CN103242429B

CN103242429B - 血管内皮细胞生长因子vegf抗原表位的模拟短肽及其应用

Info

Publication number: CN103242429B
Application number: CN201310173781.XA
Authority: CN
Inventors: 刘煜; 王刚; 甘牡丹; 王登; 徐剑; 王旋; 宋梦丹
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: CN103242429A

Abstract

本发明公开了一种血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽CPU-510-02及其应用。本发明所述的模拟短肽CPU-510-02的氨基酸序列为PSCVPLM，核苷酸序列为CCGTCCTGCGTTCCGCTGATG。体外实验证明本发明的模拟短肽在血管内皮细胞增殖、肿瘤细胞增殖过程中具有明显的抑制作用。因此，本发明所述的模拟短肽可用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物，而且其对于以VEGF受体为目标、诊断预测肿瘤的发生发展，探讨小分子多肽对肿瘤血管新生抑制剂的开发以及肿瘤导向性药物的开发和研究具有十分重要的参考价值。

Description

血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽及其应用

技术领域

本发明属于一种血管内皮细胞生长因子VEGF抗原，特别涉及一种血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽及其应用。

背景技术

VEGF是1989年Ferrara在牛垂体滤泡星形细胞体外培养液中首先纯化出来的一种相对分子量在34-42KD的同源二聚体蛋白。人类的VEGF基因结构位于染色体的6p21.3上，由8个外显子和7个内含子交替构成。根据其mRNA的剪切方式不同，可以产生5种不同的VEGF异构体，包括VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145和VEGF121。这5种VEGF的异构体均具有诱导内皮细胞增殖的活性，是一种有效的血管形成和通透性诱导因子，其差异主要在于它们与细胞表面以及细胞外基质中的肝素具有不同的亲和能力。

VEGF通过与其相应的VEGF受体结合来发挥作用。目前克隆出的VEGF受体主要有Fit-1和KDR/Flt-1两种，二者均具有酪氨酸激酶活性，是一种跨膜的糖蛋白，选择性的表达于内皮细胞表面，通过启动不同的信号通路来发挥生物学作用，即促进内皮细胞增殖、促进血管的形成以及血管通透性的增加等。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一种用于筛选功能性多肽或抗体的生物技术。Smith于1985年首次成功将外源基因通过基因工程手段插入丝状噬菌体基因组中，使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，从而建立了噬菌体展示技术。其原理是以噬菌体为载体，将外源核酸片段克隆至噬菌体外壳蛋白基因中形成融合，并以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，众多的融合型噬菌体便组成了噬菌体展示库。随后，用固定化的靶分子去筛选与之亲和的噬菌体。通过与特定的靶标反应，不能结合的噬菌体被洗脱掉，而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增和富集，实现高通量筛选。它的优势在于将表现型与基因型直接联系在一起，确保能方便快捷的展示出目的蛋白以及该蛋白的基因序列。基于此，近年来在多肽序列鉴定、多肽模拟物的结构和功能的研究以及在人类病毒、细胞、肿瘤等多种生物靶组织多肽的研究方面，噬菌体展示技术发挥着重要的不可替代的作用。

研究表明，VEGF和其受体在许多肿瘤组织中有高表达，在乳腺癌、肺癌、大肠癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肉瘤、腺瘤等多种肿瘤组织内、外均可检测到大量的VEGF。原位杂交试验显示VEGF的mRNA主要分布在肿瘤细胞内，且肿瘤细胞也高度表达Flk-1，提示肿瘤局部存在自分泌和旁分泌机制促进血管生长。VEGF的表达程度与肿瘤的组织学类型、原发肿瘤的大小、有无血管或淋巴管转移等多种因素有关：肺腺癌组织中VEGF的表达程度显著高于鳞癌；VEGF高表达者，淋巴结转移和远处转移明显增高；低分化肿瘤患者的VEGF表达高于高分化者；VEGF阳性患者的复发率高、预后差、早期死亡率高。而肿瘤患者的年龄、性别、肿瘤生长部位等与VEGF表达无关。鉴于此，研究者们设想，如果能通过噬菌体展示技术得到一系列VEGF的相关表位序列，制成小分子多肽，为今后抗原肽疫苗的研发提供支持，在人体内产生专门针对VEGF的抗体，将会对人体内恶性肿瘤的治疗发挥巨大作用。

