CN103243116A

CN103243116A - 一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用

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Publication number: CN103243116A
Application number: CN2013101672035A
Authority: CN
Inventors: 周选围; 丛蔚然
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Qinling Mountains health pharmaceutical industry technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: CN103243116B

Abstract

本发明公开了一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用。该属内基因具有下述核苷酸序列：序列表中SEQ ID NO.1。发明对该属内重组真菌免疫调节蛋白基因表达于大肠杆菌获得高表达量目的蛋白，并且证明其对乳腺癌和肺癌具有很好的抗肿瘤活性。这对于重组真菌免疫调节蛋白的大规模生产与开发成抗肿瘤新药的应用提供了一种新的应用方向和探索途径。

Description

一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种新的真菌免疫调节蛋白基因核苷酸序列的表达及其应用。

背景技术

真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory proteins,FIPs)是从灵芝中分离得到的继多糖和三萜类化合物后，又一类活性物质。自从1989年Kino等首次从赤芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离得到了这种蛋白，并命名为Ling Zhi-8(LZ-8或FIP-glu)。到目前为止，已分别从赤灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、紫灵芝(G.japoncium)、小孢灵芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis)中克隆得到了7种FIPs，分别为命名为LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja(AY987805)、FIP-gmi和FIP-gsi，形成了一个新的蛋白质家族---真菌免疫调节蛋白（FIPs）家族[Li QZ,Wang XF,Zhou XW.Recent status and prospects of the fungal immunomodulatoryprotein family.Critical Reviews in Biotechnology.2011,31(4):365-375]。在这个蛋白家族中，直接从天然蕈菌中分离得到的真菌免疫调节蛋白仅有四种，它们分别是：LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo，其余的真菌免疫调节蛋白则是通过基因重组技术表达而来，其氨基酸序列是由基因序列翻译后得到的。Wang XF等经过比对发现，FIPs的氨基酸序列同源性较高，一般可达60-70%左右[Wang XF,Su KQ,Bao TW,Cong WR,Chen YF,Li QZ,Zhou XW.Fungal immunomodulatory proteins and immunomodulationeffects.Current Topics in Nutraceutical Research.2012,10(1):1-11.]

FIPs具有一定的免疫调节功能，在抗过敏、抗肿瘤、促进淋巴细胞的增殖、诱导细胞分泌细胞因子和抗移植排斥等方面均有重要作用，其中抗肿瘤作用尤其引起大家兴趣。Lin JW等经MTT(四唑盐)实验和流式细胞仪检测，在毕赤酵母中表达的FIP-glu可以通过诱导细胞凋亡抑制人类白血病NB4的表达水平(32μg/mL FIP-glu可诱导约35%的人类白血病NB4细胞凋亡)，具有一定的抗癌活性[Lin JW,Hao LX,Xu GX,et al.Molecular Cloning and recombinant expression of a gene encoding afungal immunomodulatory protein from Ganoderma lucidum in Pichiapastoris.World Journal Microbiol Biotechnol,2008,25(3):383-390]。LiaoCH等在大肠杆菌中表达的FIP-gts在人类肺腺癌A549细胞中表现出抗肿瘤活性。当FIP-gts的浓度达到4-10μg/mL时，可有效控制癌细胞的转移，具有很好的抗肿瘤效果[Liao CH,Hsiao YM,Lin CH.Inductionof premature senescence in human lung cancer by fungalimmunomodulatory protein from Ganoderma tsugae.Food and ChemicalToxicology,2008,46(5):1851-1859]。研究认为，FIP-gts虽能显著抑制人类肺腺癌A549癌细胞的生长，但是不会影响正常MRC-5纤维原细胞的生长，它在mRNA水平下调端粒酶催化亚基的表达，抑制端粒酶的活性并具有剂量依赖效应。端粒酶在正常的体细胞里一般不被活化，它的活性有无往往会成为决定细胞无限增殖的关键因素。同时，FIP-gts可以促进NK细胞（natural killer cell）、巨噬细胞以及活化血清抗体的生成，有效地调节免疫功能，一定程度上也可以抑制癌细胞的生长[LiaoCH,Hsiao YM,Hsu CP,et al.Transcriptionally mediated inhibition oftelomerase of fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugaein A549human lung adenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis,2006,45(4):220-229]。但由于真菌免疫调节蛋白在天然蘑菇(或蕈菌)中的含量非常低（20-80mg/Kg）[林景卫，孙非，张韧，张春玉，刘立侠.真菌免疫调节蛋白的研究进展.中华免疫学杂志.2005,21(6):477-480.]，人们设想通过异源表达和发酵工业过程大量生产真菌免疫调节蛋白，并开发健康产品或药物。

