CN103288927A

CN103288927A - Sgc-7901细胞表面特异性结合的多肽

Info

Publication number: CN103288927A
Application number: CN201310213900XA
Authority: CN
Inventors: 侯颖春; 马彩霞; 何慧敏; 高宁
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: CN103288927B

Abstract

本发明公开了SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到5条多肽片段，其氨基酸序列分别为：YTHNESSPKDTH，YTVPDYKHNSAH，THPWQITSVNFK，DVFPHSRPADEL和IHKDPANKSLVP。本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选胃癌SGC-7901细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与胃癌细胞的亲和力，获得14个噬菌体克隆，测序获得5条多肽序列，同源性分析表明多肽基序可能为肿瘤细胞表面受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合SGC-7901细胞，筛选获得的胃癌SGC-7901细胞特异性多肽为胃癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供实验依据。

Description

SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，特别是一种SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽。

背景技术

胃癌（gastric cancer）是消化道常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、早期诊断率低、预后效果差，术后复发和转移是影响胃癌预后的主要原因。因此，探究胃癌发生、发展的细胞和分子生物学机理对当前胃癌治疗至关重要，同时，寻找敏感性高、特异性强的早期诊断方法也是目前降低胃癌死亡率的一个首选策略。近年来，分子影像学和靶向治疗的迅速发展为胃癌治疗找到了新的希望，其中，从胃癌细胞表面筛选特异、敏感的肿瘤标记物已经成为实验室工作的当务之急，噬菌体展示技术的创立为研究胃癌细胞表面肿瘤标记物的局限性开创了新局面，为胃癌的早期诊断和靶向治疗研究奠定了基础。

噬菌体展示技术（Phage Display Technology）是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，1985年由美国Missouri大学G.P.Smith等首创，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（如抗体、酶和细胞表面受体等）的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。

噬菌体展示技术正逐步发展成熟，为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原，肿瘤相关配体和多肽的筛选已成为寻找抗肿瘤药物的新热点，针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽，为肿瘤治疗提供了新的靶点，也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的免疫治疗提供了新的分子靶位，噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用，将多肽与脂质体或纳米药物偶联，既有助于在达到更好的靶向治疗效果，又减小了药物的毒副作用，还可用于肿瘤血管三维成像和分子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽及其筛选方法，该方法利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到5条多肽片段，并通过鉴定它们与胃癌细胞的亲和力和特异性，分析氨基酸序列组成。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到14个肽序克隆，从中获得5条共同多肽片段，其氨基酸序列分别为：YTHNESSPKDTH，YTVPDYKHNSAH，THPWQITSVNFK，DVFPHSRPADEL，IHKDPANKSLVP。

五条多肽的亲水性分析表明，它们均为亲水性多肽。且5条多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性。

5条多肽片段能够特异性结合SGC-7901细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。

上述SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的胃癌SGC-7901细胞系为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增并滴定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与SGC-7901细胞的亲和力，排除假阳性克隆，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序，BLAST检索蛋白质数据库，检测多肽基序同源性较高的蛋白质，及可能结合的细胞表面受体和配体；细胞免疫荧光法检测噬菌体多肽克隆的靶向性，进一步鉴定阳性克隆的特异性。

本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选胃癌SGC-7901细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与胃癌细胞的亲和力，获得14个阳性噬菌体克隆，测序获得5条共同多肽序列。同源性分析表明这些多肽可能为胃癌细胞表面受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合SGC-7901细胞，筛选获得的胃癌SGC-7901细胞特异性多肽为胃癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供了实验依据。

附图说明

图1是本发明的具体技术路线图；

图2是随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；

图3是精简遗传密码表；

图4是14个噬菌体阳性克隆与SGC-7901细胞亲和力的ELISA鉴定；

图5A、图5B、图5C、图5D和图5E分别是五条噬菌体多肽的氨基酸疏水性图；

图6A1-A4----G1-G4分别是噬菌体阳性克隆靶向SGC-7901细胞的免疫荧光检测（×200）图，其中：

A1,A2,A3,A4:SGC-7901cells(A1and A2)and HEK293cells(A3and A4)incubated with Q2positive clone that displays GSP1peptide under the light microscope and the fluorescent microscope;

B1,B2,B3,B4:SGC-7901cells(B1and B2)and HEK293cells(B3and B4)incubated with Q8positive clone that displays GSP2peptide under the light microscope and the fluorescent microscope;

C1,C2,C3,C4:SGC-7901cells(C1and C2)and HEK293cells(C3and C4)incubated with Q16positive clone that displays GSP3peptide under the light microscope and the fluorescent microscope;

D1,D2,D3,D4:SGC-7901cells(D1and D2)and HEK293cells(D3and D4)incubated with Q49positive clone that displays GSP4peptide under the light microscope and the fluorescent microscope;

E1,E2,E3,E4:SGC-7901cells(E1and E2)and HEK293cells(E3and E4)incubated with Q32positive clone that displays GSP5peptide under the light microscope and the fluorescent microscope;

F1,F2,F3,F4:SGC-7901cells(F1and F2)and HEK293cells(F3and F4)incubated with unrelatedphages under the light microscope and the fluorescent microscope;

G1,G2,G3,G4:SGC-7901cells(G1and G2)and HEK293cells(G3and G4)incubated with PBSunder the light microscope and the fluorescent microscope.

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

一、技术路线

本发明采用噬菌体多肽展示技术，以人胃癌SGC-7901细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞进行4轮消减筛选，从噬菌体12肽库中筛选能特异性结合胃癌SGC-7901细胞的多肽基序，检索其可能识别的细胞表面受体，为胃癌早期诊断和靶向治疗的进一步研究提供良好的实验依据，具体技术路线如图1所示。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1细胞株、噬菌体展示随机肽库、宿主菌

（1）细胞株：人胚肾细胞株HEK293，人胃癌细胞株SGC-7901，本实验室提供。

（2）噬菌体展示随机肽库：噬菌体随机十二肽展示文库（Ph.D-12^TM Phage DisplayPeptide Library Kit）购自New England Biolabs，USA，滴度1.5×10¹³pfu/ml，贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度～2.7×10⁹个转化子。

（3）宿主菌：大肠杆菌E.coli ER2738，购自New England Biolabs，USA。

（4）M13噬菌体-96gⅢ引物：引物序列为5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3’，购自New England Biolabs，USA。

