CN103270046A - 治疗b型血友病的方法和组合物 - Google Patents

治疗b型血友病的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN103270046A
CN103270046A CN2011800599116A CN201180059911A CN103270046A CN 103270046 A CN103270046 A CN 103270046A CN 2011800599116 A CN2011800599116 A CN 2011800599116A CN 201180059911 A CN201180059911 A CN 201180059911A CN 103270046 A CN103270046 A CN 103270046A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
sequence
gene
dna
donor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800599116A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103270046B (zh
Inventor
P·D·格雷戈里
K·A·海
M·C·霍尔姆斯
H·李
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Sangamo Therapeutics Inc
Original Assignee
Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Sangamo Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Hospital of Philadelphia CHOP, Sangamo Biosciences Inc filed Critical Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Publication of CN103270046A publication Critical patent/CN103270046A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103270046B publication Critical patent/CN103270046B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21002—Chymotrypsin C (3.4.21.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N2005/0658—Radiation therapy using light characterised by the wavelength of light used
    • A61N2005/0661—Radiation therapy using light characterised by the wavelength of light used ultraviolet

Abstract

本文公开了用于将IX因子（FIX）序列插入细胞基因组以治疗B型血友病的方法和组合物。

Description

治疗B型血友病的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年10月12日提交的美国临时申请第61/392,333号的权益，其公开内容在此通过引用全文纳入。
关于在联邦政府资助研究下完成发明的权利声明
不适用。
技术领域
本公开处于基因修饰和治疗血友病的领域。
背景技术
B型血友病是凝血系统遗传病，表征为关节和软组织内出血以及经历创伤或接受手术的任何位点内失血过多。尽管B型血友病与A型血友病在临床上无法区分，B型血友病患者中VIII因子（FVIII）不足或缺失。IX因子编码参与凝血系统的丝氨酸蛋白酶之一，已显示恢复甚至3%正常循环水平的野生型IX因子蛋白能防止自发性出血。