与传统化疗药物相比，多肽作为抗肿瘤化合物具有高选择性、低毒性、不产生耐药性的优点。同时，多肽长效化手段日益丰富，使得多肽在体内稳定性增加，半衰期延长。但是，大分子多肽还有可能引发机体的免疫应答，这大大限制了多肽药物的广泛运用。本发明所述的血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽正是具有如上优点，在用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物等方面具有广阔的前景。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽。

本发明的另一目的在于提供所述血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽，其氨基酸序列为Seq NO.1，具体为Pro Ser Cys Val Pro Leu Met，即PSCVPLM；

所述血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽的核苷酸序列如下所示：为SeqNO.2，具体为CCGTCCTGCGTTCCGCTGATG；

所述的血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为黑色素瘤、胃癌肿瘤或肝癌肿瘤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明所述血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽根据人的VEGF165肽段序列通过噬菌体展示技术获得，是全新序列。本发明所述血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽，易于通过生物及化学方法合成构建。与目前已公开的相关VEGF表位多肽专利(内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽12B及其应用，201010019511.X.，2010-09-22)相比，本发明只有7个氨基酸，具有更短的氨基酸序列，更易于通过生物及化学的方法进行合成构建。体外相关的实验证明模拟短肽在内皮细胞增殖、肿瘤细胞增殖过程中具有明显的抑制作用，也就是其具有明显的抗肿瘤和抗血管新生作用。本发明所述的血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽对于以VEGF受体为目标、诊断预测肿瘤的发生发展，探讨小分子多肽对肿瘤血管新生抑制剂的开发以及肿瘤导向性药物的开发和研究具有十分重要的参考价值。

附图说明

图1是模拟短肽在含有VEGF条件下对人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖抑制作用结果图。

图2是模拟短肽在不含有VEGF条件下对人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖抑制作用结果图。

图3是模拟短肽对黑色素瘤细胞B16F10的增殖抑制作用结果图。

图4是模拟短肽对胃癌细胞SGC7901的增殖抑制作用结果图。

图5是模拟短肽对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用结果图。

具体实施方式

以下实施例所用材料和仪器设备为：

实施材料：大肠杆菌ER2738(美国New England Biolabs公司)、噬菌体随机7肽库(美国New England Biolabs公司)、抗VEGF单克隆抗体(按文献方法制备Yu Liu，*，Dong-jie Yun，Jian-quan Chen，Jian-yang Zhao，Si-guo Liu，Guo-xiang Cheng.Isolation and characterization ofhuman anti-VEGF 165monoclonal antibody with antitumor efficacy from transgenic miceexpressing human immunoglobulin loci.Cancer letters，2009)、HRP-M13抗体(GE Healthcare公司)、DMEM高糖培养基(Gibco公司)、RPMI-1640(Gibco公司)、小牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、MTT(Generay biotechnology公司)。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

通过噬菌体展示的方法，得到内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽CPU-510-02：

(1)通过噬菌体随机肽库的筛选，得到内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽CPU-510-02的核苷酸序列：