2.1.2主要试剂

2.1.2.1细胞培养试剂及配制

（1）RPMI1640及DMEM培养基：购自美国Gibco公司。

依据说明书，取RPMI-1640培养基粉末2袋，溶解于1500ml三蒸水中，加入NaHCO₃4.0g，磁力搅拌器搅拌至彻底溶解后，加三蒸水定容至2L，加入FBS200ml，抗生素各20ml（青霉素/链霉素终浓度为100U/ml，庆大霉素终浓度为100μg/ml)，调整pH值到7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，分装于500ml灭菌试剂瓶，4℃储存备用。

依据说明书，取DMEM培养基粉末2袋，溶解于1500ml三蒸水中，加入NaHCO₃7.4g，磁力搅拌器搅拌至彻底溶解后，加三蒸水定容至2L，加入FBS200ml，抗生素各20ml（青霉素/链霉素终浓度为100U/ml，庆大霉素终浓度为100μg/ml)，调整pH值到7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，分装于500ml灭菌试剂瓶，4℃储存备用。

（2）胎牛血清：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

（3）100U/ml青霉素/链霉素溶液：称取0.33g青霉素（Amresco公司）、0.77g链霉素（Amresco公司），溶解于50ml三蒸水中，磁力搅拌器搅拌至彻底溶解，0.22μm滤膜过滤，10ml/管分装，-20℃储存备用。

（4）100mg/ml庆大霉素：称取0.5g庆大霉素（Amresco公司），溶解于50ml三蒸水中，磁力搅拌器搅拌至彻底溶解，0.22μm滤膜过滤，10ml/管分装，-20℃储存备用。

（5）0.25%Trypsin-0.02%EDTA：称取胰蛋白酶（Amresco公司）0.375g，加入1M EDTA（PH8.0）81μ1，溶于150ml PBS中，磁力搅拌器低速缓慢搅拌至彻底溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。

（6）PBS：取PBS干粉2袋，充分溶解于三蒸水中，定容至2L，高压灭菌，室温储存。

（7）台盼蓝：购自美国Sigma公司。

2.1.2.2细胞淘选和噬菌体滴度测定相关试剂及配制

（1）胰蛋白胨（Bacto-Tryptone）、酵母提取物（yeast extract）：购自OXOID，England。

（2）四环素贮液：四环素购自Amresco公司。以20mg/ml的浓度溶于无水乙醇中，1ml/管，封装至1.5ml灭菌离心管中，-40℃避光保存，用前摇匀。

（3）IPTG：购自西安沃尔森生物技术有限公司。

（4）Xgal、NaN₃、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、Agar：购自Amresco公司。

（5）LB培养基：称取Bacto-Tryptone10g，yeast extract5g，NaCl5g，溶解于800ml三蒸水中，磁力搅拌至完全溶解。调节pH值到7.0，加三蒸水定容至1000ml。高压蒸汽灭菌30min，室温贮存。

（6）LB-tet液体培养基：称取Bacto-Tryptone5g，yeast extract2.5g，NaCl2.5g，溶解于400ml三蒸水中，磁力搅拌至完全溶解。调节pH值到7.0，加三蒸水定容至500ml。高压蒸汽灭菌30min，待LB培养基冷却至室温，加入1.25ml四环素贮液(终浓度50μg/ml)，4℃避光储存备用。

（7）LB-tet固体培养基：取LB-tet培养基100ml，加入1.5g琼脂粉，高压蒸汽灭菌，将融化的LB固体培养基置于60℃的水浴中，待培养基温度降到60℃时（手可触摸），加入100μl四环素贮液，混匀倒平板，4℃避光储存备用。

（8）顶层琼脂糖（Agarose）：Agarose购自美国Invitrogen公司。每升称取Bacto-Tryptone10g，yeast extract5g，NaCl5g，MgCl·6H₂O1g，Agarose7g，高压灭菌，封装至灭菌的50ml离心管中，4℃保存，用时微波炉融化。

（9）IPTG/Xgal：称取0.25g IPTG和0.2g Xgal溶解于5ml DMF中，锡箔纸包裹，充分混匀，-20℃储存备用。

（10）LB/IPTG/Xgal平板：取250ml LB培养基，加入3.75g琼脂粉，高压灭菌，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃（手可触摸），加入250μl IPTG/Xgal，混匀倒平板，平板4℃避光储存备用。

（11）PEG/NaCl：PEG8000购自北京索莱宝科技有限公司。20%(w/v)PEG8000称取20g，2.5M NaCl14.625g，溶解于80ml三蒸水中，磁力搅拌器搅拌至充分溶解，加三蒸水定容至100ml，高压灭菌，室温保存。

（12）10×TBS缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，高压灭菌，室温保存。

（13）TBS-0.02%NaN₃称取0.01g NaN₃加入50ml1×TBS缓冲液中，充分混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃储存备用。

（14）邻苯二甲酸二丁酯（DBP）：成都市科龙化工试剂厂。

（15）环己烷：天津市东丽区天大化学试剂厂。

2.1.2.3酶联免疫吸附（ELISA）、阳性噬菌体克隆单链DNA快速纯化及细胞免疫荧光相关试剂

（1）4%多聚甲醛固定液：称取多聚甲醛粉末4g，溶解于100ml PBS(pH7.2)中，磁力搅拌溶解，稍许加热至60℃，加入几滴1M NaOH助溶完全，0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。

（2）3%H₂O₂：取4ml30%H₂O₂加入到36ml三蒸水中，混匀，室温保存。

（3）0.75%H₂O₂：取1.25ml30%H₂O₂加入到48.75ml三蒸水中，混匀，室温保存。

（4）TBST：量取1×TBS，按不同浓度(v/v)的Tween-20(0.1%、0.2%、0.3%、0.5%)配制，高压灭菌，室温保存。

（5）Blocking buffer：3%BSA溶于0.5%TBST中(pH7.4)，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。

（6）山羊抗M13多克隆抗体：购自Santa Cruz Biotechnology，Inc公司。

（7）辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗山羊IgG：购自北京博奥森生物技术有限公司。

（8）四甲基联苯胺（TMB）：购自Boston Biomedica，Inc.(BBI)公司。

（9）TMB底物缓冲液：称取柠檬酸2.55636g，磷酸氢二钠9.2042g，溶解于450ml三蒸水中，调节pH值到5.5，加三蒸水定容至500ml，高压灭菌，4℃保存。

