CN103275886A

CN103275886A - 一株稳定高产2,3-丁二醇的细菌及利用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法

Info

Publication number: CN103275886A
Application number: CN2013100802370A
Authority: CN
Inventors: 戴建英; 程小龙; 修志龙
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: CN102660481A; CN103275886B

Abstract

本发明公开了一株稳定高产2,3-丁二醇的阴沟肠杆菌及利用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法，其分类命名为Enterobacter cloacae DLM，其保藏号为：CGMCC 6053。该诱变方法特征是：将细菌悬浮于生理盐水中，依次进行“硫酸二乙酯预处理→低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变”。该菌株能有效利用不同碳源发酵生产2,3-丁二醇，糖的转化率高，2,3-丁二醇浓度高；葡萄糖或菊糖水解液为碳源时，5L发酵罐中2,3-丁二醇浓度分别达到125.2g/l和120.2g/l。本发明使用的诱变方法操作简单易行、诱变处理时间短等特点，为微生物的诱变育种提供了一种可靠方法。

Description

一株稳定高产2,3-丁二醇的细菌及利用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法

技术领域

本发明属于微生物诱变育种技术领域，涉及到使用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变产生一株高产2,3-丁二醇的菌株及其应用。

背景技术

2,3-丁二醇（2,3-Butanediol，2,3-BD）是一种非常重要的化工原料及燃料，在医药、食品、精细化工等领域有广泛用途。由于2,3-丁二醇含有两个手性中心，化学合成困难，所以以生物质资源为原料、经微生物法生产2,3-丁二醇具有很大的工业化前景，其中如何获得高产2,3-丁二醇的菌株对于生物法生产2,3-丁二醇的工业化具有重要意义。

目前发酵生产2,3-丁二醇的微生物主要是细菌类，包括克雷伯氏菌属（Klebsiella）、芽孢杆菌（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、假单孢杆菌属（Pseudomonad）等。目前肺炎克雷伯氏杆菌发酵获得的2,3-丁二醇产物浓度最高，也是研究最多的菌种。但此菌属于条件致病菌，作为一种工业应用菌种具有很大的局限性和不安全性。

近年来，国内外对2,3-丁二醇的发酵的研究很多，主要围绕着菌种的诱变筛选和基因工程改造等。最常用的诱变方法有紫外诱变、化学诱变或两者的结合。紫外诱变虽然安全，但是操作复杂，而且诱变效率低。化学诱变的效果较好，但是一般作用时间长，毒副作用大。

低温等离子体是一种低温非平衡等离子体，是指气体在大气压下受到外界高能量(高电压、强电磁场、辐射等)作用时气体分子被击穿，产生带电粒子、自由基、活性物质和紫外线等，且整个体系呈现低温状态。低温等离子处理细胞时能够破坏细胞壁，可以使大量带电粒子、活性物质和紫外线能够进入细胞直接作用于胞内核酸，同时这也使化学分子能更有效地直接作用于DNA上，减少了处理时间。

本发明使用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法对微生物进行诱变育种。该方法中使用的硫酸二乙酯用量低，在空气中暴露时间短，不仅保证了化学诱变的高效性，同时增加了操作人员的安全性。采用的复合诱变方法操作简单易行、效率高，复合诱变大大降低了突变菌的回复率，保证了突变菌的稳定性。

发明内容

本发明内容在于使用一种新型的诱变方法—低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变法处理微生物，选育一株稳定高产2,3-丁二醇的突变菌株及该菌株在发酵生产2,3-丁二醇中的应用，解决工业生产中生产安全和发酵液2,3-丁二醇浓度低的问题，为2,3-丁二醇的工业生产及应用奠定基础，同时也为其他微生物的诱变选育提供了一种新的诱变方法。

本发明提供了一种行之有效的诱变育种新技术。以Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）或其他细菌为原始菌株，首先使用硫酸二乙酯预处理原始菌株，然后使用低温等离子体处理含有硫酸二乙酯的菌悬液进行复合诱变，最后通过多重筛选得到稳定高产的突变菌株。

本发明的技术方案如下：

一株稳定高产2,3-丁二醇的细菌，其分类命名为Enterobacter cloacae DLM，已于2012年4月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其保藏号为：CGMCC6053。

上述细菌利用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变的方法，包括如下步骤：

（1）将原始菌株进行硫酸二乙酯预处理

将菌种以1-2%接种量接入种子培养基中，培养12-16h后，取菌液离心，弃上清液，残留菌体用无菌生理盐水稀释至细胞个数为10⁷-10⁹/mL。向菌悬液中加入1-3%（v/v）的硫酸二乙酯进行振荡混合，处理时间为3-10min。

