CN103275911B - 一种含有pET-28a(+)-protein400重组质粒的大肠杆菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所述pET-28a(+)-protein400质粒由条件复制质粒pET-28a(+)连入protein400基因后得到，本发明所述protein400基因由创伤弧菌溶细胞素313-445基因突变313位亮氨酸为缬氨酸得到。本发明所述大肠杆菌重组菌株名称为E.coli？WZMC-8326，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，普通微生物中心，编号NO.6925。本发明所述大肠杆菌重组菌株表达产物，即纯化后的融合蛋白(SEQ？NO：2)以二聚体形式发挥凋亡作用，且其具有较简短的氨基酸序列与分子质量，相对而言更加容易进入细胞发挥作用。可用于新型抗子宫颈肿瘤药物的开发。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用基因克隆技术得到含创伤弧菌溶细胞素313-445基因突变313位亮氨酸为缬氨酸基因序列细菌菌株，具体涉及一种含有pET-28a(+)-protein400重组质粒的大肠埃希氏菌，序列的表达、纯化、复性的方法及其宫颈癌细胞毒性方面的应用。
背景技术
子宫颈癌在世界各地都有发生，是人体最常见的癌瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且是女性各种恶性肿瘤中最多见的癌瘤，但其发病率有明显的地区差异。我国宫颈癌的发生，在地理分布上的特点是高发区常连接成片，各省宫颈癌相对高发区的市、县也常有互相连接现象。总的趋势是农村高于城市，山区高于平原。根据29个省、市，自治区回顾调查我国宫颈癌死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌的第二位。因此，开发出具有较简短的氨基酸序列与分子质量，更加容易进入宫颈癌细胞发挥作用，致其凋亡的肽尤为重要。
发明内容
本发明的目的之一：提供含有pET-28a(+)-protein400质粒的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326，于2012年12月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏编号为CGMCCNo.6925。
本发明的目的之二：提供一种重组蛋白protein400，其碱基序列如序列表SEQIDNO：1所述，氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所述。
本发明的目的之三：提供一种重组蛋白protein400的制备方法，包括如下步骤：
本发明提供所述重组蛋白protein400的制备方法，包含以下步骤：
(1)重组载体pET-28a(+)-protein400的构建；
以创伤弧菌标准菌株GTC333全基因组为模板，PCR扩增，利用基因克隆技术定点突变313位亮氨酸为缬氨酸，获得重组蛋白protein400基因。上游引物序列为：5′-CATGCCATGGTGTTTGAAGCGG-3′，下游引物序列为：5′-CCGCTCGAGTGTGGGTTTCCAA-3；并引入NcoI和XhoI酶切点和6×His标签，扩增产物胶回收纯化后与pET-28a(+)载体连接，获得重组克隆载体。protein400基因碱基序列如SEQIDNO：1所示。
(2)重组工程菌的制备
重组载体pET-28a(+)-protein400转化入大肠埃希氏菌E.coliBL21(DE3)基因组中，得到含protein400基因的重组工程菌。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326，于2012年12月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏编号为CGMCCNo.6925。
(3)重组蛋白protein400的表达
将重组工程菌接种于LB琼脂平板(含30μg/ml卡那霉素)，于37℃过夜培养；挑取白色单个菌落，接种于LB(含30μg/ml卡那霉素)液体培养基中，37℃、160rpm过夜振荡扩大培养。诱导表达重组蛋白protein400，离心收集菌体破菌，再离心，然后通过Ni2+-NTA层析纯化法、稀释透析复性法得到重组蛋白protein400，其氨基酸序列SEQIDNO：2。
本发明的目的之四：提供一种重组蛋白protein400应用，其具有宫颈癌细胞的毒性作用。
利用纯化复性的重组蛋白protein400作用于Hela细胞，经流式细胞仪、激光共聚焦等方法检测其细胞毒性作用，具体实验结果见实施例3-4，抗癌效果明显。
本发明的有益效果：
1.pET-28a(+)-protein400重组基因仅为创伤弧菌的一小段序列且其313位氨基酸由原来的亮氨酸突变为缬氨酸，具有较简短的氨基酸序列与分子质量，相对而言更加容易进入细胞发挥作用。
2.成功表达复性的重组蛋白protein400，其氨基酸序列SEQIDNO：2，可与细胞膜结合后发挥细胞毒性作用，活性形式为二聚体，且并不具有温度依赖性，相比创伤弧菌溶细胞素形成四聚体后打孔进入细胞并受温度影响而言具有优越性。
