CN109880765B

CN109880765B - 生产2,3-丁二醇和有机酸的菌株和方法

Info

Publication number: CN109880765B
Application number: CN201910194985.9A
Authority: CN
Inventors: 张建安; 吴晶; 周玉杰; 刘宏娟
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN109880765A

Abstract

本发明提出了微生物及获得2,3‑丁二醇和有机酸的方法，所述微生物其为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae M22)，于2019年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17265。本发明的微生物可以利用未经脱毒处理的木质纤维素水解液，对其中的抑制物具有高耐受性，同时，还可以高产2,3‑丁二醇和有机酸。而且，该微生物稳定性良好，连续多次传代，抑制物耐受性和发酵产2,3‑丁二醇和有机酸能力稳定。另外，将水解液进行脱毒会加大工艺成本，并且脱毒过程中使用的一些化学试剂无法回收利用，而直接使用未经脱毒处理的水解液进行发酵将大大降低2,3‑丁二醇和有机酸的生产成本，具有较好的应用前景。

Description

生产2,3-丁二醇和有机酸的菌株和方法

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及生产2,3-丁二醇和有机酸的菌株和方法。

背景技术

2,3-丁二醇(2,3-BDO)和有机酸都是重要的大宗化学品，被广泛应用于化工、燃料、食品、医药等多个领域。2,3-BDO可以用来生产高价值的液体燃料添加剂甲乙酮，其酯化物可以用于合成聚亚胺，也可以用于制造医药用品、化妆品、洗护用品等。在微生物发酵生产2,3-BDO过程中会伴随有机酸的产生，如甲酸、乙酸、丁二酸。丁二酸可用于合成氨基酸、镇静剂、维生素、1,4-丁二醇、N-甲基吡咯烷酮以及酸化剂、风味调节剂等。近几年，丁二酸被应用于聚丁二酸丁二醇酯(PBS)及聚酰胺等可降解生物聚合物的合成，具有广阔的发展前景。

葡萄糖、木糖、淀粉以及木质纤维素原料(如玉米芯、玉米秸秆、麦秆等)都可以作为微生物发酵的底物。其中玉米芯产量丰富且价廉易得，是最理想的发酵原料之一。玉米芯中半纤维素可以通过稀酸水解被降解为单糖，但水解过程中会产生抑制物，因此水解液在发酵前需要先进行脱毒。目前的研究都集中于脱毒工艺，如活性炭吸附、CaOH过中和、有机溶剂萃取等。脱毒过程会造成糖损失，并且会增加工艺成本。

因此，若能够筛选得到高浓度抑制物耐受菌株，可以直接利用水解液为原料，将会大大降低生产成本，但大部分野生菌抑制物耐受能力很低。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae M22)，于2019年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17265。根据本发明实施例的微生物可以利用未经脱毒处理的木质纤维素水解液，对其中的抑制物具有高耐受性，同时，还可以高产2,3-丁二醇和有机酸。而且，该微生物稳定性良好，连续多次传代，抑制物耐受性和发酵产2,3-丁二醇和有机酸能力稳定。另外，将水解液进行常规脱毒会加大工艺成本，并且脱毒过程中使用的一些化学试剂无法回收利用，而直接使用未经脱毒处理的水解液进行发酵将大大降低2,3-丁二醇和有机酸的生产成本，具有较好的应用前景。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种获得2,3-丁二醇和有机酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用木质纤维素水解液对前面所述的微生物进行发酵培养，以便获得2,3-丁二醇和有机酸。根据本发明实施例的微生物可以利用未经脱毒处理的木质纤维素水解液，对其中的抑制物具有高耐受性，同时，还可以高产2,3-丁二醇和有机酸。而且，该微生物稳定性良好，连续多次传代，抑制物耐受性和发酵产2,3-丁二醇和有机酸能力稳定。另外，将水解液进行常规脱毒会加大工艺成本，并且脱毒过程中使用的一些化学试剂无法回收利用，而直接使用未经脱毒处理的水解液进行发酵将大大降低2,3-丁二醇和有机酸的生产成本，具有较好的应用前景。

