发明内容
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗糖尿病的药物组合物。
本发明所提供的预防和/或治疗糖尿病的药物组合物由山楂黄酮与黄芪多糖组成,其中,所述山楂黄酮与黄芪多糖的质量比为4∶1-1∶2,优选质量比为2∶1-1∶2,最优选质量比为1∶1。
上述山楂黄酮和黄芪多糖的质量均以其有效物质的含量计。
所述山楂黄酮是从山楂果实(Fructus Crataegi Pinnatifidae)中提取得到的。
具体方法如下:取山楂生药用体积分数为65-85%乙醇水溶液回流提取,收集提取液并浓缩至无醇,过滤除去沉淀,将上清液用pH值3-4的水稀释至每ml含0.1g生药。
其中,所述山楂生药与所述体积分数为65-85%乙醇水溶液的质量比为1∶(6-10)。所述回流提取可进行2-3次,每次提取的时间为1-2小时。
为了保证沉淀除去充分,所述方法还包括将浓缩的提取液在低温放置过夜的步骤。
为了进一步对所得产品进行纯化,所述方法还包括下述步骤:将稀释后的上清液上D101大孔树脂,用3-5倍柱体积的蒸馏水冲(pH3-4),后用2-4倍柱体积体积分数为75-85%乙醇水冲洗,浓缩至1.0g/ml生药,喷雾干燥而成。
所述黄芪多糖是从黄芪根(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge)中提取得到的。
具体方法如下:取黄芪用水回流提取,收集提取液并浓缩,得浓缩液;向所述浓缩液中加入乙醇或乙醇溶液,低温静置过夜,离心,抽滤,真空干燥得黄芪多糖。
其中,所述黄芪与所述水的质量比为1∶(6-10)。所述回流提取可进行2-3次,每次提取的时间为1-2小时。所述乙醇溶液具体可为体积分数为90%-95%的乙醇水溶液。所述乙醇或乙醇溶液的加入量为所述浓缩液体积的2.5-4倍。
本发明的再一个目的是提供所述药物组合物的应用。
本发明所提供的药物组合物的应用是该组合物在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。所述糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
同时,以本发明所提供的药物组合物为活性成分制成的预防和/或治疗糖尿病的药物也属于本发明的保护范围。
所述药物可通过口服、外用、注射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉或粘膜组织;或是被其它物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体及润滑剂等。
该药物可以制成药学上可接受的任何剂型,如片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂和浸膏剂等。上述各种剂型的药物均可以按照常规制剂的方法制备。
上述药物可单独或与其它药物组合用于预防和/或治疗糖尿病及其并发症。
本发明提供的治疗糖尿病的中药组合物,其活性成分主要为山楂黄酮与黄芪多糖,其中,山楂黄酮与黄芪多糖净含量的最佳质量比为4∶1-1∶2。山楂黄酮与黄芪多糖小鼠实验有效净含量总量为每天200-800mg/kg,临床推荐复方组分有效剂量为成年人每天800-2600mg,服药方式为口服。
本发明通过选取降糖与调脂处方中使用频率最高的两味中药黄芪及山楂,通过精制两者的活性组分,使质量易于控制,通过适当配比,发现组合物具有显著的降低糖尿病空腹及餐后血糖、改善胰岛素敏感性,改善糖尿病症状,并且抑制高脂食物所引起的糖代谢紊乱,其作用机制与保护与修复胰岛细胞功能有关,而黄芪及山楂组分单独给药,均未显示理想的降糖效应。
本发明提供的中药复方制剂价格低廉,工艺简单,质量可控,可以口服,天然无毒,降糖明显,机理为保护胰岛细胞,但没有目前胰岛保护药物所具有的副作用,因而具有较大的应用前景。
附图说明
图1为糖尿病小鼠在连续给药2周后不同时间点血糖变化情况。对照,糖尿病对照组;4比1,2比1,1比1,1比2,1比4指各组分别给予黄芪多糖与山楂黄酮净含量比为4∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶4(总量为400mg/kg/d)。数据表示为均数±标准差(n=6),*P<0.05,**P<0.01。