在真菌免疫调节蛋白的异源表达中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。常用的表达载体有pET-28a、pET-28b和pET-30等，表达的宿主细胞包括有大肠杆菌TG1细胞、大肠杆菌M15细胞、大肠杆菌BL21细胞等。李奇璋等将来源于紫芝（Ganoderma sineses）的FIP-gsi转入pET-30a表达载体中同样可以在大肠杆菌BL21细胞中得到表达,获得了重组的紫芝真菌免疫调节蛋白[李奇璋,王雪飞,黄蕾,等.紫芝免疫调节蛋白基因的原核表达与功能分析.西北植物学报,2010,30(1):35-40]。同样在大肠杆菌BL21细胞中表达，徐贵雪从金针菇基因组中克隆出编码金针菇免疫调节蛋白的基因FIP-fve，构建表达载体pET-28(+)-FIP-fve，转入大肠杆菌菌株BL21中，经过培养筛选稳定表达的重组子，有效的表达了重组金针菇免疫调节蛋白，在细菌中的表达量为30mg/L[徐贵雪.金针菇免疫调节蛋白的重组表达及生物学特性的初探[D].东北师范大学,2009]。大肠杆菌M15细胞也是目前表达真菌免疫调节蛋白基因主要宿主之一，Li QZ等把来源于红灵芝的真菌免疫调节蛋白基因LZ-8(FIP-glu)克隆到pQE-30表达载体中，转化到大肠杆菌M15细胞中，同样获得了重组的真菌免疫调节蛋白FIP-glu[Li QZ,Wang XF,Bao TW,et al.In vitro synthesis of arecombinant fungal immunomodulatory protein from Lingzhi or Reishimedicinal mushroom,Ganoderma lucidum(W.Curt.:Fr.)P.Karst.(Aphyllophoromycetideae)and analysis of its immunomodulatoryactivity.International Journal of Medicinal Mushrooms,2010,12(4):347-358]用于进一步的科学研究或产品研发。同样，Li QZ等人还把来源于紫芝（Ganoderma sinensis）的真菌免疫调节蛋白基因FIP-gsi，转入pQE-30表达载体中，同样在大肠杆菌M15细胞中表达，也获得了重组的紫芝真菌免疫调节蛋白FIP-gsi[Li QZ,Wang XF,Chen YY,et al.Cytokines expression induced by Ganoderma sinensis fungalimmunomodulatory proteins(FIP-gsi)in mouse spleen cells.AppliedBiochemistry and Biotechnology,2010,162(5):1403-1413]。于此同时，在某些时候大肠杆菌TG1细胞同样也可以作为FIPs表达的宿主细胞，1997年Lin等人通过将FIP-gts基因连接到大肠杆菌细胞TG1中，获得了与谷胱甘肽S-转移酶组成融合蛋白标记物（GST），再被凝血酶消化后FIP-gts产量高达20mg/L[Lin W H,Hung C H,Hsu C I,et al.Dimerization of the N-terminal amphipathicα-helix domain of the fungalimmunomodulatory protein from Ganoderma tsugae(Fip-gts)defined by ayeast two-hybrid system and site-directed mutagenesis[J].Journal ofBiological Chemistry,1997,272(32):20044-20048]。综上述所，现有的真菌免疫调节蛋白基因在大肠杆菌中的表达，其表达量大约在约20～30mg/L[叶波平，王凡，梁亦馨,金国虔,吴梧桐．LZ-8基因在大肠杆菌中的表达．药物生物技术，2002，9(1)：21-23；白杰英，曾林，李彦舫，林忠平．真菌免疫调节蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备．实用医药杂志，2006，23(10)：1205-1207],表达的载体和宿主细胞不同，表达蛋白的修饰也不尽相同，因而也表现出不同的生理活性。