附图说明
图1pET-28a(+)质粒示意图
图2protein400基因的获得与克隆电泳图(注：1、2、3：PCR产物；M：DL2000Marker)；
图3重组表达载体pET-28a(+)-protein400双酶切鉴定结果电泳图(注：M：DL15000DNAMarker；1、2：重组表达载体酶切产物)
图4重组菌株在30℃条件下经0.4-0.5μg/mlIPTG诱导表达后电泳图(注：1：蛋白分子量标记；2：未诱导全菌；3：IPTG诱导后全菌；4-5：超声破菌的上清液和沉淀；6：洗涤后protein400包涵体；7：穿透液；8-14：经0、20、40、60、80、100、200mmol/L咪唑洗脱液)
图5复性后protein400蛋白纯度电泳鉴定图(注：1：蛋白分子量标记；2：复性后protein400蛋白)
图6westernblotting分析复性后protein400蛋白图(注：1：纯化后protein4002：洗涤后沉淀3：蛋白分子量标记)
图7AnnexinV-FITC/PI荧光双染宫颈癌细胞凋亡形态学观察图(注：a：正常细胞的细胞面；b：凋亡细胞的细胞面；c：激光下双染后的凋亡细胞)
图8FITC标记的蛋白作用宫颈癌细胞4h后图(注：a：激光下的细胞；b：微分干涉面的细胞)
图9不同浓度protein400作用于宫颈癌细胞后流式细胞仪结果图(注：A-C空白对照组；35μg蛋白实验组；70μg蛋白实验组)
图10复性后protein400蛋白Native-PAGE电泳结果图
具体实施方式
本发明所述含有protein400重组质粒的大肠埃希氏菌的构建，序列表达，纯化，复性及细胞毒性检测具体方法如下：
实施例1含有protein400重组质粒的大肠埃希氏菌的构建
1.引物信息及合成：
根据含pET-28a(+)-protein400中的protein400基因为模板，设计protein400基因N末端和C末端基因引物。具体信息见表-1，引物由大连宝生物公司合成。用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为10μmol/1。
表1引物信息及合成
2.protein400基因的获得
PCR反应体系：
94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，10min，4℃保存。取5μlPCR产物，与1μl6×Buffer混匀后，用1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。(如图3)
3.利用基因克隆技术突变protein133基因序列313位点。
4.pET-28a(+)-protein400重组表达载体的构建
4.1碱裂解法小量质粒DNA的制备(按MiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0，宝生物公司说明书要求操作)。
(1)pET-28a(+)-DH5α菌株的活化：将保存于-80℃的pET-28a(+)-DH5α菌株室温融化后，吸取少量菌液加入到已高压灭菌过的4ml含有Kana+的LB液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养过夜；
(2)取1～4ml的过夜培养菌液，12,000rpm离心2分钟，弃上清；
(3)用250μl的SolutionI(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀；
(4)加入250μl的SolutionII轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；
(5)加入400μl的4℃预冷的SolutionIII，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟；
(6)室温12,000rpm离心10分钟，取上清；
(7)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上；
(8)将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液；
(9)将500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；
(10)将700μl的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；
(11)重复操作步骤(10)；
(12)将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心1分钟；
(13)将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl已预热到65℃的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟；
(14)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
