CN103275974A

CN103275974A - 龙眼的检测试剂盒和检测方法

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Publication number: CN103275974A
Application number: CN2013101848121A
Authority: CN
Inventors: 傅俊江; 杨璐全
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-05-17
Also published as: CN103275974B

Abstract

本发明公开了龙眼四种新的核苷酸序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备龙眼检测试剂中的用途，以及龙眼的检测试剂盒和检测方法。本发明检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测龙眼，特异性强，耗时短，应用前景良好。

Description

龙眼的检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及龙眼的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

龙眼(Dimocarpus longan Lour)，俗称“桂圆”，属于无患子科龙眼属,是传统的药食兼用植物，主要分布在热带、南亚热带地区。中国作为龙眼的发源地，已经有近千年的栽培历史，历史上南“桂圆”北“人参”之称。中国是世界上龙眼基因资源最丰富、栽培品种最多的国家。

疯人果又叫龙荔，有毒，其形态特征与龙眼极为近似，容易混淆，导致消费者中毒，存在极大的安全隐患，急需提供一种方法来解决该问题。

发明内容

为了解决龙眼与龙荔易混淆的问题，本发明提供了4种龙眼特异的核苷酸序列及其用途，还提供龙眼的检测试剂盒和检测方法。

本发明4种核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

本发明检测SEQ ID NO.1～4任意一项所示核苷酸序列的试剂在制备龙眼检测试剂中的用途。

所述检测SEQ ID NO.1～4任意一项所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQID NO.1～4任意一项所示核苷酸序列的试剂。

所述扩增SEQ ID NO.1～4任意一项所述核苷酸序列的试剂包括SEQ IDNO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ IDNO.15～16、SEQ ID NO.17～18或SEQ ID NO.19～20所示的核苷酸序列。

本发明检测龙眼的试剂盒，包括任选的用于检测SEQ ID NO.1～4任意一项所述核苷酸序列的试剂。

所述试剂包括扩增SEQ ID NO.1～4任意一项所示核苷酸序列的试剂。

所述扩增试剂包括SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18或SEQ ID NO.19～20所示的核苷酸序列。

本发明龙眼的检测方法，包括如下步骤：

a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；

b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。

本发明SEQ ID NO.1～4所示核苷酸序列为龙眼特异性序列，通过检测这些序列可以有效鉴定待检样本是否为龙眼，准确区别龙眼和龙荔，保证食品安全，操作简便，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1用改良的RAPD技术扩增桂圆的DNA。I4、Q12和Q19分别为不同的RAPD引物，M:为DL2000的DNA分子大小标记，大小为bp，下同；

图2RAPD产物切胶回收纯化后电泳检测，2号：从GY的I4的第4条带来的；4号：从GY的Q19第2、3、4条带来的；5号：从GY的Q12的倒数第2条带；

图3PCR扩增鉴定克隆2-1阳性。设计合成位于载体上序列的T7/SP6引物直接扩增蓝白筛选的白色细菌菌落。克隆2-1,2-2,2-3,2-4,2-6分别是PCR阳性；其中克隆2-1（红色）为强阳性，提取克隆2-1质粒DNA，进行DNA序列分析，获得新的DNA序列（SCAR)；

图4PCR扩增鉴定4-7/4-8阳性克隆。设计合成位于载体上序列的T7/SP6引物直接扩增蓝白筛选的白色细菌菌落。克隆4-1,4-2,4-3,4-7,4-8分别是PCR阳性；其中4-7,4-8（红色），提取质粒DNA，进行DNA序列分析，各获得新的DNA序列（SCAR)；

图5用EcoRI酶切鉴定5号RAPD产物的阳性克隆。克隆5-2和5-2均为阳性克隆，含有一个约500bp的插入片段。取克隆5-2（红色），提取质粒DNA，进行DNA序列分析，获得新的DNA序列（SCAR)；

图6引物对LY2-1在不同桂圆样本中的特异性扩增与检测。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp；

图7引物对LY4-7在不同桂圆样本中的特异性PCR扩增与检测。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp；

图8引物对LY4-8在不同桂圆样本中的特异性PCR扩增与检测。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp。箭头所指位置为特异性DNA条带；

图9引物对LY5-2在不同桂圆样本中的特异性PCR扩增与检测。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp。箭头所指位置为特异性DNA条带；

图10引物对LY2-1-full在不同桂圆样本中的特异性PCR全长扩增。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp；

图11引物对LY4-7-full在不同桂圆样本中的特异性PCR全长扩增。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp；