在先前的实验中，我们利用DNA shuffling技术对不同来源的真菌免疫调节蛋白基因在DNA水平上进行重组，构建得到改组文库，利用斑点杂交技术和特异性抗体对改组文库进行筛选，分别得到属内重组菌株[周选围，王雪飞，李奇璋，苏恺琪等.灵芝属内重组的真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用。申请号:201110068761.7]和属间重组菌株[周选围，王雪飞，李奇璋，苏恺琪等.灵芝属内重组的真菌免疫调节蛋白基因、该基因编码的蛋白及其应用。申请号:201110068813.0]，在本实验中我们选择了前述属内重组中的reFIP-SN15基因，进一步研究其表达产物的制备方法及表达产物在开发抗肿瘤药物产品中的应用。

在对现有文献的分析中，至今尚未发现有与本发明主题相同的文献报道。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供reFIP-SN15基因表达产物的制备方法，具体包括一种针对reFIP-SN15基因有效的原核表达载体、大肠杆菌宿主细胞，利用该载体和宿主细胞表达的reFIP-SN15蛋白的分离纯化方法；另一目的是提供，reFIP-SN15基因表达蛋白在开发抗癌药物方面的应用。

本发明所提供的重组真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15基因序列，是通过DNA shuflling技术从赤芝（Ganoderma lucidum）真菌免疫调节蛋白基因FIP-glu和紫芝（Ganoderma sinensis）真菌免疫调节蛋白基因FIP-gsi重组而来的（申请号：201110068761.7）。将通过基因重组的新的真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15基因构建成原核表达载体pET-30a-reFIP-SN15转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导其表达；原核表达产物经金属镍离子螯合柱纯化后,用MTT法测定了reFIP-SN15蛋白对不同人类癌症细胞株的毒性。在体外毒性试验中选取四株人类癌细胞：肺癌细胞A549（Lung carcinoma）、结肠癌细胞HT-29（Colon cancer）、肝癌细胞HCC-LM3（Hepatocellular carcinoma）、乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma）进行试验。

本发明的具体操作方法包括如下步骤：

（1）构建表达载体；

（2）转化至大肠杆菌；

（3）扩大培养；

（4）IPTG诱导表达；

（5）分离纯化；

所述属内重组真菌免疫调节蛋白为属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的表达产物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。

优选地，所述步骤（1）构建表达载体的具体方法为：

a.根据属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的序列，设计引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和HindⅢ，以构建原核表达载体;

b.以reFIP-SN15基因为模板，经PCR扩增后，将reFIP-SN15基因克隆至中间载体;

c.用双酶切将reFIP-SN15片断从中间载体上切下，回收相应片段，用T4连接酶16℃连接过夜得表达载体。

优选地，所述步骤b中的所述中间体为pMD18-T simple vector或pET-30a。

优选地，所述步骤（2）的具体方法为：将所述表达载体加入大肠杆菌感受态细胞冰上放置30min，之后42℃循环水浴热击90s，迅速冰浴2min。加入800μL LB培养液37℃慢摇复苏1h。取200μL菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，筛选转化子并挑取阳性克隆。

优选地，所述步骤（3）的具体方法为：将获得的阳性克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日以2%接种量接种，37℃继续发酵。

优选地，所述步骤（4）的具体方法为：当发酵液OD₆₀₀达到0.5～0.7时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为1mM。