根据本发明的实施例，所述木质纤维素水解液是通过将木质纤维素原料进行酸处理且未经脱毒处理所获得的。

根据本发明的实施例，所述木质纤维素水解液中含有下列至少之一的成分：5～8g/L的葡萄糖；50～55g/L的木糖；1～4g/L的低聚木糖；4～10g/L的阿拉伯糖；0.3～1.0g/L的甲酸；4～10g/L的乙酸；0.05～0.4g/L的5-羟甲基糠醛；0.4～1.5g/L的糠醛。

根据本发明的实施例，所述木质纤维素水解液是通过下列方式获得的：将木质纤维素原料在含有硫酸和磷酸的混合酸中进行水解处理，以便得到水解产物；以及将所述水解产物进行过滤处理，弃滤渣，以便得到所述木质纤维素水解液。

根据本发明的实施例，所述木质纤维素原料与所述混合酸的质量体积比为1：(1～5)，优选1:3。

根据本发明的实施例，所述混合酸中，硫酸与磷酸的质量比为(2～5)：1，优选3:1。

根据本发明的实施例，所述水解处理是在120～150℃下进行40～80分钟，优选是在130℃下进行60分钟。

根据本发明的实施例，所述木质纤维素中含有下列至少之一的成分：35～45g/L的纤维素；30～35g/L的半纤维素；10～22g/L的木质素。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：在进行所述发酵培养之前，调节所述木质纤维素水解液的pH值至6.0～7.0。

根据本发明的实施例，所述有机酸包括下列的至少之一：丁二酸、甲酸和乙酸。

根据本发明的实施例，所述发酵培养是在30～40℃的温度、100～200rpm/min的转速以及0.2～0.6vvm的通气量下进行36～60小时。

根据本发明的实施例，在所述发酵培养12小时和36小时时，分别向发酵液中加入终浓度为3～8g/L的碳酸氢钠，当发酵终止时，发酵液中丁二酸、甲酸和乙酸的质量比为(3～5)：1：(5～7)。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的E.cloacae M22利用未脱毒的玉米芯水解液发酵生产2,3-BDO和有机酸的发酵过程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了微生物及获得2,3-丁二醇和有机酸的方法，下面将分别对其进行详细描述。

微生物

在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，该微生物为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae M22)，于2019年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.17265。根据本发明实施例的微生物可以利用未经脱毒处理的木质纤维素水解液，对其中的抑制物具有高耐受性，同时，还可以高产2,3-丁二醇和有机酸。而且，该微生物稳定性良好，连续多次传代，抑制物耐受性和发酵产2,3-丁二醇和有机酸能力稳定。另外，将水解液进行常规脱毒会加大工艺成本，并且脱毒过程中使用的一些化学试剂无法回收利用，而直接使用未经脱毒处理的水解液进行发酵将大大降低2,3-丁二醇和有机酸的生产成本，具有较好的应用前景。

为方便理解，下面将对微生物的获得方式进行详细描述。

本发明的微生物是将实验室分离的一株阴沟肠杆菌进行等离子体诱变处理而获得的，

具体步骤如下：

(1)细菌培养

将甘油管中菌种划线接种到LB固体培养基上，培养，挑取单菌落转接于LB液体培养基，培养至对数生长期。

(2)ARTP诱变

将(1)得到的菌液采用等离子体照射诱变，诱变后菌体转于LB培养基，复苏。

(3)菌株初筛

将(2)得到的菌液涂于含玉米芯水解液的固体培养基上，培养，选长出菌落最多的平板进行下一步筛选。

(4)菌株复筛

将(3)得到的菌株于LB液体培养基复苏后划线于含高浓度玉米芯水解液的固体培养基上，培养，保存得到的菌株并进行下一步发酵。

(5)利用未脱毒玉米芯水解液发酵生产2,3-BDO和有机酸

利用(4)筛选得到的菌株接种于种子培养基，进行培养，然后将培养后的培养液按10v/v％接种量接种于水解液发酵培养基中，进行培养，筛选2,3-丁二醇产量高的菌株。

(6)稳定性考察

将(5)筛选得到的菌株连续传代3代，进行稳定性考察。

最终，获得的微生物M22对水解液中的抑制物具有高耐受性，同时，还可以高产2,3-丁二醇和有机酸。另外，该微生物稳定性良好，连续传代3代，抑制物耐受性和发酵产2,3-丁二醇和有机酸能力基本稳定。

