CN103288928B - 摩加夫芽孢菌和抗真菌脂肽类化合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环脂肽类化合物anteiso-C15 mojavensin A，具有抗植物病原真菌，抗细菌，抗肿瘤细胞的生物活性，它由中国南海涠洲岛珍珠贝的外状膜中分离得到的摩加夫芽孢菌B0621A经发酵，酸沉淀，快速柱色谱，高效液相色谱等方法分离得到，通过高分辨质谱和核磁共振等技术确定了该化合物的结构。该新型先导化合物有作为生物制剂和生物药物的潜在能力。
Description
技术领域
本发明涉及从海洋细菌的发酵液中提取分离具有生物活性的脂肽类化合物，具体的说是从摩加夫芽孢菌(Bacillus mojavensis)B0621A的发酵液中分离纯化一种新型脂肽anteiso-C15 mojavensinA，及该脂肽在抗真菌，抗细菌，抗肿瘤细胞方面应用的潜力。
背景技术
芽孢杆菌属能够产生抑制植物病原菌生长的杀菌物质，加之芽孢菌有着能够形成芽孢的特质，在农业病害的防治上面起了举足轻重的作用。芽胞杆菌具有着田间应用的良好前景，因此很多研究者致力于芽孢杆菌生防机制的研究。芽孢杆菌的生防机制是相对复杂的，它不是单一的因素起作用的。这或许与芽孢菌产生的次级代谢产物、芽孢菌和植物之间的相互作用、植物体对芽孢菌的应激性反应有关。
大多数芽孢杆菌能够产生脂肽类物质。通常包括iturin、fengycin、surfactin家族等类的脂肽。三大家族的脂肽具有抗植物病原真菌的能力。Maurice E.Snook等人从内生菌Bacillusmojavensis RRC 101中分离和鉴定了Leu7-Surfactin，对玉米和其他植物中的Fusarium verticillioides(串珠镰刀菌)有着较好的拮抗作用，并且能够减少串珠镰刀菌毒素的产量。Lili Chen等人从深海来源的Bacillus amyloliquefaciens SH-B10中分离得到了C16fengycin A和一个新型的fengycin类型的脂肽，这两个化合物对于Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum，Fusarium graminearum，F.oxysporum f.sp.vasinfectum，F.oxysporum f.sp.cucumismelo L.和F.graminearum f.sp.zea mays L.这五种土著的植物病原菌有较好的拮抗作用。Nopporn Thasana等人从Bacillussubtilis SSE4中分离得到了新型的iturin类型的脂肽Subtulene A，对于Colletotrichum gloeosporioides有着较好的防效。
脂肽类物质有着诱导植物体产生系统抗性(ISR)的作用。MarcOngena等人研究发现，豆类、西红柿等植物体能够感应surfactin和fengycin等化合物，并且作为信号激活了防御机制——植物体产生了诱导抗性。
目前已经发现的iturin家族的脂肽有很多种类，这些iturin家族的脂肽大都具有抗真菌的活性，mixirin还有着抗肿瘤细胞的活性。这些脂肽的结构总结如下：
发明内容
本发明目的在于阐明一种新型的抗菌脂肽类先导化合物anteiso-C15 mojavensin A的分离纯化和潜在应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抗真菌脂肽类化合物anteiso-C15 mojavensin A，分离自中国南海涠洲岛珍珠贝的外状膜中分离得到的摩加夫芽孢菌Bacillusmojavensis B0621A的发酵液，经提取分离得到的1种新的环脂肽类化合物，采用高分辨质谱和核磁共振等光谱技术，确定了该化合物的化学结构；
摩加夫芽孢菌B0621A，Bacillus mojavensis B0621A，已经于2012年02月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC No.M 2012023；于2012年02月17日检测存活。
将能够产生该脂肽的摩加夫芽孢菌B0621A在发酵培养基中培养后，通过离心、酸沉淀、甲醇提取从摩加夫芽孢菌B0621A的发酵液中制备粗脂肽，得到的粗脂肽上硅胶色谱柱，以病原真菌为检测靶菌，其中的活性部分进行RP-HPLC分析并制备，得到目标化合物。通过高分辨质谱和核磁共振等技术确定了该化合物的结构，命名为anteiso-C15 mojavensin A，该化合物的结构如下：
本发明的优点是：该化合物经体外的抗植物病原真菌，抗细菌，细胞毒活性测试，结果表明，该化合物急性粒细胞白血病细胞(human leukemia(HL-60)cell line)的IC50为100μM；该化合物在1mg/mL时，对金黄色葡萄球菌有抗性(Staphyloccocusaureus)；该化合物在2mg/mL时，对苹果干腐病菌(Valsa mali)，镰刀枯萎病黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)，串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)等有活性。