已就治疗B型血友病描述了包括肝定向基因治疗方案和直接肌肉注射在内的基因治疗，所述治疗涉及引入编码功能性FIX蛋白的质粒和其他载体（如AAV）。参见例如美国专利第6,936,243号;Lee等.(2004)Pharm.Res.7:1229-1232;Graham等.(2008)Genet Vaccines Ther.3:6-9。然而，这些方案中，形成抑制性抗IX因子（抗FIX）抗体和针对递送载体的抗体仍是基于FIX蛋白取代的B型血友病治疗的主要并发症。
美国专利申请第12/798,749号描述了将功能性FIX蛋白靶向整合入分离干细胞和通过将生成FIX的干细胞引入需要治疗的患者来治疗B型血友病。
然而，仍需要在患有B型血友病的对象中治疗此疾病的其它组合物和方法。
发明内容
本文公开了用于靶向整合编码功能性FIX蛋白的序列以治疗B型血友病的方法和组合物。所述方法特定涉及给予介导功能性FIX蛋白编码序列靶向插入细胞基因组的核酸酶以缓解疾病。
一方面，本文描述结合基因组感兴趣区域（如IX因子基因）靶位点的DNA结合域（如锌指蛋白（ZFP）或TALE蛋白），其中所述ZFP包含一个或多个改造的锌指结合域且所述TALE包含一个或多个改造的TALE DNA结合域。在一个实施方式中，所述DNA结合域是核酸酶，例如ZFP是锌指核酸酶（ZFN）且TALE是切割感兴趣靶基因组区域的TALE核酸酶（TALEN），其中ZFN或TALEN包含一个或多个改造的DNA结合域和核酸酶切割结构域或切割半结构域。例如，可从多种限制性核酸内切酶和/或归巢核酸内切酶获得切割结构域和切割半结构域。在一个实施方式中，所述切割半结构域源自IIS型限制性核酸内切酶（如Fok I）。在某些实施方式中，锌指结构域识别内源FIX基因中的靶位点，例如表1所示锌指结构域（或结合表1所示靶位点的锌指结构域）。
另一方面，本文描述编码一种或多种本文所述ZFN和/或TALEN的多核苷酸。所述多核苷酸可以是例如mRNA。
另一方面，本文描述包含多核苷酸的ZFN和/或TALEN表达载体，所述多核苷酸编码一种或多种本文所述ZFN和/或TALEN，且可操作连接于启动子。在一个实施方式中，所述表达载体是病毒载体。一方面，所述病毒载体显示组织特异嗜性。
另一方面，本文描述包含一种或多种ZFN和/或TALEN表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可用一种或多种ZFN或TALEN表达载体稳定转化或瞬时转染或采用其组合。在一个实施方式中，所述宿主细胞是胚胎干细胞。在其他实施方式中，所述一种或多种ZFN和/或TALEN表达载体在宿主细胞中表达一种或多种ZFN和/或TALEN。在另一个实施方式中，所述宿主细胞还可包含外源多核苷酸供体序列。在本文所述任意实施方式中，所述宿主细胞能包含肝细胞、肌肉细胞、干细胞或胚细胞。所述细胞可来自任何生物体，例如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、猫、狗或其他哺乳动物细胞。
另一方面，本文提供治疗B型血友病的方法，使用核酸酶以在需要对象的细胞中整合编码FIX蛋白的序列。在某些实施方式中，FIX编码序列用病毒载体、非病毒载体（如质粒）和/或其组合递送。在某些实施方式中，所述载体包含AAV载体，如AAV8。在某些实施方式中，所述核酸酶和/或FIX编码序列通过静脉内（如门静脉内）给予而递送到正常动物肝内。
在本文所述任何方法中，所述核酸酶可以是一种或多种锌指核酸酶、一种或多种归巢核酸内切酶（大范围核酸酶）和/或一种或多种TAL效应结构域核酸内切酶（“TALEN”）。本文所述的核酸酶（如ZFN和/或TALEN）可结合和/或切割基因内或与之毗邻的编码或非编码区中的感兴趣区域，例如前导序列、尾随序列或内含子、或在编码区上游或下游的非转录区内。在某些实施方式中，ZFN结合和/或切割内源IX因子基因（突变或野生型）。在其他实施方式中，ZFN和/或TALEN结合和/或切割安全港基因（如破坏其对细胞无毒或无破坏性的任何基因），例如CCR5基因、PPP1R12C（也称为AAV S1）基因或Rosa基因。参见例如美国专利公开号20080299580;20080159996和201000218264。
此外，本文所述任何方法还可包含其他步骤，包括部分肝切除术或用提高转导和/或诱导肝细胞经历细胞周期的第二试剂处理。第二试剂示例包括伽马辐照、紫外辐照、氚化核苷酸如胸苷、顺铂、依托泊苷、羟基脲、阿非迪霉素、泼尼松龙、四氯化碳和/或腺病毒。