（10）TMB底物贮液：称取TMB粉末10mg，溶解于5ml二甲基亚砜（DMSO）中，锡箔纸包裹避光，4℃储存备用。

（11）TMB工作液：取TMB底物缓冲液9.5ml，TMB底物贮液0.5ml，0.75%H₂O₂42μl，于10ml灭菌离心管中充分混匀，避光操作，现用现配。

（12）显色终止液：2M H₂SO₄。

（13）二甲基亚砜（DMSO）：购自美国Sigma公司，以抗有机溶剂溶解的特制0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。

（14）碘化物缓冲液：依据说明说，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，4M NaI。室温避光保存。

（15）FITC标记兔抗山羊IgG：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

（16）BSA：购自Amresco公司。

（17）常规生物化学试剂：购自西安沃尔森生物技术有限公司。

2.1.3实验仪器设备

（1）超净工作台：苏州净化设备有限公司。

（2）Nikon Ti-S倒置荧光显微镜：日本Nikon公司。

（3）普通光学显微镜：宁波舜宇仪器有限公司。

（4）倒置相差显微镜：宁波舜宇仪器有限公司。

（5）CO₂恒温孵育箱：Sheldon Manufacturing，Inc（ΜSA）公司。

（6）pH测定仪：德国Sartorius公司。

（7）BT00-100M蠕动泵：保定兰格。

（8）0.22μm过滤器：美国Millipore公司。

（9）5415D离心机、5415R台式高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计：德国Eppendorf公司。

（10）六孔、96孔细胞培养皿：美国Costar公司。

（11）AP-01P真空泵：天津奥特赛恩斯公司产品。

（12）BICELL细胞冻存杯：日本Nihon Freezer公司。

（13）细菌培养箱、501A超级恒温水浴锅：上海实验仪器厂有限公司。

（14）78-1磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司。

（15）DW-FL-135低温冰箱：中科美菱科技公司产品。

（16）4℃与-20℃冰箱：德国西门子。

（17）-80℃超低温冰箱：Thermo Fisher Scientific Inc公司。

（18）HZQ-FX恒温摇床：哈尔滨东连电子技术开发有限公司。

（19）WD-9405B脱色摇床：北京六一仪器厂产品。

（20）202-0型电热恒温干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司。

（21）加样器：德国Eppendorf公司。

（22）八道移液器：芬兰百得公司。

（23）GlassMaster电动吸液器：瑞士梅特勒公司。

（24）VORTEX-5旋涡混匀器：江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。

（25）BS124S电子分析天平：陕西天美科学仪器有限公司。

（26）医用微波炉：Galanz公司。

（27）数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

（28）JY040S和JY040G凝胶成像分析系统：北京君意东方电泳设备有限公司。

（29）YDS-30-80型液氮罐：成都金凤液氮容器有限公司。

（30）ELX800全自动酶联免疫检测仪：美国BIO-TEK公司产品。

（31）YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸器灭菌器：上海博迅实业有限公司。

2.2实验方法

2.2.1细胞培养

2.2.1.1细胞复苏

（1）37℃水浴中预热DMEM培养基和RPMI1640培养基，同时用酒精棉球擦拭超净工作台台面，紫外线照射超净工作台台面30min以上。

（2）从液氮罐中迅速取出装有人胚肾HEK293细胞的冻存管投入38℃水浴中，缓慢摇晃直至冻存细胞溶解。

（3）溶解后，迅速将细胞移入已预先装有5ml温热的含10%FBS的DMEM培养基的灭菌10ml离心管中，室温下，800rpm离心3min。

（4）弃上清，加入约2ml DMEM培养液，轻轻吹打形成单细胞悬液，然后接种到已含适量培养基并作适当标记的培养瓶中，将培养瓶于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中进行培养。

（5）次日给细胞换液一次，以后按常规进行细胞培养。

（6）重复同样操作复苏SGC-7901细胞。

2.2.1.2细胞传代培养

（1）倒置显微镜下观察，待胃癌SGC-7901细胞长至90%融合时，吸弃旧培养液，用预先温热的PBS轻轻洗涤细胞2遍。

（2）加入适量0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻摇晃是蛋白酶消化液覆盖细胞表面，37℃消化2～3min。显微镜下观察，待细胞质回缩变圆，细胞间隙增大、不再粘连成片时，加入适量RPMI1640完全培养基终止消化。

（3）用滴管反复轻轻吹打培已消化细胞形成细胞悬液，将细胞悬液转入10ml灭菌离心管中，室温下，800rpm离心3min。

（4）吸弃上清，加入3mlRPMI-1640培养液，用滴管轻微吹打细胞形成细胞悬液，按照1：4传代，接种于预先装有适量培养液的新培养瓶中，将培养瓶于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中扩大培养，拧松瓶盖，每隔一天更换培养液一次，4～5天待细胞长满瓶底继续传代，指数生长期的细胞用于实验。

（5）同样操作培养人胚肾HEK293细胞。

2.2.1.3细胞计数

（1）取1ml单细胞悬液于1.5ml离心管中，涡旋彻底混匀，然后取10μl转移至已预先装有80μl PBS的1.5ml离心管中，涡旋彻底混匀。

（2）取10μl0.4%台盼蓝染液加入1.5ml离心管中，涡旋混匀。取适量细胞悬液缓慢注入计数板，并确保无气泡。

（3）普通光学显微镜下观察并统计细胞数目，依据细胞计数的方法计算原细胞悬液的密度。

2.2.1.4细胞冻存。

（5）冻存前一天进行细胞换液，取指数生长期的细胞，按照细胞传代的方法收集细胞悬液，800rpm离心3min。

（6）弃上清，加入7ml含10%DMSO和20%FBS的培养基，滴管轻微吹打细胞形成细胞悬液，1ml/管分装于冻存管中。

（7）将冻存管置于冻存杯中室温放置1h，然后-80℃超低温冰箱中过夜，次日取冻存管于液氮中长期冻存并做好冻存记录。

2.2.2宿主菌E.coli ER2738的准备

（1）复苏：无菌技术操作，先取200μl LB-Tet液体培养基于1.5ml灭菌离心管中，再从E.coli ER2738的甘油冻存物中取0.2μl菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于LB-Tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。

（2）培养：

①用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3ml LB-Tet液体培养基的10ml灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。