环脂肽类化合物anteiso-C15 mojavensin A，具有抗植物病原真菌，抗细菌，抗肿瘤细胞的生物活性，该新型先导化合物有作为生物制剂和生物药物的潜在能力。
具体实施方式
摩加夫芽孢菌B0621A，Bacillus mo javensis B0621A，已经于2012年02月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC No.M 2012023；于2012年02月17日检测存活。
实施例
采用200mL容积的三角瓶16个，每瓶装50mL发酵培养基(蔗糖2％，KH2PO4 0.3％，Na2HPO4 1％，NH4NO3 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，酵母粉0.02％，CaCl2 0.7μg/100mL，MnSO4·H2O 1μg/100mL，pH7.0-7.2，余量为水)，121℃灭菌30分钟，冷却后分别接种一环新鲜的活化好的抗真菌脂肽产生菌摩加夫芽孢杆菌B0621A，置于28℃摇床内、180rpm振荡培养20小时，培养结束取出取出镜检无杂菌即可作为种子液。
取容积为3L的摇瓶16个，每瓶装1L的发酵培养基。将培养好的种子液按体积比约5％(即1小瓶种子液接种到1L发酵摇瓶中)的接种量接种于内装1L灭菌(于121℃灭菌30分钟，冷却)发酵培养基的3L大摇瓶中，置于28℃摇床内、180rpm振荡培养48小时，共发酵16瓶，共24L发酵液。此发酵液可用于提取粗脂肽。
发酵结束后，用质量浓度2％的NaOH溶液调发酵液的pH至8.0，然后在常温下于4000rpm离心30min，除去菌体及其它固形物；所得到的发酵上清液用6mol/L盐酸调pH至2.0，于4℃冰箱内放置过夜，次日于4000rpm离心30min，收集沉淀，并用pH 2.0的稀盐酸反复洗涤沉淀三次，以除去表面残余上清。所得沉淀物用甲醇提取，反复提取三次后将提取液旋转蒸发除去甲醇，干燥后即得到粗脂肽15.51g。
将粗脂肽，上硅胶色谱柱(60mm×100mm)，依次以0/100，1/99，2/98，5/95，10/90，20/80，30/70，50/50，100/0的甲醇/二氯甲烷洗脱液各400ml进行洗脱。然后收集各洗脱组分，旋转蒸发干燥后称重并检测抗真菌活性(滤纸片法)，保留其中含有抗真菌脂肽、即具有抗真菌活性的的组分(以苹果干腐病菌(Valsa mali)为检测靶菌)。
经减压快速洗脱得到的活性部分流分8用流动相溶解后进行RP-HPLC分析并制备，采用YMC ODS-A半制备柱(250mm×10mm)，色谱条件为：流动相为甲醇∶0.05％(v/v)TFA水溶液＝75∶25(v/v)，流速2.5mL/min，进样量250μL，检测波长210nm。可制备得到目标化合物50mg。
该目标化合物是白色粉末状固体，难溶于甲醇，乙腈和水等，溶于二甲基亚砜，经1H NMR(600MHz，DMSO-d6)、13C NMR(150MHz，DMSO-d6)、1H-1H COSY、HMBC、HSQC、HR ESI MS分析，解析了目标化合物的结构。该化合物的结构式为C50H77N13O14(Exact Mass：1083.5713)，含有Asn(4×)，Gln(1×)，Pro(1×)，Tyr(1×)，并且确定了它们的连接顺序：Asn1，Tyr2，Asn3，Gln4，Pro5，Asn6，Asn7，和-(CH2)9(CH3)CH2CH3脂肪酸侧链(脂肪链末端为anteiso-型)。是一类新型的iturin类脂肽，将之命名为anteiso-C15mojavensin A。
下式为anteiso-C15 mojavensin A的结构；
下表为anteiso-C15 mojavensin A的1H和13C的核磁共振(NMR)数据表(溶剂为DMSO-d6)。
最后，采用了滤纸片法对该化合物的抗植物病原真菌活性和抗细菌活性进行了测试，具体方法是：滤纸片法测定抗菌物质对植物病原真菌的最低抑制浓度(MIC)：采用滤纸片法测定该抗菌物质对植物病原真菌的MIC，将anteiso-C15 mojavensin A配置成0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，将载有不同浓度抗菌物质的滤纸片于无菌条件下放置在菌块(如苹果干腐病菌等)周围，再在20-35℃恒温培养一段时间(24-120h)，培养时间视该菌的生长快慢情况而定，直至肉眼能够看见滤纸片对靶菌有抑制作用为止；载有不同梯度浓度抗菌物质的滤纸片对植物病原菌的抑制情况不同；理论上应该是高浓度会有明显的杀菌现象，所以病原菌生长的最前端距离滤纸片越远；反之则越近；在上述浓度梯度上，取这样的一个浓度，使得植物病原真菌的菌丝体(用显微镜观察菌丝生长)不再扩散，将这个浓度称为该物质对植物病原真菌的MIC(最低抑菌浓度)；