（2）复合诱变菌株

采用介质阻挡放电（DBD）装置。取500uL硫酸二乙酯预处理过的菌悬液滴加到直径60mm的灭菌冷却后玻璃圆盘的中央，置于等离子体诱变平台中。调节玻璃圆盘上部的高压电极与菌液液面的间隙，调节电流和电压，使气体产生放电，得到均匀的空气介质阻挡放电等离子体，放电处理15-160s。将此菌悬液稀释涂于平板培养基上，将平板置于25～37°C恒温培养箱中培养，培养时间为1～2天。计数平板上的菌落数，得出致死率，从而确定最佳诱变时间，诱变时间一般选择致死率约为70%左右的时间点。

（3）菌种筛选

挑取在平板上生长良好、菌落比较大的菌落至种子培养基中进行初筛，摇瓶培养24-48h后，检测产物浓度；然后将产物浓度明显提高的突变菌转接至发酵培养基中进行复筛，3瓶平行培养24-48h，检测产物浓度；选取高产物浓度的菌株在发酵罐中培养，验证其发酵性能；通过摇瓶传代，比较不同代菌株的发酵罐培养实验结果，验证其遗传稳定性。

通过上述方法得到的稳定高产2,3-丁二醇的菌株在发酵生产2,3-丁二醇中应用，其发酵使用的培养基包括如下成分：碳源2-14%、氮源0.5-3%、无机盐0.2-0.5%，其余为水；其中碳源为葡萄糖、淀粉水解液、菊粉水解液中一种或两种及以上的混合；所述氮源为无机或有机含氮化合物，其中无机氮源为磷酸氢二铵和尿素中一种或两种的混合，有机含氮源为酵母粉和玉米浆中一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、柠檬酸、亚铁、锰、锌和EDTA。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明使用等离子体和硫酸二乙酯复合诱变微生物的方法。

实验菌种为Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌），从土壤中筛选得到。实验中使用的等离子体放电装置为专利200610047213.5实施例一中使用的介质阻挡放电（DBD）装置。

本实施例使用的种子培养基为：葡萄糖40g/L，(NH₄)₂HPO₄6g/L，KCl1.8g/L，EDTA0.51g/L，MgSO₄0.88g/L，FeSO₄·7H₂O0.0225g/L，ZnSO₄·7H₂O0.0075g/L，MnSO₄·H₂O0.0023g/L，柠檬酸0.21g/L，柠檬酸钠0.294g/L，酵母粉1g/L。

发酵培养基为：葡萄糖120g/L，(NH₄)₂HPO₄18g/L，KCl1.8g/L，EDTA0.51g/L，MgSO₄0.88g/L，ZnSO₄·7H₂O0.0075g/L，FeSO₄·7H₂O0.0225g/L，MnSO₄·H₂O0.0023g/L，柠檬酸0.21g/L，柠檬酸钠0.294g/L，酵母粉1g/L。

培养条件为：摇瓶装液量为体积1/3,温度37℃，摇床转速200rpm。

硫酸二乙酯预处理

将原始菌种以1-2%接种量接种于100mL种子培养基中，在37℃、200rpm条件下培养12-16h，得到处于对数生长期的菌液。取1ml的菌液，12000rpm离心2分钟，弃上清，残留菌体用无菌生理盐水稀释至细胞个数约为10⁷-10⁹/mL。取1mL稀释后的菌悬液置于离心管中，向悬液中加入2%（v/v）的硫酸二乙酯（约20uL），置于漩涡振荡器上处理5min。

诱变过程

取500uL硫酸二乙酯预处理过的菌悬液滴加到直径60mm的经酒精消毒灭菌后玻璃圆盘的中央，置于等离子体诱变平台中，调整上电极与菌液液面间的距离至3mm，在电压25v、电流1.2A的条件下放电处理100s。

实施例2

本实施例说明筛选高产2,3-丁二醇的突变菌株的方法

摇瓶初筛

将诱变后的菌液稀释涂平板，置于37℃恒温培养箱中培养24h，挑取平板上菌落形态良好的菌落接种到50mL种子培养基中，在37℃、200rpm条件下培养36h，气相检测2,3-丁二醇浓度，选取产物浓度高于原始菌20%以上的菌株。

摇瓶复筛

将经摇瓶初筛得到的菌株转接于200mL发酵培养基中，每个样品做三个平行，置于37℃恒温摇床中，200rpm振荡培养36h。气相检测2,3-丁二醇浓度，选取产物浓度仍高于原始菌20%以上的菌株。

发酵罐培养验证

用Biotech5L全自动发酵罐，发酵培养基体积为1.5L，温度为37℃，搅拌转速为250rpm,用5mol/L NaOH控制pH为5.9，发酵过程中保持通200ml/(L·min)的压缩空气，葡萄糖起始浓度为120g/L，10%接种，发酵过程中使用蠕动泵连续流加800g/L的高浓度葡萄糖浆，保持发酵过程中发酵液中葡萄糖浓度在50g/L左右，发酵实验至少重复3次。发酵液中2,3-丁二醇浓度在110g/L左右，比原始菌株提高了26%左右。