获得2,3-丁二醇和有机酸的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种获得2,3-丁二醇和有机酸的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用木质纤维素水解液对前面所述的微生物进行发酵培养，以便获得2,3-丁二醇和有机酸。根据本发明实施例的微生物可以利用未经脱毒处理的木质纤维素水解液，对其中的抑制物具有高耐受性，同时，还可以高产2,3-丁二醇和有机酸。而且，该微生物稳定性良好，连续多次传代，抑制物耐受性和发酵产2,3-丁二醇和有机酸能力稳定。另外，将水解液进行常规脱毒会加大工艺成本，并且脱毒过程中使用的一些化学试剂无法回收利用，而直接使用未经脱毒处理的水解液进行发酵将大大降低2,3-丁二醇和有机酸的生产成本，具有较好的应用前景。

根据本发明的实施例，木质纤维素水解液是通过将木质纤维素原料进行酸处理且未经脱毒处理所获得的。木质纤维素经过酸处理后，会产生大量抑制微生物生长代谢的物质，例如糠醛类、单酚、多酚类化合物、可溶性木质素等。然而，经过脱毒处理虽然会降低抑制物含量，但是也会造成糖类物质的损失。本发明经过等离子体诱变处理所筛选获得的菌株M22对水解液中的抑制物具有高耐受性，因此无需进行水解液脱毒处理，从而为菌株M22生长代谢提供足量的碳源，使得菌株M22可以发酵产生大量2,3-丁二醇和有机酸。将水解液进行常规脱毒会加大工艺成本，并且脱毒过程中使用的一些化学试剂无法回收利用，而直接使用未经脱毒处理的水解液进行发酵将大大降低2,3-丁二醇和有机酸的生产成本，具有较好的应用前景。

根据本发明的实施例，木质纤维素水解液中含有下列至少之一的成分：5～8g/L的葡萄糖；50～55g/L的木糖；1～4g/L的低聚木糖；4～10g/L的阿拉伯糖；0.3～1.0g/L的甲酸；4～10g/L的乙酸；0.05～0.4g/L的5-羟甲基糠醛；0.4～1.5g/L的糠醛。该木质纤维素水解液中虽然含有大量糖类物质，但是同时也存在着抑制物，大多微生物是无法直接利用该水解液，而本发明的微生物M22具有抑制物高耐受性，可以直接利用该水解液进行发酵，并高产2,3-丁二醇和有机酸。

根据本发明的实施例，木质纤维素水解液是通过下列方式获得的：将木质纤维素原料在含有硫酸和磷酸的混合酸中进行水解处理，以便得到水解产物；以及将水解产物进行过滤处理，弃滤渣，以便得到木质纤维素水解液。由此，经过酸处理可以获得供微生物利用的糖类物质，但是，同时也会伴有抑制物生成，影响微生物生长代谢。

根据本发明的实施例，木质纤维素原料与混合酸的质量体积比为1：(1～5)，优选1:3。由此，以便充分将木质纤维素水解为糖类物质，同时，也尽量减少抑制物的产生。

根据本发明的实施例，混合酸中，硫酸与磷酸的质量比为(2～5)：1，优选3:1。由此，以便充分将木质纤维素水解为糖类物质，同时，也尽量减少抑制物的产生。

根据本发明的实施例，水解处理是在120～150℃下进行40～80分钟，优选是在130℃下进行60分钟。由此，以便充分将木质纤维素水解为糖类物质，同时，也尽量减少抑制物的产生。

根据本发明的实施例，木质纤维素中含有下列至少之一的成分：35～45g/L的纤维素；30～35g/L的半纤维素；10～22g/L的木质素。由此，经过酸水解处理可以获得大量糖类物质。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：在进行发酵培养之前，调节木质纤维素水解液的pH值至6.0～7.0。由此，以便为后续微生物发酵提供适宜pH值。

根据本发明的实施例，有机酸包括下列的至少之一：丁二酸、甲酸和乙酸。菌株M22在利用木质纤维素水解液发酵过程中除了高产2,3-丁二醇，还会产生副产物有机酸，主要包括丁二酸、甲酸和乙酸。

根据本发明的实施例，发酵培养是在30～40℃的温度、100～200rpm/min的转速以及0.2～0.6vvm的通气量下进行36～60小时。由此，在此条件下可以高产2,3-丁二醇和有机酸。