②取10ml灭菌离心管，无菌操作加入3ml LB-Tet液体培养基，取30μl过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状（OD₆₀₀～0.5）。

2.2.3噬菌体随机十二肽库体外快速差减筛选（BRASIL）

以胃癌SGC-7901细胞为靶细胞，人胚肾HEK293细胞为非特异性吸附细胞，参照Giordano等建立的方法进行4轮液相细胞亲和筛选。每一轮筛选投入噬菌体量不少于1.5×10¹⁰pfu。第一轮筛选过程如下：

（1）按照常规细胞培养方法，培养胃癌SGC-7901细胞和人胚肾HEK293细胞。

（2）取生长状态良好的人胚肾HEK293细胞消化、收集，离心后重悬于含1%BSA的DMEM培养基中（冰的），调整细胞数为1×10⁶/ml。

（3）取噬菌体随机十二肽库10μl(滴度为2×10¹¹pfu)与1×10⁶/100μlHEK293细胞混合，轻轻振荡，在4℃、30rpm/min摇床孵育2h。

（4）将噬菌体和细胞的混悬液，轻轻加入已预先装有200μl环己烷与邻苯二甲酸二丁酯组成的有机分离液（200μl、20:180、体积比为1:9，密度为1.03g/ml）的1.5ml灭菌离心管中，4℃，13000rpm，离心10min。

（5）在噬菌体与HEK293细胞孵育的过程中，取生长状态良好的胃癌SGC-7901细胞消化、收集，离心后重悬于含1%BSA的RPMI1640培养基中（冰的），调整细胞数为1×10⁶/ml。

（6）取出步骤（4）中水相里未结合的噬菌体与1×10⁶/100μl胃癌SGC-7901细胞混合，轻轻振荡，4℃、30rpm/min摇床孵育3h。

（7）取噬菌体和细胞的混悬液，轻轻地加在200μl环己烷与邻苯二甲酸二丁酯组成的有机分离液之上，4℃，13000rpm/min离心15min。

（8）将Eppendorf管表面用70%酒精消毒，然后迅速置于液氮中，30s后切下Eppendorf管底部，复温后，吸出多余的有机相，将有机相内沉淀的与SGC-7901细胞结合的噬菌体转移至新的灭菌Eppendorf管。

（9）以无菌操作技术将沉淀物转移至200μl指数生长期的E.coli ER2738大肠杆菌中，37℃，孵育30min，复苏与胃癌SGC-7901细胞结合的噬菌体。

（10）测定噬菌体滴度、扩增、纯化，按照上述步骤进入下一轮亲和筛选，计算每轮筛选后和扩增后噬菌体的pfu。

2.2.4噬菌斑的计数方法

2.2.4.1亲和筛选后噬菌体滴度的测定

（1）取4支灭菌的10ml离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂（Agarose Top），每管加入3ml顶层琼脂，45℃水浴备用。

（2）每个噬菌体稀释度准备1块LB/IPTG/Xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。

（3）将OD₆₀₀～0.5的E.coli ER2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μl/管分装，4℃保存备用。

（4）取4支灭菌的1.5ml离心管，分别盛有100μl、90μl、90μl、90μlLB-Tet培养基，将待测噬菌体吸取1μl入100μlLB-Tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。

（5）取10μl待滴定的各稀释度的噬菌体与200μl E.coli ER2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。

（6）将步骤（5）的混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的LB/IPTG/Xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。

（7）次日观察，选择蓝斑密度合适的平板（～100个蓝斑）计数，然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μl噬菌体库的滴度。

2.2.4.2扩增后噬菌体滴度的测定

（1）取12支灭菌的10ml离心管，每个噬菌体稀释度准备3个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂（Agarose Top），每管加入3ml顶层琼脂，45℃水浴备用。

（2）每个噬菌体稀释度准备3块LB/IPTG/Xgal平板，分别标记为10^-8、10^-9、10^-10、10^-11，37℃恒温培养箱预热备用。

（3）将OD₆₀₀～0.5的E.coli ER2738菌液按照噬菌体稀释度200μl/管分装，共12管，4℃保存备用。

（4）取1μl待测噬菌体转移至盛有100μl LB-Tet液体培养基的灭菌1.5ml离心管中，标记为10^-2，轻轻振荡混匀，瞬间离心，备用。

（5）取9支盛有90μl LB-Tet培养基的灭菌1.5ml离心管，分别标记为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11，取10μl步骤（4）中噬菌体悬液放入10^-3管中，轻轻振荡混匀，瞬间离心，再用移液枪将离心管内悬液反复吸吹10次，混合均匀，然后从10^-3管中取10μl放入10^-4管中，振荡混匀，瞬间离心后吸吹10次，其余的依次类推。

（6）取10μl待滴定的各稀释度的噬菌体与200μl E.coli ER2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。

（7）将步骤（6）的混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的LB/IPTG/Xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。

（8）次日观察，选择蓝斑密度合适的平板（～100个蓝斑）计数，计算扩增后噬菌体库的滴度。计算方法：噬菌体滴度=（噬菌斑数目×对应噬菌体的稀释倍数）/10μl(pfu/μl)。

2.2.4.3噬菌体的扩增、纯化

（1）取过夜培养的E.coli ER2738菌液200μl稀释于20ml LB-Tet培养基中，恒温摇床37℃，300rpm/min，缓慢摇2～3h至指数前期，紫外分光光度计测OD₆₀₀～0.5。

（2）以无菌操作技术，将细胞-噬菌体沉淀移入已摇至指数前期的ER2738菌液中，恒温摇床37℃，225rpm/min，振荡培养4.5h。

（3）将噬菌体扩增液转移至20个灭菌的1.5ml离心管中，每管分装1ml，4℃，13000rpm，离心10min，再将上清转至另一灭菌离心管中，离心，吸取80%上清转至新的灭菌离心管中。

（4）加1/6体积的PEG/NaCl(167μl/管)，反复振荡混匀，4℃过夜沉淀噬菌体。

（5）次日，于高速低温离心机中，4℃，13000rpm，离心过夜沉淀物20min。

（6）弃上清，再短暂离心，用移液器吸去残留的上清液。

（7）每个离心管中加1ml TBS重悬沉淀，反复振荡混匀，悬液转入新的灭菌离心管中，4℃，13000rpm，离心3min，以除去残余细胞。

（8）将上清转入另一灭菌的1.5ml离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(167μl/管)，反复振荡混匀，再次沉淀噬菌体，冰上孵育1h。