图12引物对LY4-8-full在不同桂圆样本中的特异性PCR全长扩增。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，其中GD GX HN均获得强的特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL600的DNA分子大小标记，大小为bp。箭头所指位置为特异性DNA条带；

图13引物对LY5-2-full在不同桂圆样本中的特异性PCR全长扩增。样本1、2、3、4、5、6、8、9和14为采自位于长江上游四川合江的不同的青果；样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，均获得特异性DNA扩增片段；DD为紫花地丁；JGT为沟景天；GHC为采自四川古蔺的赶黄草；JYH为金银花；TM为采自四川凉山的天麻。M:为天根公司的DL2000的DNA分子大小标记，大小为bp。箭头所指位置为特异性DNA条带；

图144个引物对LY2-1，LY4-7，LY4-8，LY5-2在桂圆和龙荔样本中的扩增与检测。样本LZ、GD、GX、HN、FJ分别为采自四川泸州、广东、广西、海南和福建来源的桂圆品种，样本LL采自广西来源的龙荔野生种。

具体实施方式

实施例1RAPD法特异扩增得到龙眼特异SCAR标记

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）-即随机扩增多态性DNA，主要用于动植物基因组信息未知的情况下的检测。RAPD技术依赖于PCR，选用10个碱基的单链随机引物，对生物个体、居群或物种基因组的DNA进行PCR扩增，检测其遗传位点的差异。序列特异性扩增区

（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）标记（SCAR标记）是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。作为作物农艺性状的SCAR标记，在分子标记辅助育种、品种鉴定方面将发挥巨大作用。

一、实验方法

（一）桂圆DNA的提取

1、收集四川泸州、广东、广西、海南、福建各地盛产桂圆的叶子，置于4℃冰箱备用；

2、取各区域桂圆叶子3-4片(约2g)，加入液氮或者硅石（silica，SiO2)研磨成粉末状，将粉末立即装入预冷的5ml离心管中，装入的量约占离心管的1/3。

3、加入2ml65℃预热的CTAB提取缓冲液和4μlβ-巯基乙醇，充分混匀，于65℃水浴保温30m in，不时振荡以免成团。

4、每管加入一倍体积的氯仿：异戊醇（24:1），充分振荡使其成乳白色，室温下4000rpm离心10min，取上清于一新的5ml离心管中。

5、重复步骤（3），使提取的基因组DNA更加纯净。

6、把最后抽提获得的上清转移至新的5ml离心管中，缓慢加入一倍体积的预冷的异丙醇于离心管中，缓慢转到离心管混匀，使DNA成团，放-20℃冰箱预冷30min，离心机4000rpm离心6min，弃上清。

7、沉淀用70%的乙醇洗几次，去掉色素，再用无水乙醇洗一次后室温下干燥。溶于ddH2O后放于4℃可短期存放，放于-20℃长期保存。

（二）PCR扩增—改良RAPD

1、各取广西桂圆DNA10μl，用无菌ddH2O稀释至10ng/μl，用标记笔标示清楚桂圆产地、浓度以及稀释时间，置于4℃冰箱中备用，余保存于-20℃；

2、引物的设计合成

primer	Sequence5’-3’	primer	Sequence5’-3’
				SBS-I4	CCGCCTAGTC	SBS-Q19	CCCCCTATCA
SBS-Q12	AGTAGGGCAC

3、PCR体系的配置：

（1）选用广西桂圆，用三个不同的引物分别作PCR，每种引物做4管，每管15μl体系，EP管中加入：

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

用移液枪充分混匀后，12000rpm离心40s；

（2）将EP管放入Mastercycler5331PCR仪器（德国Eppendorf）中，选择如下程序扩增；

注：ramp升温参数为0.3°C/秒

4、改良RAPD技术参数设定

（1）PCR仪器：GenAmp9600（美国PE）、Mastercycler5331（德国Eppendorf）

（2）PCR反应过程：预变性、变性、退火、延伸三循环、后延伸、保温。

（3）PCR反应程序：95°C预变性1分钟30秒后，94°C变性40秒，36°C退火1分30秒，72°C延伸1分30秒，共完成40个循环，72°C后延伸5分钟，最后置4°C保温。PCR反应过程所需时间在不同的研究中稍有差异。