根据本发明的实施例，在发酵培养12小时和36小时时，分别向发酵液中加入终浓度为3～8g/L的碳酸氢钠溶液，当发酵终止时，发酵液中丁二酸、甲酸和乙酸的质量比为(3～5)：1：(5～7)。发明人发现，发酵过程中补加碳酸氢钠，促进丁二酸的形成，改变了有机酸的组成。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物所描述的特征和优点，同样适用于该获得2,3-丁二醇和有机酸的方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例所用培养基：

LB培养基：氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L(固体培养基加15g/L琼脂)。

初筛培养基：75％的玉米芯水解液，酵母浸粉1.5g/L，琼脂15g/L。

复筛培养基：100％玉米芯水解液，酵母浸粉1.5g/L，琼脂15g/L。

种子培养基：木糖30g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 4.4g/L，KH₂PO₄ 1.3g/L，酵母浸粉1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，微量元素1mL/L，FeSO₄溶液2mL/L(FeSO₄·7H₂O 5g/L，HCl4mL/L)。

其中微量元素组成：ZnCl₂ 70mg/L，MnCl₂·4H₂O 0.1g/L，H₃BO₃ 60mg/L，CoCl₂·2H₂O 0.2g/L，CuCl₂·2H₂O 20mg/L，NiCl₂·6H₂O 25mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 35mg/L，HCl0.9mL/L。

发酵培养基：玉米芯水解液，酵母浸粉浓度为1.5g/L。

实施例1玉米芯水解液及筛选培养基的制备

玉米芯用粉碎机粉碎，固体颗粒粒径为40～60目，玉米芯三种主要组分含量如表1所示。玉米芯用含硫酸和磷酸的混合酸进行水解，硫酸和磷酸的质量分数分别为1.5％和0.5％。称20g玉米芯于500ml锥形瓶中，以固液比为1：3加入混合酸60ml，用锡箔纸封口防止水分损失，在高压蒸汽灭菌锅中用130℃处理60min。抽滤得到滤液，抽滤过程中用40ml热蒸馏水(65℃)洗涤以便得到更多的糖。上述得到的滤液用氢氧化钠调节pH至5.0，进一步用氨水调节pH至6.5，得到玉米芯水解液。水解液中各组分浓度见表2。

表1玉米芯各组分含量

表2玉米芯水解液各物质浓度

组分	葡萄糖	木糖	低聚木糖	阿拉伯糖	甲酸	乙酸	HMF	糠醛
									浓度(g/L)	6.66	52.79	2.26	8.12	0.76	7.26	0.24	0.89

实施例2等离子体诱变以及筛选

用接种环从甘油管蘸取少量菌液划线于LB固体培养基，在30℃培养箱培养14～16h，挑取单菌落转接于LB液体培养基(250ml锥形瓶装液量50ml)，在30℃摇床150rpm培养6～8h，每1h取样测OD，取对数生长期的菌液(OD≈1)，用移液枪取10μl菌液滴于圆型不锈钢铁片中央，将不锈钢铁片置于工作室中，以氦气为工作气，电源功率为120W，等离子体分别处理0s、60s、120s、180s、240s、300s、360s，处理后将带有菌体的不锈钢铁片放于装有1mlLB培养基的1.5ml EP管中，用涡旋振荡器振荡，使菌体充分洗脱，于30℃摇床150rpm复苏2h。取100μl涂布于初筛培养基(浓度为75％的玉米芯水解液)，在30℃培养24h，进行菌落计数。

结果表明，诱变时间为0s、60s、120s、180s、240s、300s、360s时，长出的菌落数分别为36、0、4、193、18、10、1。由此可得，180s为最佳诱变时间，选取在此诱变时间下得到的193株菌株进一步筛选。

将初筛得到的193株菌株接种到装有10ml LB液体培养基的试管中，于30℃摇床150rpm培养14～16h，划线接种于复筛培养基中，在30℃培养24h，观察生长情况，193株菌中仅有23株可以在复筛培养基上生长。

实施例3利用玉米芯水解液发酵生产2,3-BDO和有机酸

表3为初始菌株的发酵情况，其在100％的玉米芯水解液中无法生长，经过对水解液进行一定倍数的稀释后，菌株可以生长，但是培养基中糖浓度经稀释而有所下降，导致最终的产率较低。