（9）4℃，13000rpm，离心15min，弃上清，再短暂离心，用移液器吸去残留上清液。

（10）每管加入200μl TBS-0.02%NaN₃溶解沉淀的噬菌体，反复振荡混匀，再短暂离心1min，去除任何残余不溶物，上清转入另一新的灭菌1.5ml离心管中，此悬液即为扩增后的一级库，取10μl悬液用于滴度测定，将100μl悬液转移至新的灭菌0.4ml管中，标记，以此作为下一轮亲和筛选的噬菌体文库，剩余的90μl悬液，按1:1加入灭菌甘油，-20℃保存备用。

2.2.5细胞免疫酶联吸附（ELISA）法初步鉴定阳性噬菌体克隆

2.2.5.1制备噬菌体单克隆

（1）经第4轮筛选获得的噬菌体库不经过扩增，按照上述“亲和筛选后噬菌体滴度测定”的方法，直接感染细菌E.coli ER2738，将滴定铺制的LB/IPTG/Xgal平板于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

（2）将E.coli ER2738过夜培养物按1:100比例稀释接种于LB-Tet液体培养基中，分装于50个10ml灭菌离心管，每管3ml。

（3）无菌操作，用灭菌的黄枪头从蓝斑数目～100的LB/IPTG/Xgal平板上，随机挑取50个噬菌斑接种到上述分装好的灭菌离心管中，离心管置于37℃恒温摇床，225rpm，缓慢振摇4.5～5h。

（4）将每个噬菌斑扩增液分装于1.5ml灭菌离心管中，每管lml，按照上述“噬菌体的纯化”方法纯化每个噬菌体单克隆。

（5）按照上述“扩增后噬菌体滴度测定”的方法，滴定并计算每个噬菌体单克隆的pfu。

（6）按同样方法滴定原始噬菌体随机十二肽库，从长出蓝斑的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取一个噬菌斑进行扩增、滴定，以此作为实验中阴性噬菌体克隆对照。

2.2.5.2ELISA法初步鉴定噬菌体单克隆与胃癌SGC-7901细胞的特异性亲和力

以人胚肾HEK293细胞为阴性对照，人胃癌SGC-7901细胞为靶细胞，用全细胞ELISA法鉴定随机挑取的50个噬菌体单克隆对胃癌SGC-7901细胞的特异性亲和力，排除假阳性和非特异性结合噬菌体单克隆，同时设立PBS对照及原始噬菌体随机肽库单克隆（即无关克隆）对照。具体操作步骤如下：

（1）取生长状态良好的处于指数生长期的人胚肾HEK293细胞和胃癌SGC-7901细胞，消化传代，细胞计数，并调整细胞密度为1×10⁵cells/ml，接种至96孔细胞培养板，每组设2个复孔，每孔200μl，于37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24～36h，待细胞贴壁长满单层进行实验。

（2）吸弃旧培养基，用预先温热的PBS轻轻洗涤2次，然后每孔加入37℃温热的无血清培养基200μl，于细胞培养箱孵育1h。

（3）吸弃培养基，用预热的PBS轻轻洗涤2次，每孔加入4%多聚甲醛100μl，37℃恒温培养箱固定15min。

（4）吸弃固定液，倒置平板在吸水纸上轻拍以除去残液，PBS轻轻洗涤5min×3次。

（5）在吸水纸上轻轻拍干PBS残液，滴加3%过氧化氢，100μl/孔，37℃恒温培养箱孵育20min，用以阻断内源性过氧化物酶活性。

（6）吸弃过氧化氢，在吸水纸上轻轻拍干残液，PBS轻轻洗涤5min×3次。

（7）在吸水纸上轻轻拍干PBS残液，加入Blocking buffer(3%BSA in0.5%TBST)，250μl/孔，37℃恒温培养箱封闭40min。

（8）吸弃封闭液，0.1%TBST轻轻洗涤5次，加入噬菌体单克隆，1×1011pfu，100μl/孔（噬菌体单克隆稀释于0.2%TBST），同时设PBS对照及原始噬菌体随机肽库单克隆对照，4℃，孵育过夜。

（9）次日，吸弃噬菌体单克隆，用吸水纸轻轻吸干残液，PBS缓慢振荡洗涤8min×3次。

（10）分别加入预先稀释好的山羊抗M13多克隆抗体(按1:1500稀释于Blockingbuffer)，50μl/孔，37℃恒温培养箱孵育1.5h，每间隔15min于脱色摇床上缓慢轻摇。

（11）吸去一抗，用吸水纸轻轻吸干残液，PBS缓慢振荡洗涤8min×3次。

（12）加入1:8000稀释的HRP标记的兔抗山羊IgG，100μl/孔，37℃恒温培养箱孵育1h，每间隔15min于脱色摇床上缓慢轻摇。

（13）吸去二抗，用吸水纸轻轻吸干残液，PBS缓慢振荡洗涤8min×3次。

（14）吸水纸轻轻吸干PBS残液,每孔加入现配制的TMB显色工作液100μl，37℃恒温培养箱孵育30min，白色背景下肉眼观察，阳性噬菌体克隆孔应为蓝色或者深蓝色，PBS孔和阴性噬菌体克隆孔应为无色或者淡蓝色。

（15）加入2M H2SO4终止反应，50μl/孔，用酶标仪测定450nm波长下的OD值，记录数据。

（16）分析酶标仪的测定结果，P/n≥2.1时阳性，1.5≤P/n≤2.1为可疑阳性，P/n≤1.5为阴性。重复上述实验过程3次，3次ELISA测定结果P/n≥2.1的噬菌体克隆为阳性克隆。P/n=OD值胃癌SGC-7901细胞/OD值人胚肾HEK293细胞（空白孔校对T=100%）。

（17）接种胃癌SGC-7901细胞于96孔板，重复上述ELISA实验步骤，进一步鉴定阳性噬菌体克隆与胃癌SGC-7901细胞的特异性亲和力，排除假阳性克隆，比较不同阳性噬菌体克隆与胃癌SGC-7901细胞的亲和力，每个单克隆设置8个复孔，同时设无关克隆对照和PBS对照。