（4）ramp参数：即升降温速率。不同PCR仪器的ramp参数不同，同一PCR仪器的最大和最小升降温速率相差10倍。如GenAmp9600为1°C/秒—0.1°C/秒，我们选定ramp参数为0.2°C/秒；Mastercycler5331为3°C/秒—0.3°C/秒，我们选定ramp参数为0.3°C/秒。PCR反应过程的ramp参数默认为最大升降温速率，如GenAmp9600为1°C/秒、Mastercycler5331为3°C/秒。

（三）琼脂糖凝胶电泳分析：详见《精编医学分子生物学实验指导》（中国医药科技出版社，主编：傅俊江）

1、脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入1×TAE40ml，放入微波炉中充分溶解（中火至沸腾，中低火至沸腾2次），置于实验桌上，加入EB2μl，混匀，待冷却至50℃备用；

2、用0.75mm8孔宽齿梳，将2、3孔梳子用胶带连通，选用相匹配的制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为6mm（如有气泡要把气泡赶出），待其在室温下充分凝固后备用；

3、点样：将两管PCR产物合为一管

顺序：M 广西桂圆PCR产物1 广西桂圆PCR产物2

注：Marker采用天根公司出产的DL2000

4、100V电泳45min；

5、在凝胶成像仪下照相。

实验结果如图1所示，用I4、Q19和Q12为引物，分别扩增得出了不同的条带。

(四)胶回收：

1、割取琼脂糖凝胶上较亮的条带，如图2所示：

2号：GY I4的第4条带

4号：GY Q19第2、3、4条带

5号：GY Q12的倒数第2条带

2、天根琼脂糖胶回收试剂盒回收片段（详见天根琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书），并用20μl无菌ddH20洗脱出DNA；

注：琼脂糖凝胶回收试剂盒：公司：天根产品型号：DP209

(五)质粒重组、转化、筛选与鉴定。详见《精编医学分子生物学实验指导》（中国医药科技出版社，主编：傅俊江）

1、质粒重组

（1）EP管中加入：

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ空白对照

用移液枪充分混匀后，12000rpm离心40s；

（2）16℃恒温水浴过夜（不超过24h）。

注：pGM-T 公司：天根型号：L1010

T4DNA ligase 公司：TaKaRa 型号：D2011A

2、转化

（1）DH5α感受态的制备：详见《精编医学分子生物学实验指导》（中国医药科技出版社，主编：傅俊江）

①取2个无菌EP管，加入500μl LB无Amp的培养基，挑取一DH5α单菌落于一管中标记为DH5α，另一管为空白对照；

②37℃200rpm震荡培养15h后，全部接种到20ml新的LB无Amp的培养基中继续培养2.5h；

③取10ml菌液冰浴15min；

④3500rpm离心5min，弃上清；

⑤加入1ml4℃的0.1M的CaCl2，用腕力轻轻混匀，再加入9ml的0.1M的CaCl2，冰浴30min；

⑥3500rpm离心5min，弃上清；

⑦加入2ml4℃的0.1M的CaCl2轻轻混匀后，置于4℃冰箱备用。

（2）蓝白斑筛选LB Amp阳性培养板配制方法：称取LB肉体粉末5g、3.75g琼脂粉（1.5%）于一干净锥形瓶中，加入250ml ddH2O充分混匀后，于121kpa高压灭菌30min，放入水浴锅中降到60℃，加入250ul氨苄青霉素（100mg/ul），于超净工作台中倒制固体培养板（20ml/板），待其冷却后置于4℃保存。使用前30min，20ml平板上将16μl IPTG(50mg/ul)、40μl X-gal（20mg/ul）充分混匀后铺皿，放入CO2孵箱中烤干备用。

（3）4管置于冰上预冷3min后，分别加入50ul DH5α感受态细胞，手指轻弹管底3次混匀。另取一空白EP管加入50μl DH5α感受态细胞作为空白对照，冰浴30min。

（4）42℃热激45s（一般不超过90s），冰浴2-3min，不要摇动离心管。

（5）加入300μl LB液体培养基（Amp-），于37℃振荡培养45min，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

（6）将离心管中的菌液混匀，全部铺皿（涂布用量可根据具体实验作相应的调整），待平板表面干燥后，倒置平板，37℃CO2孵箱中孵育12-16h。

3、蓝白筛选鉴定

蓝白斑筛选：2、4、5转化平板上蓝白细菌相间，空白质粒板上无菌落生长，感受态空白对照板上也无任何菌落生长。

挑选2、4、5板上白色菌落个10个，加入500μl有Amp的LB培养基，标记清楚[（2-1...2-10）、（4-1...4-10）、（5-1...5-10）]，于37℃200rpm震荡培养5h（菌液浑浊即可）。