本文所述方法能体外、离体或体内实施。在某些实施方式中，将所述组合物引入活的正常哺乳动物。所述哺乳动物在递送时可处于任何发育阶段，如胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、青少年或成年。另外，靶细胞可以是健康或患病的。在某些实施方式中，例如通过门静脉注射将所述组合物（如编码核酸酶和/或FIX编码序列的多核苷酸）递送给活动物的肝。在其他实施方式中，一种或多种组合物通过静脉内（非门静脉，例如尾静脉注射）、动脉内、腹膜内递送到肝实质（如经注射）、肝动脉（如经注射），和/或通过胆管树（如经注射）。
为了将组合物靶向特定细胞类型如肝细胞，一种或多种给予的组合物可与特异性结合细胞表面受体的归巢剂相连。例如，所述载体可偶联配体（如半乳糖），某些肝系统细胞就所述配体有受体。结合可以是共价的，如交联剂例如戊二醛，或是非共价的，如抗生物素蛋白化配体与生物素化载体的结合。共价结合的另一形式通过改造用于制备载体库的AAV辅助质粒来提供，从而一种或多种所编码外壳蛋白是天然AAV外壳蛋白和肽或蛋白配体的杂合物，使得所述配体在病毒颗粒表面上暴露。
所述靶细胞可以是人细胞，或其他哺乳动物（包括兽医学动物）细胞，特别是非人灵长类动物和以下目的哺乳动物：啮齿目（Rodenta）（小鼠、大鼠、仓鼠）、兔形目（Lagomorpha）（兔）、食肉目（Carnivora）（猫、狗）、和偶蹄目（Arteriodactyla）（母牛、猪、绵羊、山羊、马）。在一些方面，所述靶细胞包含组织（如肝）。在一些方面，所述靶细胞是干细胞（如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝干细胞等）或通过本文所述方法得到的动物胚胎，然后移植所述胚胎从而活动物出生。然后所述动物生长到性成熟并能繁衍后代，其中至少一些后代包含基因组修饰。
根据作为整体的本公开，这些和其他方面对技术人员显而易见。因此，本公开包括下列实施方式：
1.一种含有经改造锌指蛋白DNA结合域的蛋白，其中所述DNA结合域包含4或5个锌指识别区，所述锌指识别区从N末端到C末端排序为F1-F4或F1-F5，且其中
(i)当所述DNA结合域包含5个锌指识别区时，F1-F5包含下列氨基酸序列：
F1:QSGDLTR(SEQ ID NO:4)
F2:RSDVLSE(SEQ ID NO:5)
F3:DRSNRIK(SEQ ID NO:6)
F4:RSDNLSE(SEQ ID NO:7)
F5:QNATRIN(SEQ ID NO:8);
(ii)当所述DNA结合域包含4个锌指识别区时，F1-F4包含下列氨基酸序列：
F1:RSDSLSV(SEQ ID NO:10)
F2:TSGHLSR(SEQ ID NO:11)
F3:RSDHLSQ(SEQ ID NO:12)
F4:HASTRHC(SEQ ID NO:13)。
2.如1所述的蛋白，所述蛋白还包含切割结构域或切割半结构域。
3.如2所述的蛋白，其中所述切割半结构域是野生型或经改造FokI切割半结构域。
4.一种编码1-3中任一项所述蛋白的多核苷酸。
5.一种包含4所述多核苷酸的基因递送载体。
6.一种包含1-3中任一项所述蛋白或4所述多核苷酸的分离细胞。
7.一种包含1-3中任一项所述蛋白或4所述多核苷酸的分离细胞。
8.一种治疗对象B型血友病的方法，所述方法包含使用至少一种核酸酶将编码功能性IX因子（FIX）蛋白的序列整合入（如通过靶向整合）细胞基因组，其中所述对象包含所述细胞。
9.如8所述的方法，其中所述序列整合入内源基因。
10.如9所述的方法，其中所述内源基因选自FIX基因和安全港基因。
11.如8-10中任一项所述的方法，其中所述序列和/或核酸酶用选自病毒载体、非病毒载体和其组合的载体递送至细胞。
12.如8-10中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞且所述序列通过静脉内给予（如到肝中）来递送给正常动物的细胞。
13.如8-12中任一项所述的方法，其中所述至少一种核酸酶是锌指核酸酶、TALEN或归巢核酸内切酶。
14.如8-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包含对对象实施部分肝切除术的步骤。
15.如8-14中任一项所述的方法，其中所述方法还包含用至少一种第二试剂处理对象的步骤。
16.如15所述的方法，其中所述第二试剂选自伽马辐照、紫外辐照、氚化核苷酸、顺铂、泼尼松龙、四氯化碳、依托泊苷、羟基脲、阿非迪霉素、腺病毒和其组合。
17.如8-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是分离细胞且所述方法还包含将分离细胞给予所述对象。
