间体1。

2、中间体2的制备

在冰浴下向150mL三颈瓶中加入中间体1(12.55g,0.05mol)、DMF(10mL)，然后在30min之内滴加三氯氧磷(5mL)，滴加完毕，撤去冰浴，缓慢升温至70℃反应12h。再向三颈瓶中倒入200mL水，有淡黄色固体出现，用NaOH调节pH值至中性，固体用150mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗3次，加无水MgSO₄干燥过夜，抽滤，旋干溶剂，残余物经色谱柱分离，用石油醚为洗脱剂，得到黄红色液体为中间体2(5.0g)。

3、HABDN的制备

将中间体2(1.26g,4.4mmol)、Na₂CO₃(0.8g,7.5mmol)和丙二腈(0.59g,8.9mmol)置于研钵中，研磨，薄层色谱跟踪至反应完全。用300mL CH₂Cl₂溶解，每次用50mL水洗涤4次，加入无水MgSO₄干燥2h，蒸除溶剂，真空干燥，得1.40g淡黄色HABDN。

4、目标产物HABDN/银纳米复合材料的制备

将HABDN(16.8mg,0.05mmol)、AgNO₃(9.0mg,0.05mmol)和PVP-K30(40mg)溶于乙二醇(10mL)中，微波辐射（464W，70%功率）2分钟，冷却至室温，离心过滤、蒸馏水洗涤5次，真空干燥后得到目标产物HABDN/银纳米复合材料。

本发明以具有较高反应活性和良好生物相容性的苯胺基团作为主体，简洁高效地制备了苯胺衍生物，继而与纳米银原位复合，得到HABDN/Ag纳米复合材料，该复合物具有较强的双光子吸收活性，对其进行了双光子细胞显影的研究。

经实验发现，本发明制备的HABDN/Ag纳米复合材料在680nm至900nm之间具有一定的双光子吸收性质，在840nm处双光子吸收截面最大，双光子吸收能力最强。HepG2细胞被目标产物染色后，可清晰地观察到该复合材料对HepG2细胞溶酶体具有高的识别能力。这一研究结果的发现，对于有机/无机纳米复合双光子吸收材料的设计、制备和生命科学研究具有重大的意义。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明合成的HABDN/银纳米复合材料是一类具有细胞显影功能的双光子吸收材料。与其它材料相比具有较大的双光子吸收截面，激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，因此，对细胞无损伤，可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值；

2、HepG2细胞被目标产物染色后，可清晰地观察到该复合材料对细胞溶酶体具有高的识别能力；

3、原料易得，成本低，合成步骤简单，产率高，易于操作。通过微波辐射法制备目标产物，步骤简单，节能减排。

四、附图说明

图1为本发明的制备路线图。

图2是本发明HABDN/Ag纳米复合材料的XRD衍射和SEM花样。从XRD中可以看出，复合材料由HABDN和单质银组成，银的衍射峰显示其为面心结构。从SEM衍射花样可以看出复合材料中HABDN呈纳米棒结构，长约1μm，宽约100nm，HABDN纳米棒表面镶嵌着银纳米粒子，银粒径在20nm左右。

图3为本发明HABDN/Ag纳米复合材料的双光子吸收图(激发能量为36mW)。从图3中可以看出，复合材料在680nm至900nm间具有一定的双光子吸收性质，在840nm处的双光子吸收截面最高，双光子吸收能力最强。

图4是复合材料对HepG2细胞荧光共聚焦显微成像：(a)目标产物着色的HepG2细胞的荧光共聚焦显微照片；(b)明场作用图；(c)叠合的照片。

从图4可以清楚地看到，目标产物已透过HepG2细胞的细胞膜，进入细胞质，并对它完全均匀的着色，细胞溶酶体对目标产物的摄取率很高，说明目标产物对HepG2细胞溶酶体具有很高的识别能力。溶酶体的破坏会释放酸性物质，而这种酸性物质对细胞具有极大破坏作用，从而导致细胞的死亡。这种机制被确定为诱导细胞死亡的有效途径，也被证明是诱导癌细胞凋亡的机制之一。这种复合材料的制备对于细胞显影材料的遴选、制备、对于生命科学、材料科学等方面都有着重要的意义。