优选地，所述步骤（5）的具体方法为：

a.将经过IPTG诱导的菌液离心收集细胞，悬浮于缓冲液中；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化；

b.将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎；

c.超声处理过的菌液离心取上清，上Ni-NTA柱，用缓冲液1洗柱后，用缓冲液2将目的蛋白洗脱出来；

所述缓冲液1为50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mMimidazole，pH为8.0的水溶液；

所述缓冲液2为50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mMimidazole，pH8.0的水溶液。

分别培养人肺癌细胞A549（Lung carcinoma）、人结肠癌细胞HT-29（Colon cancer）、人肝癌细胞HCC-LM3（Hepatocellular carcinoma）、人乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma），检测重组蛋白FIP-SN15对各细胞株的抑制效果。结果表明重组基因表达的真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15，在体外可抑制人肺癌细胞A549（Lung carcinoma）和乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma）的繁殖，说明该蛋白对这两种肿瘤细胞株有抑制作用。

本发明中所涉及的生物材料及试剂除特别注明外，均能够从市售获得。

本发明中所述的属内真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15基因序列，见于专利：201110068761.7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中所涉及的大肠杆菌BL21已在[李奇璋，王雪飞，黄蕾，周选围.紫芝免疫调节蛋白基因的原核表达与功能分析，西北植物学报，2010，30(1):0035–0040]中公开；BL21大肠杆菌菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如北京博迈德科技发展有限公司，公司地址：北京市海淀区西四环中路甲59号。

本发明中所述金属镍离子螯合（Ni-NTA）柱适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（Native Protein）。

本发明中所述纳升液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪型号为impact Q-tof ultimate3000，购自Bruker公司和Dionex公司，为上海交通大学分析测试中心所有。

本发明中所述MTT法根据SOP PL-BIO002标准化流程操作。其中选用的肺癌细胞A549（Lung carcinoma）、结肠癌细胞HT-29（Coloncancer）、肝癌细胞HCC-LM3（Hepatocellular carcinoma）、乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma）均购自澎立生物医药技术（上海）有限公司，公司地址：上市海伽利略路388号，7号楼。

在本发明中，可包括含有重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的载体、所述载体转化的宿主细胞。

本发明利用重组基因表达的真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15，在体外可抑制人肺癌细胞A549（Lung carcinoma）和乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma）的繁殖，说明该蛋白对这两种肿瘤细胞株有抑制作用。该基因将通过转基因技术，通过蛋白表达和纯化，在抗肺癌和乳腺癌药物的开发中有巨大的应用潜力。

附图说明

图1重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白电泳图（A）及Western Blot检测图(B)

图2重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白抗肿瘤活性测定和其对人肺癌细胞A549（Lung carcinoma）、人结肠癌细胞HT-29（Colon cancer）、人肝癌细胞HCC-LM3（Hepatocellular carcinoma）、人乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma）细胞毒性影响。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明的具体过程。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15原核表达载体的构建：

（1）根据属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的序列，设计能扩增出其基因全长的引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和HindⅢ，以构建原核表达载体。

（2）以属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15为模板，经PCR扩增后，将reFIP-SN15基因克隆至中间载体（如pMD18-T simplevector），测序结果与所报道的属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15序列比较，一致性为100％，表明扩增没有出现错配。

（3）根据引物两端设计的酶切位点，用双酶切（pET-30a载体可用HindⅢ和Bam H I）将reFIP-SN15片断从pMD18-T simple vector上切下，回收相应片段，用T4连接酶16℃连接过夜。

（4）连接产物转化大肠杆菌BL21宿主细胞,用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板筛选转化子并挑取阳性克隆，测序。

（5）提取克隆质粒，即得到重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白表达载体pET30a-reFIP-SN15。