18.如8-17中任一项所述的方法，其中所述对象选自胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、青少年或成年。
19.如8-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包含将所述序列与特异性结合细胞表面受体的归巢剂相连。
20.如19所述的方法，其中所述归巢剂包含半乳糖或AAV外壳蛋白与半乳糖的杂合物。
21.如8-20中任一项所述的方法，其中所述方法还包含将编码至少一种核酸酶的序列与特异性结合细胞表面受体的归巢剂相连。
22.如21所述的方法，其中所述归巢剂包含半乳糖或AAV外壳蛋白与半乳糖的杂合物。
23.如8-22中任一项所述的方法，其中所述细胞选自人细胞、非人细胞、啮齿类细胞、兔类细胞、食肉类细胞和偶蹄类细胞。
24.如8-22中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是干细胞。
25.如24所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、肝细胞或肝干细胞。
26.如8-25中任一项所述的方法，其中所述核酸酶包含1-3中任一项所述的锌指核酸酶、4所述的多核苷酸或5所述的基因递送载剂。
附图简要说明
图1的A-E图显示N2ZFN有效切割编码IX因子(F9)内含子1的基因并诱导人细胞中的同源重组。图1A的示意图描述人F9基因的内含子1中N2 ZFN对的靶标。图1B描述双顺反子经FLAG标记的ZFN表达质粒。图1C显示N2 ZFN表达质粒转染到K562细胞后，有
Figure BDA00003339536400061
错配试验（环球基因公司（Transgenomics）,“Cel-I”）结果的凝胶。所述试验显示转染后第3天hF9基因的内含子1处N2 ZFN所诱导DSB的NHEJ修复结果。ZFN表达通过α-FLAG免疫印迹确认且蛋白加载用α-NFkB p65抗体评价。图1D显示靶向整合（TI）试验的示意图，有ZFN介导的将NheI限制性位点标签靶向hF9基因的详细时程。图1E所示凝胶描述ZFN表达质粒与增加量的NheI标签供体质粒（0-4μg）共转染后的RFLP试验结果。数据显示第3天和转染后10天的基因靶向水平增加，而单独转染NheI标签供体（4μg,‘(-)ZFN’）不产生可检测的基因靶向。黑色箭头表示在第3和第10天从TI产生的NheI敏感性切割产物。TI PCR用32P-标记核苷酸通过PCR进行，条带强度由感光成像仪定量。ZFN表达通过α-FLAG免疫印迹确认且蛋白加载用α-NFkB p65抗体评价。
图2的A-E图显示AAV介导的N2 ZFN递送到小鼠（包括N2“起降场（landingpad）”(LP)）产生有效的起降场(LP)内含子1切割。图2A所述图表显示N2 ZFN如何靶向人F9小基因(LP)的内含子1，其模拟已公开的致HB突变（Thompson等,(1994)Hum.Genet.94:299-302）。图2B显示来自PCR分析的凝胶，证明LP构建体已敲入小鼠ROSA26基因座。图2C显示检测循环血浆hFIX的ELISA结果。数据显示LP小鼠不具有循环血浆hFIX，如用hFIX特异性ELISA所测，除非小鼠注射有表达hFIX的病毒载体（经尾静脉注射的1e10病毒基因组(v.g.)AAV-hFIX）。图2D描述双顺反子AAV8-N2 ZFN表达载体，表达由ApoE增强子和人α1-抗胰蛋白酶启动子控制。图2E显示在LP小鼠中尾静脉注射1e11v.g.AAV-N2表达载体后进行的Cel-I试验结果，注射后第7天于肝DNA内产生LP内含子1的切割。Cel-I试验用32P-标记核苷酸通过PCR扩增子进行，条带强度由感光成像仪定量。ZFN表达通过全肝裂解物的α-FLAG免疫印迹确认且蛋白加载用α-NFkB p65抗体评价。
图3的A和B图显示N2ZFN促进AAV介导的野生型F9外显子2-8体内靶向起降场内含子1。图3A的示意图显示LP基因突变如何能通过内含子1中hF9外显子2-8的TI来绕开。已靶向和未靶向的LP等位基因能用引物P1、P2和P3通过PCR区分。图3B描述用引物对P1/P2和P1/P3的PCR分析的凝胶，显示LP/HB小鼠在生命第2天I.P.共注射5e10v.g.AAV8-N2和2.5e11v.g.AAV8-供体后基因靶向成功，但不注射单独5e10v.g.AAV8-N2或共注射5e10v.g.AAV8-Mock和2.5e11v.g.AAV8-供体。PCR用32P-标记核苷酸进行，能通过感光成像仪定量产物条带强度以评价靶向频率。在已靶向样品中，引物P1和P2会产生更小的产物，表明已靶向野生型F9外显子2-8成功扩增，而引物P1和P3产生的产物大于未靶向的等位基因。