2.2.6噬菌体克隆单链DNA的快速纯化

（1）按照上述噬菌体扩增的方法，扩增阳性噬菌体克隆，在第一步离心后，取500μl含噬菌体的上清转移入新的1.5ml灭菌离心管中。

（2）每管加入200μl PEG/NaCl，反复颠倒，混匀，室温静置10min。

（3）4℃，12000rpm，离心20min，弃上清，再短暂离心，用移液器小心吸去残留上清。

（4）加100μl碘化物缓冲液彻底重悬沉淀物，再加250μl冰的无水乙醇。将混悬液于室温温育10min，短时间室温温育使噬菌体单链DNA得以沉淀，而大多数的噬菌体蛋白仍保持在溶液中。

（5）4℃，12000rpm，离心15min，弃上清，70%乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。

（6）加入30μl TE(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)重悬沉淀，此悬液即为DNA测序模板液。

2.2.7噬菌体单链DNA的序列测定

分别取5μl上述阳性噬菌体克隆、原始噬菌体肽库(无关克隆)对照和阴性噬菌体克隆的相应模板液，-96gⅢ测序引物：5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’，送南京金斯瑞生物科技有限公司全自动测序。根据噬菌体展示随机十二肽库使用手册读序图，应用Word文档中的查找功能找到KpnⅠ酶切位点GGTACC和EgalⅠ酶切位点CGGCCG，十二肽序列即插入在这两个酶切位点之间，从EgalⅠ酶切位点后数十个碱基，即可找到12肽的插入序列（EgalⅠ酶切位点上游的36个碱基为编码十二肽序列的密码子），利用DNAStar软件阅读出正确的十二肽模板碱基序列，再按照十二肽库设计原则，每个密码子的第三位碱基均为T或G，进一步验证是否找到了正确的碱基序列，分开三联密码子，按照噬菌体展示随机十二肽库使用手册提供的精简遗传密码表翻译成多肽序列。

2.2.8阳性噬菌体克隆的氨基酸序列的同源性及特征分析

通过NCBI/BLAST软件分析，将翻译的氨基酸序列同数据库中已知蛋白质的氨基酸序列的同源性进行分析比较，出现频率较高的序列应用ExPASY提供的软件ProtParamtools来分析十二肽序列的组成及特点，多肽序列的疏水性利用FASTA工具来分析。

2.2.9细胞免疫荧光法检测阳性噬菌体克隆的靶向性

（1）细胞爬片的准备

①将5mm×5mm盖玻片用自来水冲洗，稀盐酸浸泡24h，流水冲洗干净，铬酸浸泡过夜，自来水冲洗干净，再用一蒸水、三蒸水分别冲洗三次，晾干，置于玻璃培养皿中高压灭菌，备用。

②无菌操作，将盖玻片放入6孔细胞培养板中，培养板中滴加少量细胞培养液，使盖玻片贴附到培养板底部。

③取指数期生长状态良好的人胚肾HEK293细胞和胃癌SGC-7901细胞，吸弃旧培养基，PBS洗两遍，胰蛋白酶消化收集细胞，室温，800rpm离心3min。

④吸弃上清，加培养液重悬细胞，细胞计数，接种至6孔细胞培养板中，5×10⁵cells/ml，2ml/well，置于37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱，培养24h。

（2）细胞免疫荧光法鉴定阳性噬菌体克隆的靶向性

①待6孔板中HEK293细胞和SGC-7901细胞培养至长满单层，吸弃旧培养基，PBS轻轻洗涤3次，吸弃PBS，4%多聚甲醛固定细胞，室温，30min。

②吸弃固定液，PBS轻轻洗涤3次。

③弃PBS，滴加1%BSA，37℃恒温培养箱，封闭30min。

④吸弃封闭液，分别将展示GSP1～5多肽序列的阳性噬菌体克隆滴加至细胞表面（1×10¹²pfu)，37℃恒温培养箱孵育3h。

⑤PBS轻轻洗涤3次，加山羊抗M13多克隆抗体(工作浓度1:300)，4℃，过夜。

⑥次日，PBS轻轻洗涤3次，加FITC标记的兔抗山羊IgG(工作浓度1:100)，37℃避光孵育30min

⑦吸弃二抗，加PBS轻轻洗涤3次，滴加DAPI（工作浓度1:2000），室温避光孵育5min。

⑧滴加PBS轻轻洗涤3次，取90%缓冲甘油封片，避光，尼康Ti-S倒置显微镜下观察并拍照记录。

2.2.10统计学处理

应用SPSS16.0统计学处理软件分析数据，所得数据均以

表示，组间的多重比较采用Duncan软件检验处理。P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

三、实验结果

3.1噬菌体随机十二肽库四轮差减筛选

为了得到与人胃癌SGC-7901细胞表面分子特异性结合的肽段，本发明以人胃癌SGC-7901细胞作为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞作为非特异性吸附细胞，采用BRASIL噬菌体展示技术对噬菌体随机十二肽库进行4轮差减筛选，回收每轮与胃癌SGC-7901细胞结合的噬菌体。筛选过程中，为了保证差减筛选结果的稳定性，必须严格控制每轮筛选中投放噬菌体的数量。随机十二肽噬菌体展示文库的效价为1.5×10¹³pfu/ml，筛选时每轮噬菌体的投放量为2.0×10¹¹pfu/ml，扩增、滴定，每一轮噬菌体的回收量都有很大提高，说明特异性噬菌体得到富集（结果见表1）。

表1：四轮消减筛选对噬菌体克隆的富集效应

3.2细胞ELISA法初步鉴定阳性噬菌体克隆的特异性亲和力

第4轮筛选获得的噬菌体库不经过扩增，直接在LB/IPTG/Xgal平板上测定洗脱物的滴度，从总数不到100个蓝斑的平板上随机挑取50个噬菌体单克隆，让每个单克隆感染宿主菌进行扩增、滴定。利用细胞ELISA法初步鉴定随机挑取的50个噬菌体单克隆对胃癌SGC-7901细胞的特异性亲和力，同时，设噬菌体原库单克隆为无关克隆对照（URPs），设PBS为空白对照，重复三次实验，以OD_450nm处SGC-7901细胞A值/HEK293细胞A值＞2.1为标准挑选阳性噬菌体克隆14个，分别是SP1，SP2，SP5，SP6，SP8，SP16，SP21，SP31，SP32，SP36，SP38，SP42，SP46，SP49。它们与胃癌SGC-7901细胞亲和力较强，对人胚肾HEK293细胞的亲和力和敏感性较差，无关克隆对照组和PBS空白对照组观察到的蓝色较弱或者几乎无色。利用细胞ELISA法进一步鉴定14个阳性噬菌体单克隆和无关克隆及PBS与胃癌SGC-7901细胞的特异性和敏感性，并应用统计学方法对ELISA的数据结果进行分析，结果显示，14个阳性噬菌体克隆对胃癌SGC-7901细胞的敏感性均显著高于对照组（P<0.01），其中SP32号克隆与SGC-7901细胞结合的OD_450nm值最高，与其他阳性噬菌体克隆比较，差异显著（P<0.05），其靶向性有待深入研究。