实施例2

灵芝属内重组真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15的诱导表达与纯化：

1.重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15的诱导表达及Westernblot检测

（1）将实施例1中获得的单克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。

（2）次日以2%接种量接种于较大体积培养液。37℃继续培养，至OD₆₀₀达到0.5～0.7时，加入IPTG，使IPTG的终浓度达到1mM。

（3）每0、1、2、3、4、5h取出1mL至-20℃保存备用。将所取得菌液样品5,000rpm离心20min以收集菌体，去上清，菌体用100μL2×SDS-PAGE Sample buffer(100mM pH6.8Tris-Cl，4%(W/V)SDS，0.2%(W/V)BPB，20%(W/V)glycerine，2%(W/V)β-ME)悬浮，并在95℃水浴锅中保温5min。之后再分别用两块15%SDS-PAGE胶检测。一块用于考马斯亮蓝染色，另一块用于Western blot检测(图1)。

图1所示，上方（A）为含有重组表达载体pET30-reFIP-SN15的大肠杆菌BL21细胞经IPTG诱导蛋白表达电泳图，下方（B）为灵芝属内重组真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15的Western Blot检测。泳道M为marker，泳道1-6分别为诱导时间0、1、2、3、4、5小时的大肠杆菌细胞，箭头所示即为灵芝属内重组真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15。诱导4小时时，重组蛋白表达量为最高。经大肠杆菌发酵，重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白的产量高达35.95mg/L。

2.重组真菌免疫调节蛋白的分离纯化

（1）将经过IPTG诱导的菌液5,000rpm离心20min以收集细胞，用1/10体积的Lysis buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole，pH8.0)悬浮；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化；

（2）将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎，200～300W超声6次，每次10s，期间间隔10s；

（3）超声处理过的菌液于4℃下12,000rpm离心20～30min；取上清，使用Ni-NTA柱纯化(预先用10倍柱体积的Lysis buffer平衡)；用20倍柱体积的Wash buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH8.0)洗柱；目的蛋白由Elution buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0)洗脱出来。

实施例3

重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15的Q-tof MS分析

1.重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15前处理

（1）用干净刀片割下SDS-PAGE凝胶目的条带，转入1.5mL离心管，并用200μL枪头将胶片粉碎成1-2mm²大小的胶块；

（2）超纯水洗胶两次，加入500μL脱色液（50%乙腈，25mMNH₄HCO₃），室温振荡15-20min，离心弃上清液。重复此步骤1-2次至胶块无色；

（3）加入500μL50%乙腈，室温振荡10-15min，离心弃上清液；

（4）样品置于浓缩干燥仪中干燥（50-55℃5min或室温10min）；

（5）加入100μL10mM DTT（25mM NH₄HCO₃溶解或稀释），60℃水浴放置20min，离心弃掉上清液；

（6）加入300μL50%乙腈，震荡5-10min，离心并弃掉上清液；

（7）加新配置的IAA（4.62mg/mL Iodoacetimide，25mM NH₄HCO₃溶解）室温避光放置15-20min，离心1min，弃去上清液；

（8）加100μL50mM NH₄HCO₃震荡5-10min，离心弃上清，加入300μL50%乙腈，震荡5-10min，离心去上清；

（9）沉淀在浓缩干燥仪中干燥（50-55℃5min或室温10min）；

2.消化

（1）干燥产物中加入70μL Trypsin酶液（常用测序级Trypsin，Promega，浓度为10ng/μL，溶于50mM NH₄HCO₃）；

（2）37℃恒温箱中倒置过夜；

3.萃取

（1）10-100μL乙腈：水：甲酸（60:35:5），超声粉碎5min，37℃放置1h。

（2）将液体吸净至另一干净的离心管中，加入10-100μL乙腈，超声粉碎5min，37℃静置40-60min，将液体吸净转移至以上步骤离心管，合并提取液；

（3）浓缩干燥仪中50-55℃干燥1-2h，干燥样品可-20℃保存；

4.上样

（1）干燥样品加入适量（40-60μL）的solution A（98%MiliQ-H₂O，2%CH₃CN，0.1%FA），震荡5-10min重新溶解；

（2）上样溶液离心10min，取适量（20μL左右）样品加入样品瓶上样分析。

Q-tof MS验证了25条肽段。经过拼接后证实，共有3条肽段与预测序列重合，重合序列中包含102个氨基酸残基，匹配率超过90%（如下表所示，其中下划线部分为肽段碎片重合部分）。该结果证实，在大肠杆菌中表达并且纯化得到的分子量约为19kD的蛋白为重组的reFIP-SN15蛋白。