采用了MTT法对该化合物的细胞毒活性进行了测试。MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可用DMSO(分析纯)来溶解。利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。具体步骤为：用含10％牛血清培养液将急性粒细胞白血病细胞(human leukemia(HL-60)cell line)配成单个细胞悬液，以每孔103-105个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200μL。培养1-2天。吸去原培养基，每孔加入以无血清培养基配制的不同浓度药物anteiso-C15 mojavensin A。培养24或48h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml，用pH＝7.4的PBS配制，避光保存)10-20μL。(每孔培养基为100μL，加10μL，每孔培养基为200μL，则加20μL)。37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液(对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液)。每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。最后再计算出该化合物对急性粒细胞白血病细胞(human leukemia(HL-60)cell line)的IC50。
结果表明，该化合物对急性粒细胞白血病细胞(humanleukemia(HL-60)cell line)的IC50为100μM；该化合物在1mg/mL时，对金黄色葡萄球菌有抗性(Staphyloccocus aureus)；该化合物在2mg/mL时，对苹果干腐病菌(Valsa mali)，镰刀枯萎病黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)，串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)等有活性。
Claims (4)
1.一种抗真菌脂肽类化合物，其特征在于：该化合物命名为anteiso-C15mojavensin A，该化合物的化学结构为：
anteiso-C15 mojavensin A。
2.一种摩加夫芽孢菌(Bacillus mojavensis)B0621A，其特征在于：所述菌株保藏号为CCTCC No.M 2012023，于2012年02月17日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC,地址:中国武汉,武汉大学。
3.一种权利要求1所述化合物anteiso-C15mojavensin A的获取方法,其特征在于：将分离自中国南海涠洲岛珍珠贝的外状膜中的权利要求2所述的摩加夫芽孢菌(Bacillus mojavensis)B0621A发酵培养,发酵液经过酸沉淀获得粗脂肽，将粗脂肽上硅胶色谱柱进行洗脱分离，洗脱组份经过高效液相色谱方法分离得到anteiso-C15mojavensin A单体化合物；
摩加夫芽孢菌B0621A发酵培养基的重量组成如下：蔗糖1％～5％,KH2PO40.1％～1.0％,Na2HPO40.1％～3％,NH4NO30.1％～1.0％,MgSO4 .7H2O0.01％～0.05％,酵母粉0.01％～0.05％,CaCl20.1～1.0μg/100mL,MnSO4 .H2O 0.1～2.0μg/100mL,pH 5.0～9.0,余量为水；
发酵结束后,用质量浓度2％的NaOH溶液调发酵液的pH至8.0,然后在常温下于4000rpm离心30min,除去菌体及其它固形物；所得到的发酵上清液用6mol/L盐酸调pH至2.0,于4℃冰箱内放置过夜,次日于4000rpm离心30min,收集沉淀,并用pH 2.0的稀盐酸反复洗涤沉淀三次,以除去表面残余上清，所得沉淀物用甲醇提取,反复提取三次后将提取液旋转蒸发除去甲醇,干燥后即得到粗脂肽15.51g，
将粗脂肽,上硅胶色谱柱规格为：60mm×100mm,依次以0/100,1/99,2/98,5/95,10/90,20/80,30/70,50/50,100/0的甲醇/二氯甲烷洗脱 液各400ml进行减压快速洗脱，然后收集各洗脱组分,旋转蒸发干燥后称重并检测抗真菌活性,保留其中含有抗真菌脂肽、即具有抗真菌活性的组分，其中以苹果干腐病菌(Valsa mali)为检测靶菌，
经减压快速洗脱得到的活性部分流分8用流动相溶解后进行RP-HPLC分析并制备,采用YMC ODS-A半制备柱规格为：250mm×10mm,色谱条件为：流动相为体积比为甲醇：0.05％TFA水溶液＝75：25,流速2.5mL/min,进样量250μL,检测波长210nm，可制备得到目标化合物50mg。
4.一种权利要求1所述化合物anteiso-C15mojavensin A作为活性成分在制备抗植物病原真菌、细菌生物药物或生防制剂中的应用。
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