图2为糖尿病小鼠在给药后不同时间点血糖变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。数据表示为均数±标准差(n=10),*P<0.05,**P<0.01。
图3为糖尿病小鼠在给药后不同时间点食物摄取变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。
图4为糖尿病小鼠在给药后不同时间点摄水变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。
图5为糖尿病小鼠在给药后不同时间点空腹血糖变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。数据表示为均数±标准差(n=10),*P<0.05,**P<0.01。
图6为糖尿病小鼠在给药4周后空腹血清胰岛素水平的变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。数据表示为均数±标准差(n=10),**P<0.01。
图7糖尿病小鼠在给药4周后胰岛细胞病理变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组(n=6)。
图8糖尿病小鼠在给药4周后胰腺组织PDX-1表达变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。数据表示为均数±标准差(n=6),**P<0.01。
图9糖尿病小鼠在给药4周后餐后血糖的变化情况。N,正常组;DM,糖尿病模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。数据表示为均数±标准差(n=6),*P<0.05,**P<0.01。
图10高脂C57BL/6J小鼠在给药后不同时间点血糖变化情况。N,正常组;HFD,高脂模型组;HS,黄芪联合山楂组;H,黄芪组;S,山楂组;MF,二甲双胍组。数据表示为均数±标准差(n=10),*P<0.05,**P<0.01。
图11糖尿病小鼠在给不同浓度的山楂黄酮和黄芪多糖后血糖变化情况。N,正常组;D,高脂模型组;L-HS,低浓度黄芪联合山楂组;H-HS,低浓度黄芪联合山楂组。数据表示为均数±标准差(n=10),*P<0.05,**P<0.01。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的实验材料如下:
NIH雄性小鼠(4周龄)购自广东省医学实验动物中心(SPF级,许可证号:SCXK(粤)2008-0002)。SPF级食物购自广东省医学实验动物中心。
雄性C57BL/6J小鼠(4周龄)购自广东省医学实验动物中心(SPF级,许可证号:SCXK(粤)2008-0002)。高脂食物(脂肪占热量比重为40%)购自中国科学院上海史莱克实验动物中心。
葡萄糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)临床检测试剂盒购自北京北控生物工程公司。小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。
实施例1、治疗糖尿病药物的制备
黄芪多糖以黄芪根为原料,经常规提取工艺,喷雾干燥制备而成,经检测多糖含量为50%。具体方法如下:取黄芪饮片500g(深圳市立丰医药公司,批号111128),加入10倍量的蒸馏水回流提取2h,滤过,滤渣加入10倍量水再次提取1h,滤过。两次滤液合并后浓缩至500ml,加入3倍量体积分数为95%乙醇溶液,低温静置过夜,离心,抽滤,真空干燥得黄芪多糖。
山楂黄酮以山楂果实为原料,经常规提取工艺,喷雾干燥制备而成,经检测黄酮含量为30%。具体方法如下:取山楂生药500g(深圳市立丰医药公司,批号120227),用8倍量70%乙醇溶液回流提取3次(1小时/次),合并提取液,浓缩至无醇,低温放置过夜,次日用棉纱布除沉淀,上清液用蒸馏水(PH3-4)稀释至每ml含0.1g生药。该上清稀释液上D101大孔树脂,用3-5倍柱体积的蒸馏水冲(PH3-4),后用3倍柱体积80%乙醇溶液冲洗,浓缩至1.0g/ml生药,喷雾干燥而成。室温避光密闭保存。临用前用蒸馏水新鲜配制成混悬液体供灌胃用。