表2：ELISA鉴定阳性噬菌体克隆与SGC-7901细胞的亲和力

**：P﹤0.01与噬菌体无关克隆（URPs）对照组及PBS对照组比较

#：P﹥0.05与PBS对照组比较

3.3噬菌体克隆的序列测定结果及分析

3.3.1测序结果

按照噬菌体随机展示肽库试剂盒的说明书提供的单链DNA提取方法，对细胞ELISA法鉴定获得的阳性噬菌体克隆、亲和力较低的阴性噬菌体克隆和噬菌体原始肽库无关克隆对照进行单链DNA的提取并测序，测序后得到DNA链的互补碱基序列，依据碱基互补配对原则，应用DNAStar软件将其转化为反向互补序列，并依据噬菌体展示肽库提供的测序分析方法，肽库中噬菌体插入片段位于酶切位点EagⅠ（CGGCCG）和酶切位点KpnⅠ（GGTACC）之间，找到插入序列并依据说明书中提供的遗传密码表推导出碱基序列对应的氨基酸序列，测序结果如下：

（1）噬菌体克隆：SP1，SP2，SP5，SP31和SP38

十二肽碱基序列：

TATACGCATAATGAGTCTTCTCCGAAGGATACGCAT

十二肽序列：YTHNESSPKDTH

（2）噬菌体克隆：SP21，SP36，SP49

十二肽碱基序列：

TATACTGTTCCTGATTATAAGCATAATTCGGCGCAT

十二肽序列：YTVPDYKHNSAH

（3）噬菌体克隆：SP6，SP16，SP42

十二肽碱基序列：

ACTCATCCTTGGCAGATTACGTCTGTGAATTTTAAG

十二肽序列：THPWQITSVNFK

（4）噬菌体克隆：SP8

十二肽碱基序列：

GATGTGTTTCCTCATTCGCGGCCTGCTGATGAGTTG

十二肽序列：DVFPHSRPADEL

（5）噬菌体克隆：SP32，SP46

十二肽碱基序列：

ATTCATAAGGATCCTGCGAATAAGTCGCTGGTTCCG

十二肽序列：IHKDPANKSLVP

（6）原始肽库噬菌体无关克隆

十二肽碱基序列：

AGTTATACGATTGAGCGGCATTGGCTTAGTTCTAAG

十二肽序列：SYTIERHWLSSK

（7）阴性噬菌体克隆：SP26

十二肽碱基序列：

TATATGGAGTCTGCTTATGCTTATCCTGTTTCTCGT

十二肽序列：YMESAYAYPVSR

（8）阴性噬菌体克隆：SP30

十二肽碱基序列：

TCTTTTACTACGGCTACGATTCAGCGGACGGGGGCT

十二肽序列：SFTTATIQRTGA

表3：噬菌体克隆测序序列

噬菌体克隆测序结果如表3所示，送去测序的17个克隆测序正确，含有插入的外源随机序列，并且在随机插入的序列区域内含有编码12肽的36个碱基，三个碱基为一个密码子，每一个密码子的第三位碱基是T或G，与噬菌体随机展示肽库的构建原则相符。测序结果显示，与胃癌SGC-7901细胞特异性结合的噬菌体克隆共分为五组：SP1，SP2，SP5，SP31和SP38克隆展示的共有序列为YTHNESSPKDTH；SP21，SP36和SP49克隆展示的共有序列为YTVPDYKHNSAH；SP6，SP16和SP42克隆展示的共有序列为THPWQITSVNFK；SP8克隆展示的序列为DVFPHSRPADEL；SP32和SP46克隆展示的共有序列为IHKDPANKSLVP；噬菌体原始肽库无关克隆展示的序列为SYTIERHWLSSK；亲和力较低的两个噬菌体克隆（阴性噬菌体克隆）序列分别为YMESAYAYPVSR、SFTTATIQRTGA。

3.3.2氨基酸序列的同源性分析

3.3.2.1五种多肽序列之间的氨基酸同源性分析

将获得的5条SGC-7901细胞特异性结合肽YTHNESSPKDTH、YTVPDYKHNSAH、THPWQITSVNFK、DVFPHSRPADEL、IHKDPANKSLVP分别命名为平GSP1、GSP2、GSP3、GSP4、GSP5。分析发现五条序列之间存在不同程度的重复，登陆网站EMBL EBI（http//www.ebi.ac.uk/Tools/Sequence Similarity&Analysis/align），进行五种多肽序列间的同源性分析保守的氨基酸位点。

表4：五种插入片段的氨基酸序列对比结果

注：Len表示多肽长度；Score表示同源性程度。

3.3.2.2与数据库中已知蛋白质氨基酸序列的同源性分析

登陆NCBI/BLAST网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），选择Bacic BLAST菜单下的protein blast，输入多肽序列，选择Non-redundant protein sequences(nr)数据库，限定为人源性（Homo sapiens），Program Selection选择blastp（protein-protein BLAST），将获得的5个十二肽序列分别与数据库中已知蛋白质氨基酸序列进行同源性分析。在噬菌体展示多肽库与胃癌细胞孵育过程中，对多肽与癌细胞表面受体或配体的结合起决定作用的可能是多肽全部氨基酸或者若干个关键性的氨基酸基序如丝氨酸、脯氨酸和组氨酸等。因此将上述五条多肽序列与蛋白质数据库中已知蛋白相比较，结果发现它们与一些已知的蛋白质或多肽具有同源性，GSP1与chondroitin sulfate proteoglycan4precursor等蛋白同源性较高；GSP2与guanine nucleotide binding protein-like3等蛋白具有较高同源性；GSP3多肽与alpha-2-macroglobulin-like protein1precursor等蛋白同源性较高；GSP4多肽与SET and MYND domain-containing protein4等同源性较高；GSP5多肽与KIAA1085protein等同源性较高。