A.噬菌体随机7肽库的生物淘洗：将抗VEGF单克隆抗体用包被液(0.1M NaHCO₃，pH8.6)稀释至100μg/ml，用150μl该溶液包被酶标板的一个孔，4℃过夜。吸出包被液，加入封阻液(0.1M NaHCO₃，pH8.6，5mg/ml BSA)，4℃至少作用一个小时。吸出封阻液，用0.1％TBST[TBS+0.1％(v/v)Tween-20]洗6次。用100μlTBST稀释10μl原始噬菌体多肽库，然后加入用抗VEGF单克隆抗体包被的孔中，室温作用1小时，倾倒未结合的噬菌体，用0.1％TBST冲洗10次。然后加入100μl洗脱液(0.2M Glycine-HCl，pH2.2，1mg/mLBSA)作用8分钟，吸出洗脱液，再用15μl的1M Tris-HCL(pH9.0)中和上述洗脱液。吸取1μl已中和的洗脱液测定滴度，其余液体加入20ml含1％ER2738的LB培养基(含1/1000四环素贮液)37℃剧烈培养4.5小时；转移菌液至离心管中，4℃12000g离心10分钟去沉淀，上清液加入1/6体积的PEG8000/NaCl，4℃过夜；12000g离心15分钟，沉淀用1mlTBS重悬，转入微量离心管中，14000rpm离心5分钟，取上清，再次加入1/6体积的PEG8000/NaCl，冰上作用60分钟，14000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用200ulTBS重悬。按以上步骤进行第2，3轮筛选，每轮筛选一次减少抗VEGF当克隆抗体的包被浓度，改为80μg/ml和50μg/ml，洗脱液改成100μg/ml的抗VEGF单克隆抗体来进行特异性洗脱，改用0.5％TBST进行洗涤，提高筛选的特异性。

B.噬菌体滴度测定：未扩增噬菌体用LB稀释范围：10-10⁴，扩增的噬菌体用LB稀释范围：10⁸-10¹¹。取1μl上述稀释的噬菌体，加入200μl对数中期ER2738中，作用5分钟，将得到的感染菌体加入3ml上层琼脂中，然后铺在预热的IPTG/Xgal/Tet平板上，37℃倒置避光过夜，计算平板上的蓝色噬菌斑数量，用噬菌斑数量乘以稀释倍数即可得到噬菌体滴度。

C.噬菌斑的扩增：测定第三轮未扩增的噬菌体滴度，准备30份1ml含1％ER2738的LB培养基(含1/1000四环素贮液)。用灭菌牙签挑第三轮筛选测定滴度的平板上的蓝色噬菌斑30个到上述培养基中，37℃摇床培养4.5小时，培养物转入微量离心管中，离心30秒，上清转入新的离心管中再离心，将80％上清转入新的离心管中，此即为扩增的噬菌体贮液，4℃贮存。

D.ELISA鉴定阳性噬菌体克隆：取5μl步骤C中所得的噬菌体贮液，加入20ml含1％ER2738(含1/1000四环素贮液)LB培养基中，37℃培养4.5小时，培养物转入离心管中，12000g离心10分钟，上清转入新管中，再离心。取80％上清转入新离心管中，加入1/6体积PEG8000/NaCl，4℃过夜。再次12000g离心15分钟，弃上清，沉淀重悬于1mlTBS中，转入微量离心管中，再加入1/6体积PEG8000/NaCl，冰上作用60分钟，14000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于50μlTBS中，此即为扩增的噬菌体贮液，测定滴度，准备进行ELISA鉴定。

准备1μg/ml的抗VEGF单克隆抗体(用0.1M的NaHCO₃稀释)。对于30个待鉴定的噬菌体克隆，每个包被酶标板板1排，用抗VEGF单克隆抗体包被，每排设置4个噬菌体梯度并设置未包被空白孔为阴性对照，包被好的酶标板放置4℃过夜。吸出出多余靶分子溶液，加入封阻液，4℃作用1小时。甩出封阻液，用0.5％TBST洗板6次，取步骤D中扩增的噬菌体，稀释四个数量梯度(分别为10⁹，10¹⁰，10¹¹，10¹²pfu)，加入包被好的孔中，室温作用1小时。用0.5％TBST洗板6次，加入1∶5000稀释HRP-M13抗体，作用1小时。用0.5％TBST洗板6次，加入OPD显色液，显色30分钟后加入2M H₂SO₄终止反应。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。以OD值高于阴性对照2倍作为阳性克隆。

E.阳性噬菌体单链DNA的提取及测序：取500μl步骤C中噬菌体贮液，加入200μlPEG8000/NaCl放置10分钟，14000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇，室温作用10分钟，14000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μl TE[10mMTris-HCl，1mMEDTA〕中，取上述溶液测序。本次测序由英俊公司完成。