4.2取5μl提取的质粒产物，与1μl6×Buffer混匀后，用1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。
4.3目的片段与pET-28a(+)质粒的双酶切及胶回收
双酶切反应体系：
37℃酶切3h，加入10×Buffer终止反应，将反应产物全部进行1.0％的Agarose凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的DNA片段和pET-28a(+)质粒片段，用TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收，一切操作按其说明书要求进行。
4.4目的片段与pET-28a(+)载体连接
连接体系：
16℃连接反应过夜。
5.连接产物的转化
(一)大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞的制备(冷CaCl2法)
(1)将-70℃冻存的E.coliBL21(DE3)接种于LB固体培养基上，37℃CO2培养箱中培养过夜。
(2)从37℃培养16h～18h的平板中挑取单个菌落(直径2～3mm)，转到一个含有100mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，37℃，250rpm振摇培养2.0-2.5h。
(3)在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。
(4)将培养物在4℃、4000rpm离心10min，以回收细胞。
(5)倒出培养液，将试管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
(6)将回收的细胞用30ml预冷的0.1MCaCl2～MgCl2(20mMCaCl2、80mMMgCl2)重悬细胞沉淀。
(7)4℃、4000rpm离心10min，回收细胞。
(8)倒出液体，将试管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。
(9)将回收的细胞用2ml含15％甘油的冰冷的0.1MCaCl2，重悬细胞沉淀。
(10)将重悬过的细胞分装EP管，每管200μl，放置冰上30min后，置-70℃保存。
(二)重组工程菌的制备
(1)取100μl感受态细菌于一个无菌的Ep管中，再加入5μl连接产物，轻轻摇匀，冰浴30min。
(2)42℃热休克90s，冰浴5min。
(3)加500μlLB液体培养基于上述Ep管中，轻轻摇匀，37℃，100rpm振荡培养1h。
(4)吸取(3)中培养后的菌液全部涂布到含有30μg/mlKana+的LB琼脂平板上。
(5)待菌液完全吸收后，倒置培养皿，37℃培养16h，即得到含protein400基因的重组工程菌，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326，于2012年12月03日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏编号为CGMCCNo.6925。
实施例2protein400基因的原核表达、纯化、复性
(一)protein400基因的原核表达
(1)将含重组表达质粒pET28a(+)-protein400的E.coliBL21(DE3)接种于LB琼脂平板(含30μg/ml卡那霉素)，于37℃过夜培养。
(2)从平板上挑取白色菌落，接种于6mlLB(含30μg/ml卡那霉素)液体培养基中，37℃、160rpm过夜振荡培养；
(3)取5ml过夜培养的菌液加入500mlLB-卡那霉素液体培养基，37℃，220rpm振荡培养4-6h。
(4)取1ml菌液作为诱导前对照。剩余菌液加IPTG至终浓度为0.4-0.5mmol/l诱导表达，30℃，210rpm振荡培养4-5h。
(5)11000rpm离心10min收集菌体，-20℃保存。
(6)收集的菌体用PBS洗涤3次，再用超声裂解液重悬，进行超声破菌(每次超声时间5s、间隔时间10s、功率600W，约150次，视菌体浓度而定)，至菌体清亮为止。
(7)11000rpm、4℃离心10min收集上清与沉淀。
(二)表达产物的SDS-PAGE分析
重组蛋白分子量约20kD，有较简短的氨基酸序列与分子质量，相对而言更加容易进入细胞发挥作用。
创伤弧菌溶细胞素蛋白分子量约50,851Da，经胆固醇介导与细胞膜结合并形成四聚体(赵旭鸿等。创伤弧菌溶细胞素细胞毒性机制的研究进展，微生物与感染，2006，1(1)：49～52)，从而在细胞膜上形成孔道，进而发挥毒性作用。
(三)重组蛋白包涵体的纯化
1、蛋白质包涵体的提取
1.1诱导500ml菌液，11000rpm、集菌10min，并称量菌体沉淀的质量。
1.2PBS洗涤菌体三次，按菌体量加入10倍体积超声裂解液重悬菌体沉淀，4℃放置1h后，进行超声破碎(超声时间5s间隔时间15s、功率600W、约150次，视菌体浓度而定)，至菌体清亮为止。4℃，11000rpm离心15min，弃上清(留取少量上清与沉淀进行SDS-PAGE分析)。
1.3将沉淀分别先后用洗涤液I、洗涤液II各洗涤3次，4℃，11000rpm、离心15min，弃上清(每种洗涤液洗后留取少量上清与沉淀进行SDS-PAGE分析)。