实施例2、不同比例的药物配比对糖尿病小鼠口服糖耐量实验的影响
一、NIH小鼠糖尿病模型的制作
NIH雄性小鼠(20g左右)禁食24小时后,用100mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin,美国Sigma公司)腹腔注射一次(链脲佐菌素用事先冰浴的枸橼酸缓冲液新鲜配制(0.1M,pH4.5),在5分钟内注射完毕)。10天后,血糖稳定升高(血糖为11.1mmol/L以上)的小鼠即为NIH小鼠糖尿病模型。
二、口服糖耐量实验
糖尿病小鼠隔夜禁食后,灌胃2.5g/kg葡萄糖溶液,于时间点0,0.5,1及2小时分别于小鼠眼眶取血,离心分离血清,检测葡萄糖浓度,比较各时间点血糖及血糖-时间曲线下面积的变化。
在糖尿病小鼠模型,每组6只,黄芪多糖与山楂黄酮主要有效成分净含量按1∶4,1∶2,1∶1,2∶1,4∶1比例进行混合,总量为400mg/kg进行口服给药,连续2周,对照给予溶解药物用的蒸馏水,进行口服糖耐量实验。
实验结果表明,黄芪多糖与山楂黄酮净含量比为1∶1,1∶2,2∶1时,抑制餐后血糖的效果显著,其中以1∶1的比例效果最好。而黄芪多糖与山楂黄酮净含量为4∶1,有一定降低趋势,但效果相对较差。因此,接下来的实验以黄芪多糖与山楂黄酮净含量比为1∶1时进行实验。
实施例3、治疗糖尿病的药物的药效
一、NIH小鼠糖尿病模型的制作
同实施例2。
二、NIH小鼠糖尿病模型的给药
糖尿病模型筛选成功后,进行分组(n=10),按下列药物组分进行灌胃给药,连续四周。
黄芪多糖和山楂黄酮混合治疗组(HS):在NIH小鼠糖尿病模型,黄芪多糖与山楂黄酮按净含量1∶1的比例进行混合,此处均按净含量200mg/kg/天进行灌胃给药。
黄芪多糖单独治疗组(H):在NIH小鼠糖尿病模型,黄芪多糖按按净含量200mg/kg/天进行灌胃给药。
山楂黄酮单独治疗组(S):在NIH小鼠糖尿病模型,山楂黄酮按净含量200mg/kg/天进行灌胃给药。
阳性对照二甲双胍组(MF):在NIH小鼠糖尿病模型,阳性药二甲双胍(天津太平洋医药科技集团,生产批号071101)按净含量200mg/kg/天进行灌胃给药。
糖尿病对照组(DM):在NIH小鼠糖尿病模型,给予等体积的混悬药物的蒸馏水。
正常对照组(N):另外取正常对照小鼠,给予等体积的混悬药物的蒸馏水,进行相应处理与观察。
每次血液收集应在小鼠隔夜空腹后,另外血液收集前12小时,停止给药,防止药物对血糖等生化测定的干扰。
三、药效检测
1、体重、摄水量和摄食量
和正常比较,糖尿病小鼠体重在第0,17及24天时出现显著下调,其它时间点也出现下调,但无统计学显著意义(图2)。黄芪和山楂联合用药后,糖尿病小鼠体重无明显影响,后期轻度下调,但无统计学意义。但山楂单独给药后期体重出现进一步显著下降,黄芪单独给药也出现一定程度下降。阳性药二甲双胍与糖尿病对照比较,体重轻度下降,但无统计学显著性意义。
与正常小鼠比较,糖尿病模型小鼠食物摄取显著高于正常小鼠,后期尤其明显(图3)。与糖尿病模型组比较,黄芪联合山楂给药组,山楂单独给药组,二甲双胍组食物摄取显著低于模型组,但黄芪单独给药组,却无明显变化。
与正常组比较,糖尿病小鼠摄水显著增加(图4)。与糖尿病对照比较,黄芪联合山楂组,山楂单独给药组,二甲双胍组均可减少糖尿病动物摄水,以黄芪联合山楂组效果最好。但黄芪单独给药组,却对糖尿病小鼠摄水无明显影响。
综上所述,黄芪多糖联合山楂黄酮用药可显著改善糖尿病的多饮,多食的症状,但对体重没有明显的影响,不会出现增加体重增加的情况,这对于肥胖型的2型糖尿病患者来说,是具有一定应用前景的。
2、血糖
与正常组比较,糖尿病小鼠血糖连续四周均显著升高,表明已经形成不可逆转的糖尿病模型(图5)。但给予药物,前2周均无明显的作用,从第3-第4周,黄芪联合山楂组、二甲双胍组均显示显著的降低血糖作用,其中黄芪联合山楂组降糖作用更为明显,但山楂单独给药组未显示明显的降糖效应,相反黄芪单独给药,还表现出升高血糖的效应。
综上所述,黄芪多糖联合山楂黄酮用药作用比较缓和,但疗效显著,可降低空腹血糖,可用于控制1型及2型糖尿病患者血糖。