实施例3

本实施例说明突变菌Enterobacter cloacae DLM的遗传稳定性。

在以葡萄糖为碳源的种子培养基中连续传代，以第一代、第三代和第七代进行发酵罐批式流加实验，检查突变株DLM的传代稳定性。实验结果如表1所示。

表1

Strain	Fermentation time(h)	2,3-BD(g/L)	2,3-BD yield(g/g)
				Enterobacter cloacae	56	87.29	0.29
E.cloacae DLM（1st）	56	109.32	0.40
				E.cloacae DLM（3rd）	56	110.92	0.41
E.cloacae DLM（7th）	56	111.14	0.39

从实验结果可以看出，经过连续7代的传代，该突变菌发酵性能非常稳定。

实施例4

本实施例说明Enterobacter cloacae DLM在5L发酵罐中葡萄糖发酵生产2,3-丁二醇的工艺。

本实施例采用的种子培养基为实施例1的种子培养基。

本实施例采用的发酵培养基为实施例1的发酵培养基。

将Enterobacter cloacae DLM接种至含有150mL种子培养基的500mL摇瓶中培养，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间12-16h。再将种子培养基接种到含有1.5L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10%，发酵温度为37℃，搅拌转速为250rpm，发酵起始pH值为7，发酵过程中控制pH值为5.9，连续通入150ml/(L·min)的压缩空气（发酵培养基起始溶氧值为9.4ppm，发酵过程中的溶氧值保持在0.4～0.5ppm），并且在发酵过程中连续流加800g/L的高浓度葡萄糖浆，保持培养基中葡萄糖浓度为50g/L左右。发酵培养56h后，气相检测2,3-丁二醇产量达到125.2g/L，糖转化率为0.42g/g。

实施例5

本实施例说明Enterobacter cloacae DLM在5L发酵罐中菊粉同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的工艺。

本实施例采用的种子培养基为实施例1的种子培养基。

发酵培养基：菊粉120g/L，(NH₄)₂HPO₄18g/L，KCl1.8g/L，EDTA0.51g/L，MgSO₄0.88g/L，ZnSO₄·7H₂O0.0075g/L，FeSO₄·7H₂O0.0225g/L，MnSO₄·H₂O0.0023g/L，柠檬酸0.21g/L，柠檬酸钠0.294g/L，酵母粉1g/L。

将Enterobacter cloacae DLM接种至含有150mL种子培养基的500mL摇瓶中培养，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间12-16h。5L发酵罐含有1.5L发酵培养基，温度为37℃，搅拌转速为250rpm，pH值为5.9，加入500U的菊粉酶水解1h后按10%的接种量接入上述菌液。发酵过程中控制pH值为5.9，连续通入150ml/(L·min)的压缩空气。在发酵过程从第11h开始每4h补40g菊粉和150U菊粉酶，共补11次。发酵培养63h后，气相检测2,3-丁二醇产量达到120.2g/L。

Claims

1.一株稳定高产2,3-丁二醇的细菌，其分类命名为Enterobacter cloacaeDLM，其保藏号为：CGMCC6053。

2.使用低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变权利要求1所述的细菌的方法，其特征在于：

（1）将原始菌株进行硫酸二乙酯预处理：将菌种以1-2%接种量接入种子培养基中，培养12-16h后，取菌液离心，弃上清液，残留菌体用无菌生理盐水稀释至细胞个数为10⁷-10⁹/mL；向菌悬液中加入1～3%（v/v）的硫酸二乙酯进行振荡混合，处理时间为3-10min；

（2）复合诱变菌株：采用介质阻挡放电（DBD）装置，取500uL处理过的菌悬液滴加到直径60mm的灭菌冷却后玻璃圆盘的中央，置于等离子体诱变平台中；调节玻璃圆盘上部的高压电极与菌液液面的间隙，调节电流和电压，使气体产生放电，得到均匀的空气介质阻挡放电等离子体，放电处理15-160s；将此菌悬液稀释涂于平板培养基上，将平板置于25～37°C恒温培养箱培养，培养时间为1～2天；

（3）菌种筛选：挑取在平板上生长良好的菌落依次进行种子培养基摇瓶初筛、发酵培养基摇瓶复筛，获得产物浓度明显提高的突变菌株，然后进行发酵罐培养验证其发酵性能；通过摇瓶传代，比较不同代菌株的发酵罐培养实验结果，验证其遗传稳定性。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵使用的培养基包括如下成分：碳源2-14%、氮源0.5-3%、无机盐0.2-0.5%，其余为水；其中碳源为葡萄糖、淀粉水解液、菊粉水解液中一种或两种及以上的混合；所述氮源为无机或有机氮化合物，其中无机氮源为磷酸氢二铵和尿素中一种或两种的混合，有机氮源为酵母粉和玉米浆中一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、柠檬酸、亚铁、锰、锌和EDTA。