1.4将沉淀用洗涤液III(去离子水)溶解洗涤，4℃，11000rpm、离心20min，弃上清(留取少量上清与沉淀进行SDS-PAGE分析)。
1.5洗涤好的沉淀置于4℃冰箱中保存，将留取的各种标本进行SDS-PAGE分析。
2、纯化
2.1将洗涤后的沉淀用适量包涵体变性液溶解，磁力搅拌器上4℃搅拌过夜后，11000rpm，离心15min后，0.22μm滤器过滤上清，收集过滤后蛋白变性液。
2.2将NTA树脂装入层析柱，之前加入硫酸镍溶液使之形成柱Ni2+-NTA层析柱，下端接核酸蛋白检测仪，检测通过层析柱后的液体中蛋白的含量，层析柱用约10倍NTA体积的GuNTA-0Buffer平衡，调节检测仪数值，平衡至数值稳定。
2.3将过滤后的蛋白变性溶液缓慢加到Ni2+-NTA层析柱中，流速控制在15ml/h左右，根据核酸蛋白检测仪显示的数据收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。
2.4层析用5倍NTA体积的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右，收集部分穿透液。
2.5分别用5倍NTA体积NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200洗脱，流速控制在15ml/h左右，根据核酸蛋白检测仪显示的数据收集洗脱液。
2.6确定目标蛋白质在洗脱液中的大致分布情况，将收集到的穿透液进行SDS-PAGE分析。
3、Bradford法测定蛋白含量
(四)重组蛋白SEQIDNO：2复性
1.根据蛋白质挂柱纯化后SDS-PAGE结果及蛋白的浓度，选取蛋白纯度较高的收集液，计算出收集液中总蛋白的质量，按照沉淀蛋白质量/(复性液体积+收集液体积)在0.1-0.2mg/ml之间，4℃情况下，用恒流泵将复性液缓慢连续加入到目的蛋白溶液中，使蛋白的终浓度最终介于0.1-0.2mg/ml，并用磁力搅拌器温和搅拌24h-48h。
2.将复性好的蛋白溶液在4℃情况下，放入干净的透析袋中，每个透析袋中液体的体积不超过袋子总体积的1/2，装好的袋子放入透析液I中透析6h(复性液与蛋白溶液的总体积：透析液体积为约1∶20)，期间多次更换透析液，平均每种透析液进行透析6h后更换，共5种透析液。
3.完全透析好的蛋白溶液进行小分量分装后，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。被冻干成粉末的蛋白置于-80℃冷冻干燥保存。
(二)复性后重组蛋白Native-PAGE电泳
复性后重组蛋白SEQIDNO：2的活性形式为二聚体，相比创伤弧菌溶细胞素形成四聚体后打孔进入细胞而言具有优越性。
实施例3FITC标记重组蛋白SEQIDNO：2检测其与Hela细胞的结合能力
1.FITC标记重组蛋白SEQIDNO：2
1.1测定纯化的重组蛋白SEQIDNO：2浓度
1.2将9.0ml纯化EQNO：2溶液放入25ml烧杯中，逐滴加入1ml1.0M的碳酸盐缓冲液(不用蛋白溶液按比例加即可)，即使混匀
1.3按每毫克蛋白需0.05mgFITC的比例加入DMSO溶解的FITC。
1.44℃下用磁力搅拌器避光连续搅拌4h，转速为200rpm，以转动时不产生气泡为宜。
1.5标记好的EQNO：2溶液用0.01MPBS溶液透析，期间更换透析液数次，直至不再有游离的FITC析出(一般约12h更换一次)。
1.6透析好的EQNO：2用滤菌器除菌过滤后，用CCK-8法检测其活性并分装于4℃避光保存。
2、标记好的EQNO：2作用于Hela细胞及其结果观察
2.1选择对数生长期Hela细胞，用0.25％胰酶消化后调整细胞数为1.0×105个/ml，传代于激光共聚焦专用平皿中，1.0ml/皿，置37℃、5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养。
2.2设置正常阴性对照组与实验组，待细胞全部贴壁生长好后弃皿内液体，PBS洗涤2次后，对照组加入基础培养基1ml，实验组中根据测定好的蛋白浓度加入10μl的蛋白溶液，使细胞在该浓度下不会出现凋亡或坏死现象。放置37℃、5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中，避光作用4h。
2.3作用时间到后，用PBS清洗皿内细胞2次，加入少量PBS置于激光共聚焦显微镜下观察(期间注意避光，且观察时速度尽量快，以减少荧光猝灭)。
(如图8)
实施例4.重组蛋白EQNO：2作用于Hela细胞后的毒性分析
1.Hela细胞按2×105个/ml密度接种于48孔板，200μl/孔，细胞生长过夜使其贴壁。
2.培养基改为无血清的基础培养基，同时实验分组：加基础培养液的正常组和35μg、70μg复性后重组蛋白作用组，置37℃、5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中，作用5h后。按AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒提供的操作说明进行，染色完后1h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡和坏死的情况(如图9)。存活率依次为：91.6％、84.8％、65.9％。