3、血清胰岛素水平
与正常组比较,糖尿病模型组血胰岛素水平显著降低,但黄芪联合山楂组、山楂单独给药组、二甲双胍组后,血清胰岛素水平显著增加,其中以黄芪联合山楂组最为明显,而黄芪单独给药组则无明显变化(图6)。
综上所述,黄芪多糖联合山楂黄酮用药抗糖尿病作用可能与促进胰岛素释放或修复胰岛功能有关。
4、胰腺H&E染色
糖尿病模型与正常组比较,胰岛细胞存在明显的玻璃样变性,胰岛里面均质红染明显,系初期胰岛细胞炎症坏死后纤维化的结果,胰岛萎缩,甚至消失(图7)。而山楂联合黄芪,可促进胰岛细胞新生,胰岛细胞玻璃样变性减少,山楂单独使用也可促进胰岛细胞新生,玻璃样变性减少,但作用弱于山楂联合黄芪组,黄芪单独未出现明显的效应。
综上所述,黄芪多糖联合山楂黄酮用药抗糖尿病作用确实涉及修复胰岛病理学改变。
5、胰腺组织PDX-1的表达
与正常组比较,糖尿病小鼠PDX-1表达显著下调(图8)。但黄芪联合山楂组、山楂单独给药组、二甲双胍组则显著上调糖尿病小鼠PDX-1的表达,以黄芪联合山楂组最为明显,而黄芪单独给药组则无明显的影响。
PDX-1是一种胰岛β细胞新生与修复的重要因子。黄芪多糖联合山楂黄酮用药修复胰岛功能可能与促进胰岛细胞PDX-1的表达有关,详细的作用机制有待进一步阐明。
实施例4、给药后小鼠的糖耐量实验
一、口服糖耐量
1、NIH小鼠糖尿病模型的制作
同实施例2的步骤一。口服糖耐量实验同实施案例2。
二、NIH小鼠糖尿病模型的给药
与正常组比较,糖尿病模型血糖显著升高,血糖曲线下面积显著增加(图9)。与糖尿病模型组比较,黄芪联合山楂给药组、山楂单独给药组、二甲双胍组则显著抑制血糖升高,血糖曲线下面积显著降低,但黄芪单独给药组对餐后血糖无明显的影响。
综上所述,黄芪多糖联合山楂黄酮用药可用于控制糖尿病餐后血糖的升高。
实施例5、给药后对高脂食物诱导的C57BL/6J小鼠糖代谢紊乱的干预实验
雄性的C57BL/6J(四周龄)给予高脂食物2周,2周后同时给予药物,具体给药方案如分组同实施例2,连续灌胃3周,调查药物对空腹血糖的影响。
实验结果表明,高脂食物给予3周,血糖中毒升高,表明高脂能引起糖代谢紊乱,该模型具有2型糖尿病特征(图10)。但用黄芪联合山楂干预后,血糖紊乱被适度纠正,与阳性药二甲双胍作用相似,而山楂单独给药未发现明显的降糖效应,黄芪单独给药表现出轻度升高血糖的效应。表明黄芪联合山楂具有抗2型糖尿病的效应。
综上所述,黄芪多糖联合山楂黄酮用药可用于控制高脂食物所引起的血糖紊乱,可预防饮食所诱发的糖耐量异常及糖尿病的发生。
实施例6、高浓度山楂黄酮联合黄芪多糖给药后对C57BL/6J小鼠糖尿病模型糖代谢的影响
由于上述提取物中山楂黄酮和黄芪多糖含量较低,分别为30%和50%左右。为了证明上述两种成分为起效的主要有效组分,我们从商业途径购买了纯度较高的山楂黄酮和黄芪多糖进行实验,其含量分别达到90%和95%,均购自南京泽朗生物科技有限公司。
一、NIH小鼠糖尿病模型的制作
同实施例2。
二、NIH小鼠糖尿病模型的给药
糖尿病模型筛选成功后,进行分组(n=10),按下列药物组分进行灌胃给药,连续四周。
高含量的黄芪多糖(95%)和山楂黄酮(90%)混合治疗组(H-HS):在NIH小鼠糖尿病模型,黄芪多糖与山楂黄酮按净含量1∶1的比例进行混合,此处均按净含量200mg/kg/天进行灌胃给药。
低含量的黄芪多糖(50%)和山楂黄酮(30%)混合治疗组(L-HS):在NIH小鼠糖尿病模型,黄芪多糖与山楂黄酮按净含量1∶1的比例进行混合,此处均按净含量200mg/kg/天进行灌胃给药。
另取正常小鼠作为糖尿病模型的对照。糖尿病模型对照及正常对照均给予等体积混淆药物的蒸馏水。
实验结果表明,糖尿病模型在四周内均出现显著的增加的血糖,然而给予高含量的黄芪多糖和山楂黄酮后,在给药后第三周和第四周显示出较强的降低血糖效应(图11),表明黄芪多糖和山楂黄酮为抗糖尿病的有效成分。然而与上述纯度较高的黄芪多糖和山楂黄酮联合用药比较,纯度较低的组合物用药后在抗糖尿病效应方面没有明显的差别,但低纯度的组合物具有工艺简单,成本低廉,适合产业放大的特点。
综上所述,原料中的杂质对药效没有影响,其疗效与其在提取物中纯度无明显关联,主要与其净含量有关,黄芪多糖和山楂黄酮为抗糖尿病的主要有效和质控组分。