图4的A-F图显示体内肝基因校正产生治疗水平的循环FIX。图4A显示LP小鼠在生命第2天I.P.注射单独5e10v.g.AAV-N2（n=7，在部分肝切除术(PHx)之前和之后）、5e10v.g.AAV-N2和2.5e11v.g.AAV-供体（n=7，PHx之前和之后）、或5e10v.g.AAV-Mock和2.5e11v.g.AAV-供体（n=6，PHx之前和之后）后的血浆hFIX水平。PHx的定时由箭头指示。误差棒表示标准误差。图4B显示有后续PHx的尾静脉注射1e12v.g.AAV-hFIX（主要为游离型）后野生型小鼠（n=5）的血浆hFIX水平。误差棒表示标准误差。图4C显示野生型小鼠在生命第2天I.P.注射单独5e10v.g.AAV-N2（n=PHx前的8，n=PHx后的4）、5e10v.g.AAV-N2和2.5e11v.g.AAV-供体（n=PHx前的9，n=PHx后的5）、或5e10v.g.AAV-Mock和2.5e11v.g.AAV-供体（n=PHx前的6，n=PHx后的5）后的血浆hFIX水平。误差棒表示标准误差。图4D是LP/HB小鼠在生命第2天腹膜内（I.P.）注射单独5e10v.g.AAV-N2（n=PHx前的10，n=PHx后的1）、5e10v.g.AAV-N2和2.5e11v.g.AAV-供体（n=PHx前的9，n=PHx后的5）、或5e10v.g.AAV-Mock和2.5e11v.g.AAV-供体（n=PHx前的9，n=PHx后的3）后的血浆hFIX水平。误差棒表示标准误差。图4E显示证明hFIX RNA的肝特异性表达的凝胶，如在生命第2天接受I.P.注射5e10v.g.AAV-N2和2.5e11v.g.AAV-供体的LP/HB小鼠于生命第20周进行RT-PCR所检测。图4F显示时间与血块形成，如在生命第2天接受LP注射5e10v.g.AAV-N2和2.5e11v.g.AAV-供体（n=5）、或5e10v.g.AAV-Mock和2.5e11v.g.AAV-供体（n=3）（来自双尾学生t检验的p值）的小鼠于生命第14周进行活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验所测定。显示野生型（WT）和B型血友病（HB）小鼠的aPTT以用于比较。
图5的A和B图显示体内肝基因校正产生治疗水平的循环FIX表达。图5A显示成年LP小鼠在6周龄I.V.注射1e11v.g./小鼠的单独AAV-N2(‘单独ZFN’)、1e11v.g./小鼠的AAV-N2和5.5e11v.g./小鼠的AAV-供体(‘ZFN+供体’)、或1e11v.g./小鼠的AAV-Mock和5.5e11v.g.AAV-供体(‘Mock+供体’)后的血浆hFIX水平。所示数据代表每组约20只小鼠的3次实验。这些实验中，野生型hF.IX水平约为1000ng/mL。图5B显示成年LP小鼠在6周龄I.V.注射1e11v.g./小鼠的单独AAV-N2(‘ZFN单独’)、1e11v.g./小鼠的AAV-N2和5.5e11v.g./小鼠的AAV-供体(‘ZFN+供体’)、或1e11v.g./小鼠的AAV-Mock和5.5e11v.g.AAV-供体(‘Mock+供体’)后的血浆hFIX水平。注射后2天，对图5B中的组给予部分肝切除术。所示数据代表每组约20只小鼠的3次实验。这些实验中，野生型hF.IX水平约为1000ng/mL。数据显示在有或没有后继部分肝切除术情况下给予成年小鼠时，hF.IX表达稳定，以及能在成年动物中进行基因组编辑。
发明详述
本文公开治疗B型血友病患者的组合物和方法。核酸酶介导的靶向整合特定用于将FIX编码序列插入一种或多种对象细胞的基因组（体内或离体），从而所述细胞体内生成FIX。在某些实施方式中，所述方法还包含诱导对象的细胞特别是肝细胞的增殖（进入细胞周期），例如通过部分肝切除术和/或给予诱导肝细胞经历细胞周期的一种或多种化合物。对象包括但不限于人、非人灵长类动物、兽医学动物如猫、狗、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、母牛、猪、马、山羊等。