实施例4

重组灵芝属内真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15的MTT实验

1.癌细胞的培养

MTT实验根据SOP PL-BIO002标准化流程进行操作，细胞的培养和筛选根据OP PL-ONC001和PL-ONC004标准化流程进行。将人肺癌细胞A549（Lung carcinoma）、人结肠癌细胞HT-29（Colon cancer）、人肝癌细胞HCC-LM3（Hepatocellular carcinoma）、人乳腺癌细胞MDA-MB-231（Breast adenocarcinoma）分别在DMEM培养基（加入10%胎牛血清）、F-12K培养液（加入10%胎牛血清）、McCoy’s5A培养基（加入10%胎牛血清）、DMEM培养基（加入10%胎牛血清）和Leibovitz's L-15培养基（加入10%胎牛血清）中培养。

2.MTT实验

（1）将实施例3.1中细胞浓度调整到5-7×10³/100μL加入96孔板，并在CO₂培养箱中37℃培养过夜。

（2）将重组蛋白FIP-SN用透析袋进行透析除去溶液中的咪唑成份，透析液为PBS（10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，2mMKH₂PO₄，pH7.4）。用PBS和细胞培养液稀释至工作浓度（25μg/mL,5μg/mL,1μg/mL,200ng/mL,40ng/mL,and8ng/mL）。

（3）在96孔板中加入测试重组蛋白混合物，混合物有6个浓度梯度，每个梯度3个重复。并在CO₂培养箱中37℃培养72h。

(4)将MTT试剂加入每孔至终浓度0.5mg/mL，37℃培养4h。

(5)吸出上清液并在每孔加入150μL DMSO以便完全溶解甲臜沉淀。

(6)使用酶标仪，在550nM处读出测试波长、630nM处读出参考波长。

细胞存活率(%)=(平均样品的吸光度/阴性对照组的平均吸光度)×100.

使用Xlfit软件计算IC₅₀值.重组的真菌免疫调节蛋白reFIP-SN15对四种人肿瘤细胞的抑制结果如图2所示，各浓度重组蛋白混合物对不同癌细胞的抑制作用。重组蛋白FIP-SN对肺癌细胞A549和乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制效果较好，IC₅₀分别为24.605和23.921μg/mL；对结肠癌细胞HT-29和肝癌细胞HCC-LM3抑制情况较差，在40μg/mL浓度以下没有追踪出IC₅₀值。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建表达载体；

（2）转化至大肠杆菌；

（3）扩大培养；

（4）IPTG诱导表达；

（5）分离纯化；

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。

2.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（1）构建表达载体的具体方法为：

3.如权利要求2所述的属内重组真菌免疫调节蛋白基因的制备方法，其中，所述步骤b中的所述中间体为pMD18-T simple vector或pET-30a。

4.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白基因的表达方法，其中，所述步骤（2）的具体方法为：将所述表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞,用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板筛选转化子并挑取阳性克隆；

所述转化条件为：表达载体加入大肠杆菌感受态细胞冰上放置30min，之后42℃循环水浴热击90s，迅速冰浴2min。之后加入800μLLB培养液37℃慢摇复苏1h。

5.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（3）的具体方法为：将获得的阳性克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日以2%接种量接种，37℃继续发酵。

6.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（4）的具体方法为：当发酵液OD₆₀₀达到0.5～0.7时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为1mM。

7.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（5）的具体方法为：

b.将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎；

所述缓冲液1为50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH为8.0的水溶液；

所述缓冲液2为50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0的水溶液。

8.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用。

9.如权利要求8所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是指用于抗人肺癌或乳腺癌的药物。

10.如权利要求9所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是指用于抗乳腺癌的药物。