复性后重组蛋白SEQIDNO：2的活性形式为二聚体，且并不具有温度依赖性，相比创伤弧菌溶细胞素形成四聚体后打孔进入细胞并受温度影响而言具有优越性。
Claims (3)
1.一株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326，已于2012年12月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6925。
2.一种重组蛋白protein400，其特征在于重组蛋白protein400碱基序列如序列表SEQIDNO：1，氨基酸序列如SEQIDNO：2。
3.一种重组蛋白protein400，其特征在于，重组蛋白protein400的制备方法，包括如下步骤：
(1)重组载体pET-28a(+)-protein400的构建
以创伤弧菌标准菌株GTC333全基因组为模板，PCR扩增，并结合定点突变技术获得重组蛋白protein400基因，protein400基因碱基序列如SEQIDNO：1所示，将protein400基因与pET-28a(+)载体连接，获得重组载体pET-28a(+)-protein400；
(2)重组工程菌的制备
重组载体pET-28a(+)-protein400转化入大肠埃希氏菌E.coliBL21(DE3)中，得到含protein400基因的重组工程菌大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326，其保藏编号为CGMCCNo.6925；
(3)重组蛋白protein400的表达
将重组工程菌大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WZMC-8326接种于含30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，于37℃过夜培养；挑取白色单个菌落，接种于含30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、160rpm过夜振荡扩大培养，诱导表达重组蛋白protein400，离心收集菌体破菌，再离心，然后通过Ni2+-NTA层析纯化法、稀释透析复性法得到重组蛋白protein400，其氨基酸序列SEQIDNO：2。
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| Title |
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| Crystal Structure of the Vibrio cholerae Cytolysin(VCC) Pro-toxin and its Assembly into a Heptameric Transmembrane Pore;Rich Olson等;《J.Mol.Biol.》;20051231;第350卷;997-1016 * |
| Novel substituted methylenedioxy lignan suppresses proliferation of cancer cells by inhibiting telomerase and activation of c-myc and caspases leading to apoptosis;P Giridharan等;《British Journal of Cancer》;20021231;第87卷;98-105 * |
| rVvhA功能模序膜成孔的预测及细胞毒作用机制分析;刘艳飞 等;《中国细胞生物学学报》;20121231;第34卷(第6期);527-537 * |
| The HlyU Protein Is a Positive Regulator of rtxA1, a Gene Responsible for Cytotoxicity and Virulence in the Human Pathogen Vibrio vulnificus;Moqing Liu等;《INFECTION AND IMMUNITY》;20070731;第75卷(第7期);3282-3289 * |
| 创伤弧菌溶细胞素vvhA融合蛋白细胞毒活性相关分子机制的探讨;桂静 等;《检验医学教育》;20100630;第17卷(第2期);43-48 * |
| 创伤弧菌溶细胞素中类蓖麻毒素功能模序的细胞毒活性研究;许玲 等;《中国细胞生物学学报》;20130131;第35卷(第1期);53-58 * |
| 创伤弧菌溶细胞素基因在大肠杆菌中的表达及溶血活性鉴定;李桂军 等;《中国人兽共患病学报》;20071231;第23卷(第9期);852-854，860 * |
| 创伤弧菌溶细胞素融合蛋白诱导人Jurkat-T淋巴细胞凋亡的研究;姚蔚 等;《温州医学院学报》;20110731;第41卷(第4期);332-336 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103275911A (zh) | 2013-09-04 |
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