将复筛得到的23株菌接种于种子培养基中(250ml锥形瓶装液量50ml)，30℃摇床150rpm培养14～16h，按10％接种量接种到发酵培养基中(250ml锥形瓶装液量50ml)，在35℃摇床150rpm发酵48h，液相色谱检测各组分含量。23株菌分别都保存于甘油管作为第一代菌株。

如表4所示，23株菌在100％玉米芯水解液中发酵时，部分菌株无法生长或仅有微量生长，无法正常发酵生产2,3-BDO。有10株菌可以稳定生长并发酵生产2,3-BDO和有机酸，总糖利用率可达85％以上，2,3-丁二醇产量为15g/L左右，有机酸总产量达10g/L以上(表3)。

表3初始菌株在不同浓度水解液中的发酵情况

表4第一代菌株利用玉米芯水解液为原料发酵生产2,3-丁二醇

实施例4稳定性研究

将实施例3中筛选得到的10株菌从甘油管中转接到种子培养基中活化，再次保存甘油管作为第二代菌株，重复玉米芯水解液发酵实验。再次重复上述操作，获得第三代和第四代菌株。对比连续三次发酵结果，考察菌株的稳定性，发酵结果见表5～7。经过连续三次发酵，仅仅只有E.cloacae M22可以在不脱毒的玉米芯水解液中稳定的生长并发酵生产2,3-BDO和有机酸，总糖利用率可达88.69％，2,3-BDO和有机酸产量分别为24.32g/L和14.93g/L。

表5第二代菌株利用玉米芯水解液为原料发酵

表6第三代菌株利用玉米芯水解液为原料发酵

表7第四代菌株利用玉米芯水解液为原料发酵

实施例5E.cloacae M22以玉米芯水解液为底物发酵生产2,3-丁二醇和有机酸

将E.cloacae M22从甘油管中转接到种子培养基中活化，按照10v/v％接种量接种到发酵培养基中(2L发酵罐装液量1L)，发酵条件为30℃，200转/min，通气量0.4vvm。发酵过程中用4M NaOH调节pH为6.5，在12h和36h分别加入终浓度5g/L的NaHCO₃。发酵过程中各组分含量如图1所示。2,3-丁二醇和有机酸产量分别为23.2g/L和19.93g/L，其中丁二酸、甲酸和乙酸的比例为4.29:1:6.37。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种微生物，其为阴沟肠杆菌M22，于2019年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17265。

2.一种获得2,3-丁二醇和有机酸的方法，其特征在于，包括：

利用木质纤维素水解液对权利要求1所述的微生物进行发酵培养，以便获得2,3-丁二醇和有机酸；

所述木质纤维素中含有：35～45g/L的纤维素、30～35g/L的半纤维素和10～22g/L的木质素；

所述木质纤维素水解液是通过将木质纤维素原料进行酸处理且未经脱毒处理所获得的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素水解液中含有：

5～8g/L的葡萄糖；

50～55g/L的木糖；

1～4g/L的低聚木糖；

4～10g/L的阿拉伯糖；

0.3～1.0g/L的甲酸；

4～10g/L的乙酸；

0.05～0.4g/L的5-羟甲基糠醛；和

0.4～1.5g/L的糠醛。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素水解液是通过下列方式获得的：

将木质纤维素原料在含有硫酸和磷酸的混合酸中进行水解处理，以便得到水解产物；以及

将所述水解产物进行过滤处理，弃滤渣，以便得到所述木质纤维素水解液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料与所述混合酸的质量体积比为1：(1～5)。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合酸中，硫酸与磷酸的质量比为(2～5)：1。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合酸中，硫酸与磷酸的质量比为3:1。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水解处理是在120～150℃下进行40～80分钟。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水解处理是在130℃下进行60分钟。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料与所述混合酸的质量体积比为1:3。

11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：

在进行所述发酵培养之前，调节所述木质纤维素水解液的pH值至6.0～7.0。

12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机酸包括下列的至少之一：丁二酸、甲酸和乙酸。

13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是在30～40℃的温度、100～200rpm的转速以及0.2～0.6vvm的通气量下进行36～60小时。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养12小时和36小时时，分别向发酵液中加入终浓度为3～8g/L的碳酸氢钠，

当发酵终止时，发酵液中丁二酸、甲酸和乙酸的质量比为(3～5)：1：(5～7)。