(2)将得到的测序结果翻译，然后与VEGF氨基酸序列比对，选取同源性高的短肽序列获的模拟短肽CPU-510-02，其核苷酸序列为Seq NO.2，氨基酸序列为Seq NO.1，并送至上海吉尔生化公司合成模拟短肽CPU-510-02。

实施例2

多肽对人脐静脉内皮细胞HUVEC、黑色素瘤细胞B16F10、胃癌细胞SGC7901和肝癌细胞HepG2的增殖抑制试验：

(1)MTT法测抗原表位肽在含有VEGF情况下对HUVEC增殖抑制作用：取对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC，用适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)，用含10％小牛血清的DMEM的培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态；弃去培养基，加入含有5％小牛血清、VEGF和不同稀释浓度的抗原表位肽的DMEM培养基，并设立空白对照，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养48小时；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该抗原表位肽具有明显的抑制HUVEC细胞增殖的效用，如图1所示，在100ng/ml的抗原表位肽浓度下，表位肽CPU-510-02对HUVEC的生长抑制率达到51.48％。

(2)MTT法测抗原表位肽在不含有VEGF情况下对HUVEC增殖抑制作用：取对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC，用适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)，用含10％小牛血清的DMEM的培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态；弃去培养基，加入含有5％小牛血清和不同稀释浓度的抗原表位肽的DMEM培养基，并设立空白对照，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养48小时；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该抗原表位肽具有明显的抑制HUVEC细胞增殖的效用，如图2所示，在100ng/ml的抗原表位肽浓度下，表位肽CPU-510-02对HUVEC的生长抑制率达到21.77％。

(3)MTT法测抗原表位肽对黑色素瘤B16F10的增殖抑制作用：取对数生长期的黑色素瘤细胞系B16F10，用适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度分至96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态；弃去培养基，加入含有10％小牛血清和不同稀释浓度的抗原表位肽的RPMI-1640培养基，并设立空白对照，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养48小时；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测各孔吸值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该抗原表位肽具有明显的抑制黑色素瘤B16F10细胞增殖的效用，如图3所示，在100ng/ml的抗原表位肽浓度下，表位肽CPU-510-02对黑色素瘤B16F10的生长抑制率达到42.21％。

(4)MTT法测抗原表位肽对胃癌细胞SGC7901的增殖抑制作用：取对数生长期的胃癌细胞SGC7901，用适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度分至96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态；弃去培养基，加入含有10％小牛血清和不同稀释浓度的抗原表位肽的RPMI-1640培养基，并设立空白对照，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养48小时；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测各孔吸值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该抗原表位肽具有明显的抑制黑色素瘤B16F10细胞增殖的效用，如图4所示，在100ng/ml的抗原表位肽浓度下，表位肽CPU-510-02对胃癌细胞SGC7901的生长抑制率达到48.25％。

(5)MTT法测抗原表位肽对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用：取对数生长期的肝癌细胞HepG2，用适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度分至96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态；弃去培养基，加入含有10％小牛血清和不同稀释浓度的抗原表位肽的RPMI-1640培养基，并设立空白对照，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养48小时；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测各孔吸值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该抗原表位肽具有明显的抑制黑色素瘤B16F10细胞增殖的效用，如图5所示，在100ng/ml的抗原表位肽浓度下，表位肽CPU-510-02对肝癌细胞HepG2的生长抑制率达到51.32％。

以上实验结果表明，本发明所述的血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽CPU-510-02，对人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖抑制作用达到了51.48％，对黑色素瘤细胞B16F10、胃癌细胞SGC7901和肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用分别打达到了42.21％、48.25％和51.32％，具有明显的抗肿瘤和抗血管新生作用。对肿瘤血管新生及肿瘤抑性药物的开发和研究具有广阔的前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽，其特征在于：所述模拟短肽的氨基酸序列如Seq NO.1。

2.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽，其特征在于：所述模拟短肽的核苷酸序列如Seq NO.2。

3.权利要求1所述血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的血管内皮细胞生长因子VEGF抗原表位的模拟短肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为黑色素瘤、胃癌肿瘤或肝癌肿瘤。