3.3.2.3氨基酸序列组成及特点分析

将GSP1、GSP2、GSP3、GSP4、GSP5五条十二肽基序用ExPASy网站提供的软件ProtParam tool（http://cn.expasy.org/tools/protparam.html）来分析其氨基酸组成及其特点。

3.3.2.4五条多肽的疏水性分析

噬菌体表面展示的十二肽保持相对独立的空间结构，通过模拟配体蛋白中的氨基酸决定簇与细胞表面受体结合，这种结合往往需要满足一定的条件，如位于蛋白质的表面、具有亲水基团及一定的柔韧性等。由于蛋白质的N端和C端序列的氨基酸通常位于蛋白质表面，一般都带有亲水基团，如NH₄ ⁺和COO^-，通常具有一定的柔韧性，所以N端和C端通常被视为寻找氨基酸决定簇的理想位置，而噬菌体随机展示多肽也大多构建在衣壳蛋白的N端。疏水性氨基酸在蛋白质内部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白质的三级结构上起重要作用，在酶和基质、抗体和抗原间的相互作用等各种非共价键的分子结合方面也具有重要作用，例如在抗体的与抗原结合的部位上有很多疏水性氨基酸，它参与半抗原的结合。氨基酸疏水基团的作用力可以使小分子多肽能与蛋白质发生特异性结合，而且疏水基团集中的区域往往是具有较高同源性的部位。疏水性氨基酸有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸。疏水性最强的两种氨基酸分别是异亮氨酸（亲水指数为4.5）与缬氨酸（亲水指数为4.2）；亲水性最强的两种氨基酸分别是精氨酸（亲水指数为-4.5）和赖氨酸（亲水指数为-3.9）。利用ExPASy网站ProtParamtool工具分析5条多肽序列的疏水性，利用BioEdit软件中的Kyte&Doolittle MeanHydrophobicity Profile工具分析5条多肽每个氨基酸的疏水性。氨基酸的疏水指数介于-4.5～4.5之间，数字越大表示疏水程度越高，数字越小表示亲水能力越强，中间表示中性。五条多肽的亲水性分析表明，它们均为亲水性多肽，且GSP1的亲水性最强，GSP3的亲水性最弱。

表5：多肽基序的平均疏水性

注：表中的GSP2中的V、S（左起第3、10位点），GSP3中的I、V、F（左起第6、9、11位点），GSP4中的V、F、P（左起第2、3、8位点），GSP5中的I、A、L、V（左起第1、6、10、11位点）为疏水性位点，其余均为亲水性位点。表中，●表示疏水或亲水性不确定位点，○表示亲水性位点。

3.4阳性噬菌体克隆的免疫荧光鉴定

在六孔板里培养胃癌SGC-7901细胞和HEK293细胞，待细胞融合率达60%以上，吸弃培养基，PBS轻轻洗涤三次，4%多聚甲醛室温固定30min，PBS轻轻洗涤三次，1%BSA于37℃恒温培养箱封闭30min，将展示五条胃癌SGC-7901细胞特异性结合肽的阳性噬菌体克隆、噬菌体原始肽库无关克隆（URPs）对照及PBS对照分别与胃癌SGC-7901细胞和HEK293细胞于37℃恒温培养箱孵育2.5h，PBS轻轻洗涤三次，加山羊抗M13多克隆抗体(工作浓度1:300)，4℃，过夜，次日，PBS轻轻洗涤三次，加FITC标记的二抗（工作浓度1:100）于37℃恒温培养箱孵育30min，PBS轻轻洗涤，滴加DAPI（工作浓度1:2000），室温避光孵育5min，PBS轻轻洗涤，甘油封片，于倒置荧光显微镜下观察。结果见图4-5所示。由显示结果可知，展示与胃癌SGC-7901细胞特异性结合多肽GSP1～5的阳性噬菌体克隆均可以不同程度地结合到SGC-7901细胞上，细胞膜边缘和细胞表面可以观察到绿色荧光，其中GSP3和GSP5的SP16和SP32的噬菌体克隆的绿色荧光较强一些，HEK293细胞、无关克隆对照组及PBS对照组无绿色荧光。

四、本发明获得的研究成果及其意义

本发明以胃癌SGC-7901细胞为靶细胞，以人胚肾HEK293为吸附细胞，采用全细胞筛选策略，经过4轮消减筛选，经过酶联免疫吸附试验鉴定，随机挑取的30个噬菌体克隆中有8个阳性克隆，进一步鉴定8个阳性克隆与SGC-7901细胞的亲和力发现28号克隆亲和力最高，阳性克隆的测序获得5条共同多肽序列分别为YTHNESSPKDTH，YTVPDYKHNSAH，THPWQITSVNFK，DVFPHSRPADEL，IHKDPANKSLVP。同源性分析表明它们具有很高的序列同源性。BLAST检索蛋白数据库发现5条多肽基序与某些细胞表面受体具有同源性。细胞免疫荧光进一步鉴定展示5条多肽的噬菌体克隆均可以特异性靶向SGC-7901细胞，而不识别HEK293细胞。

本发明利用噬菌体多肽展示技术，筛选获得5条胃癌SGC-7901细胞特异性多肽，在胃癌早期检测和靶向治疗方面具有潜在的应用价值，在治疗方面，有望利用这些特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的短肽来取代传统化疗药物，或与某些化疗药物如顺铂、阿霉素等偶联，达到靶向给药的目的，减小化疗药物的非特异性和毒副作用；在胃癌早期检测方面，利用荧光标记的多肽可以结合胃癌细胞而非正常组织，胃癌细胞特异性多肽经放射性同位素标记能够在肿瘤组织中特异性富集，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，多肽对于肿瘤细胞分子标记物设计和造影剂的改造也具有重要意义，对于胃癌早期检测、癌细胞定位和疗效评价都具有重要意义。

Claims

1.SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到5条多肽片段，其氨基酸序列分别为：

YTHNESSPKDTH；

YTVPDYKHNSAH；

THPWQITSVNFK；

DVFPHSRPADEL；

IHKDPANKSLVP。

2.如权利要求1所述的SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的5条多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性。

3.如权利要求1所述的SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的5条多肽片段均为亲水性多肽。

4.如权利要求1所述的SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的5条多肽片段能够特异性结合SGC-7901细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。