4、PCR鉴定

（1）引物的合成：

SP6：ATT TAG GTG ACA CTA TAGAA

T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG

（2）EP管中加入：

Ⅰ

Ⅱ

充分混匀后，12000rpm离心40s，放入PCR仪上，采用如下程序。

（3）2%琼脂糖凝胶电泳，100V20min电泳结束后，置于凝胶成像仪成像。

检测结果如图3～4所示，说明2-1、4-7、4-8为转化成功菌液。

酶切鉴定：

（1）将5号菌液继续接种到20ml新的LB含Amp的培养基中继续培养过夜（12-16h）；

（2）用天根公司质粒小提试剂盒提取5号菌液质粒，并做好标记，用分光光度计测OD值；

注：质粒小提试剂盒公司：天根型号：DP103

（3）EcoR1酶切

①EP管中加入：

用移液枪充分混匀后，12000rpm离心40s；

②37℃恒温水浴5h；

③2%琼脂糖凝胶电泳，100V20min后，在凝胶成像仪下照相。

实验结果如图5所示，说明5-2为克隆成功菌液。

注：EcoR1购自TaKaRa公司货号:D1040A

(六)阳性克隆的序列分析

1、将阳性克隆菌液继续接种到10-20ml新的LB含Amp的培养基中继续培养过夜（12-16h）；

2、用天根公司质粒小提试剂盒提取菌液质粒DNA，并做好标记，用分光光度计测OD值；

3、用载体特异性引物T7和SP6引物,在DNA自动测序仪完成测序分析。

测序结果如下：

龙眼2-1克隆:（如SEQ ID No.1所示）

CGCCTAGTCACGACAAATACTCTGGCCTGGGTATGTGGTCTCCCTAGCGGCCTTCTGGATGGGGTGCCTCTACCTGCTCCTCTACCAGGCTAACTGGAAGTCCCTGGTCCTCTCATTTGGGGACTTCTCCTGTTTGAGGGCTGCTCTCTACTAGTTTGCCCCTGAGTACTAACTCTGGACTTCCCATTGTTTTCGATCGCTTTCTGCGGACAGTCTCTCGTAAAATGTCCCTTCTGACCATAATGATAACAACCTGTGATACCCAAATGACACTCTCCCTAATGAAATTTGCCTTGATTTGCTTTAGGTACAACCTCGGTCTTAGGACTCTGACGGTGGTCGAACGGAACCCTGACACATTGCGGCTTTGCAACTCCGCTGTTTACTACCAGGCCACCTAGACTTGTCTCTAATCCTAGGAACCTTACTGGGGCCTCTTGTATGCCATCCTAAACTATGCCCGTGCTGTTGTTTCTGACTAGGCGG

龙眼4-7克隆：(如SEQ ID No.2所示)

GATTAGTAGGGCACGCACCGCTGCTGACCAAACCAAAGGAGGGGGAGATATTGACTGTCTATCTGGGCGTATCCCAACACGCCCTGAGTGCAGCATTGATAAGGCAAGAGGGAAACAGAGCTCAGGCGCCGGTATACTTTGTAAGTAAGAAGCTGGTCGAAGCAGAAACCAGGTACACCCCAATGGAGCAGCTCGCCTACTGTCTGGTGATGGCATCCAGAAAGCTGCGTCCATACTTCCAAGCGCATAAGATCGAAGTCCTATCCAGGTATCCTTTGAAGCAAATCCTCCAGAAGCCAGATACCTCCGGTCGACTCATCAAGTGGGCCATTGAGCTCGCCCAATATGACATCGAGTTCAGACCAAGGCCGGCAATCAAGGGCCAAGCTTTGGTAGACTTCATCGCTGAGTTTACAGCACCGGCAGACGATCAAGTTGAGACTTCTCAAGGGCCATACTGGGAGCTTTTTGTGGACGGATCCTCTTACGAGAGAAGTGCCGGAGCTGGAATCCTGCTGATTAATCCTTACGGTGGTAAGTTTCTTTGTGCCCTACT

龙眼4-8克隆：(如SEQ ID No.3所示)