五、具体实施方式

1、中间体1的制备

在250mL圆底烧瓶中，加入10mL苯胺、30mL溴乙烷、2g碳酸钠和催化剂量碘化钾，升温至160℃，反应12h后，真空蒸除未参与反应的溴乙烷，得到40g黄色中间体1。

2、中间体2的制备

在冰浴下向150mL三颈瓶中加入中间体1(12.55g,0.05mol)、DMF(10mL)，然后在30min之内滴加三氯氧磷(5mL)，滴加完毕，撤去冰浴，缓慢升温至70℃反应12h。再向三颈瓶中倒入200mL水，有淡黄色固体出现，用NaOH调节pH值至中性，固体用150mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗3次，加无水MgSO₄干燥过夜，抽滤，旋干溶剂，残余物经色谱柱分离，用石油醚为洗脱剂，得到黄红色液体为中间体2(5.0g)。产率64%。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)9.69(s,1H);7.69(d,J=8.4Hz,2H);6.64(d,J=8.4Hz,2H);3.34(t,J=7.6Hz,4H);1.60(m,4H);1.32(m,12H);0.92(t,J=5.6Hz,6H)。

3、HABDN的制备

将中间体2(1.26g,4.4mmol)、Na₂CO₃(0.8g,7.5mmol)和丙二腈(0.59g,8.9mmol)置于研钵中，研磨，薄层色谱跟踪至反应完全。用300mL CH₂Cl₂溶解，每次用50mL水洗涤4次，加入无水MgSO₄干燥2h，蒸除溶剂，真空干燥，得1.40g淡黄色HABDN。产率94%。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)7.78(d,2H,J=9.2Hz);7.42(s,1H);6.63(d,2H,J=9.2Hz);3.36(t,4H,J=7.6Hz);1.63～1.54(m,4H);1.34(m,12H);0.91(t,6H,J=6.8Hz)。

4、目标产物HABDN/银纳米复合材料的制备

将HABDN(16.8mg,0.05mmol)、AgNO₃(9.0mg,0.05mmol)和PVP-K30(40mg)溶于乙二醇(10mL)中，微波辐射（464W，70%功率）2分钟，冷却至室温，离心过滤、蒸馏水洗涤5次，真空干燥后得到目标产物HABDN/Ag纳米复合材料。

复合材料的结构用SEM和XRD表征，见图2。

复合材料的双光子吸收性质结果见图3。

5、目标产物HABDN/Ag纳米复合材料双光子细胞显影效果的测试

将清洗干净且灭菌的盖玻片放入6孔组织培养板中，肝癌组织细胞(HepG2细胞)5×10⁵个/孔的密度接种在直径35mm的6孔板培养皿中，并用DMEM作为细胞培养基进行细胞培养，细胞培养基中含有胎牛血清(10%)、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100ug/mL)。细胞培养皿置于含5%CO₂和95%O₂的培养箱中维持温度37℃进行细胞培养24h，用PBS(磷酸缓冲液，pH=7.4，Gibco试剂公司生产)洗涤HepG2细胞三次，洗去培养基。然后分别加入4μL目标化合物的DMF溶液(20μM)，培养24h，用4℃ PBS缓冲溶液(pH=7.4)冲洗盖玻片6～7次，滴1mL 4%多聚甲醛/PBS溶液固定细胞10min，蒸馏水冲洗盖玻片6～7次。将盖玻片卡在洁净载玻片上，置于激光共聚焦显微镜(LSM-710，Zeiss，德国)下观察细胞形态及荧光摄取情况，结果见图4。

Claims

1.一种具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料，其特征在于：是由苯胺衍生物与纳米银原位复合得到的复合材料；

所述苯胺衍生物的结构式为：

2.一种权利要求1所述的具有活体细胞显影功能的苯胺衍生物/银纳米复合双光子吸收材料的制备方法，其特征在于按以下步骤操作：

b、在冰浴下将12.55g中间体1加入溶剂DMF中，随后滴加5mL三氯氧磷，滴完后升温至60-80℃反应10-14h，分离、洗涤并干燥得到中间体2；

c、将1.26g中间体2、0.8g Na₂CO₃和0.59g丙二腈置于研钵中，研磨，薄层色谱跟踪至反应完全，分离、洗涤并干燥得到HABDN；

d、将16.8mg HABDN、9.0mg AgNO₃和40mg PVP-K30溶于乙二醇中，微波辐射2分钟，自然冷却至室温，离心过滤、洗涤并真空干燥后得到目标产物。