TAGTAGGGCACCCCTGAAATGCTGATGGCTTGCAGTTCATTTTTTGAAACTACATTCACCTTCTTTCCCTTAGCTCCTATATTCATTGCATCCTTATATTAATGACAAGCTAGTTGTTGCTTGCCTCGCATATATCCTATCCCATTAGGGGTTGGAAATTTCACTATGAGAGTTCTGGTTGAGGTGACGATATCCAGGTCGTTCATCGCAGGCTTTTTAGCACCATATTGTAAGCAGAAGGGAAGTCTATGATTAGAAAGTCTGCTAATACAATCGACTGTCGACCTGCATCTCCGAGAATCAAGGGTAATCTAATTTGCCCAATAAGAGTGACCGAATCTCCAGTGAAACCATACAAAGGTTCAGGGTAAGGCTTCAGCTGTTTATCTCCAATCCCCATCTGGTTGTAGCACTCTTTATACATTATGTTTACCAAGCTACCTATATCAATCATTATTCTTCTAACCTCTGCATTCCCAATACCAGCTTAGATAACCAAGACATCATTATGGGGCCAATGAAAACCCCTGACATCTTCTTCTATAAAAATTATCTCTTCAGATGCCATCTTTACTCTTTTAGCAGACCCTTCTGACTCTCTTCAACCGATGAGTTGAATATGGTTAGTCTCGCGCACGTAGCGCTCTTACGACCTGTTTGAGGTACTTGCTATATGAGGTCTCCCATAGAAAGTAAAAATGGTCCTTATTGTAAGCGTTGGTTCTTAATCATGAGTTGGTTGAGCTGGCTGCTACTGTTGTCGCTGTTGTGGTTGAGGTTGAGGATGATGTTGTTAGGATGGTCGAACCGTAGTCATACTATATAATCCCTCAGATGACCATTTCTAATCATCTTTTTAATGGCGTCTTTCAATGCCCAACATTCTGAGGTGTTGTGCCCTAC

龙眼5-2克隆:（如SEQ ID No.4所示）

CTAACCGAAAAAACATATACTAATCCTTTGACAAAAAAATGCTTCAAAAATCTTGTAATCCTTCAATTGATGAAACTTGAATGTTCAAAAACCTTCAATGGTTATTATGAGGAATAAGAAGAAAAGGAAATATGGACAATCAATGGTGAATCAAATCTCAGAAACCATAAATGGAGAAGAATGGAGAAGAGAAAATATGGAGGATATTGTGAGGAAGAAGAAGGTTAGTTTCGTAATTTTAATGTTGGGCATTTGGGTAATAGAAACTTAAGGGTATTTTCGTAATCTTGGGTATATAATGAAAATAATTTGTTTAAGAGGTCAAAAAACAAAAATTTTCTTTTTATTTGGGTAAAATCTATAAATTTCCCTTTTTTTTAAGCAAATTACAATTCAGTTATCCGATTGAAATGTATTTACAAGTGGAGTAACTGTTTCGCTTTTATTACAATTGACCCCCCCTACCGTTAGTGGATCTCGGTTAGC

将如SEQ ID No.1，2，3和4所示序列，在NCBI上进行blast分析，未见重复序列，说明如SEQ ID No.1，2，3和4所示序列为新的、龙眼特有的核苷酸序列，是龙眼特异的SCAR标记。

实施例2用本发明方法特异扩增龙眼基因

1、实验方法

（一）根据实施例1得到的SEQ ID NO.1～4所示的序列，用PRIMER3软件设计引物分析，设计8对引物，合成。

具体引物序列如下：

2-1引物对（SEQ ID NO.5～6）：

LY2-1L：5’-AACTGGAAGTCCCTGGTCCT-3’

LY2-1R:5’-ACAAGAGGCCCCAGTAAGGT-3’

4-7引物对（SEQ ID NO.7～8）：

LY4-7L:5’-GGCGCCGGTATACTTTGTAA-3’

LY4-7R:5’-CTCGTAAGAGGATCCGTCCA-3’

4-8引物对（SEQ ID NO.9～10）：

LY4-8L:5’-CCCCATCTGGTTGTAGCACT-3’

LY4-8R:5’-AGCCAGCTCAACCAACTCAT-3’

5-2引物对（SEQ ID NO.11～12）：

LY5-2L:5’-TTTTAATGTTGGGCATTTGG-3’

LY5-2R:5’-GCTAACCGAGATCCACTAACG-3’

LY2-1-full引物对（SEQ ID NO.13～14）

LY2-1L-full TACTCTGGCCTGGGTATGTG

LY2-1R-full AGCACGGGCATAGTTTAGGA

LY5-2-full引物对（SEQ ID NO.15～16）

LY5-2L-full AAATGCTTCAAAAATCTTGTAATCC

LY5-2R-full GCTAACCGAGATCCACTAACG

LY4-7-full引物对（SEQ ID NO.17～18）

LY4-7L-full CACCGCTGCTGACCAAAC

LY4-7R-full GTAGGGCACAAAGAAACTTACCA

LY4-8-full引物对（SEQ ID NO.19～20）

LY4-8L-full AGTAGGGCACCCCTGAAATG

LY4-8R-full AGGGCACAACACCTCAGAAT

（二）PCR扩增

1、从根、茎、叶及其它部位如树皮等，抽提5个桂圆品种(泸州桂圆、广东桂圆、广西桂圆、海南桂圆、福建桂圆)DNA、龙荔DNA以及6个其他物种（泸州金银花、地丁、沟景天、赶黄草、天麻、青果）DNA，提取缓冲液为CTAB提取缓冲液。

2、进行PCR扩增：

PCR体系配置。具体如下：

充分混匀后，12000rpm离心40s；

3、放入PCR仪上（Mastercycler5331PCR仪器，德国Eppendorf），采用如下程序。

（三）琼脂糖凝胶电泳：

详见《精编医学分子生物学实验指导》（中国医药科技出版社，主编：傅俊江）

2、用0.75mm16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为6mm（如有气泡要把气泡赶出），待其在室温下充分凝固后备用；

3、点样：

加样顺序：M QG1QG2QG3QG4QG5QG6QG8QG9QG14LZGYGDGY GXGY HNGY FJGY DD JGT GHC JYH TM

注：M是Marker，为天根的DL2000或者DL600

4、100V电泳45min；

（四）结果检测

在凝胶成像仪下观察结果，照相保存。

二、实验结果

如图6～9以及图14所示，用SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ IDNO.11～12作为引物扩增，龙荔、泸州金银花、地丁、沟景天（Penthorumsedoides）、赶黄草、天麻、青果等常见的易与龙眼混淆的物种均无扩增条带，结果呈阴性，不同品种的龙眼均有扩增条带，结果呈阳性；SEQ ID NO.9～10检测泸州金银花、地丁、沟量天、赶黄草、天麻、青果的结果呈阴性，但是检测龙荔和龙眼的结果均呈阳性。

如图10～13所示，用SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ IDNO.17～18或SEQ ID NO.19～20作为引物扩增，泸州金银花、地丁、沟景天、赶黄草、天麻、青果等常见的易与龙眼混淆的物种均无扩增条带，结果呈阴性，不同品种的龙眼均有扩增条带，结果呈阳性。

实验结果说明，本发明设计的SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ IDNO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18或SEQID NO.19～20所示引物的特异性良好，可用于龙眼的检测。

实施例3本发明龙眼检测试剂盒

一、试剂盒组成

本试剂盒含有：

CTAB提取缓冲液（200ml）；

2×Taq Master Mix，其中，引物可以选用SEQ ID NO.5～6、SEQ IDNO.7～8、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ IDNO.17～18以及SEQ ID NO.19～20所示引物中的一对引物或者多对引物（500μl）；

阴性对照模板DNA（龙荔DNA）一管（50μl）；

阳性对照模板DNA（龙眼DNA）一管（50μl）；

灭菌ddH2O（1500μl）。

（一）CTAB提取缓冲液

CTAB提取缓冲液（100ml）

2.0g CTAB(Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)

10.0ml 1M Tris(pH8.0)

4.0ml 0.5M EDTA(pH8.0)

28.0ml 5M NaCl

40.0ml H₂O

1g PVP40(polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯基吡咯烷酮，Mw40,000)

用HCL调至pH5.0，加H₂O至100ml.

（二）PCR体系2×Taq Master Mix的配方

二、检测方法

（一）PCR扩增

1、CTAB提取缓冲液提取待检样本DNA。

2、进行PCR扩增：

具体如下：

不同品种DNA 1μl（50ng/μl）

2×Taq Master Mix 5μl

ddH2O 4μl

充分混匀后，12000rpm离心30s；

注：2×Taq Master Mix，同时取不同DNA模板设定阳性和阴性对照

（二）琼脂糖凝胶电泳：

1、脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入0.5×TAE40ml，放入微波炉中充分溶解（中火至沸腾，中低火至沸腾2次），置于实验桌上，加入EB2ul，混匀，待冷却至50℃备用；

3、点样：注意加样顺序，并加上DNA的分子Marker

4、100V电泳45min；

（三）结果检测与分析

在凝胶成像仪下观察结果，结果照相保存，并分析结果。

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以特异扩增龙眼基因，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的临床应用前景。