本文所述方法能治疗B型血友病。不同于用大范围核酸酶的核酸酶介导基因校正的体内模型（参见Gouble等,(2006)J Gene Med.May;8(5):616-22）中的前述方法，在所述动物模型中核酸酶介导的FIX基因整合后观察到很少或没有毒性。另外，本发明的方法和组合物在新生儿和成年动物中有功能，引起所插入IX因子转基因的功能活性。
概述
除非另有说明，本文所公开的方法实施以及组合物的制备和应用采用本领域技术范围内的分子生物学、生化、染色质结构和分析、计算机化学、细胞培养、重组DNA和相关领域的常规技术。这些技术在文献中已有充分解释。参见例如Sambrook等.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL（《分子克隆：实验室手册》）,第2版,冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）,1989和第3版,2001;Ausubel等.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY（《新编分子生物学实验指南》）,纽约的约翰威利父子出版公司（JohnWiley和Sons）,1987且定期更新;the series METHODS IN ENZYMOLOGY（《酶学方法》系列）,圣地亚哥的学术出版社（Academic Press）;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION（《染色质结构和功能》）,第3版,圣地亚哥的学术出版社,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY（《酶学方法》）,卷304,“Chromatin（《染色质》）”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编),圣地亚哥的学术出版社,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（《分子生物学方法》）,卷119,“Chromatin Protocols（《染色质操作方案》）”(P.B.Becker编)托托瓦的胡马纳出版社（Humana Press）,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，指采用线形或环形构象以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开目的，这些术语不对聚合物长度方面构成限制。所述术语能包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分（如硫代磷酸主干）中修饰的核苷酸。一般，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性，如A的类似物会与T配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。所述术语还应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应天然产生氨基酸的化学类似物或经修饰衍生物。
“结合”指大分子间（例如蛋白和核酸间）的序列特异性、非共价相互作用。并非所有结合相互作用组分必需是序列特异性（如与DNA主链的磷酸残基接触），只要所述相互作用整体上为序列特异性。所述相互作用的一般特征为10-6M-1或更低的解离常数（Kd）。“亲和性”指结合强度:增加的结合亲和性与较低Kd相关。
“结合蛋白”是能非共价结合另一分子的蛋白。结合蛋白能结合例如DNA分子（DNA结合蛋白）、RNA分子（RNA结合蛋白）和/或蛋白分子（蛋白结合蛋白）。在蛋白结合蛋白的情况中，其能自身结合（以形成同二聚体、同三聚体等）和/或其能结合一种或多种不同蛋白的一个或多个分子。结合蛋白可具有一种以上的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”（或结合域）是蛋白、或较大蛋白内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是其结构通过锌离子配位稳定的结合域内的氨基酸序列区域。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。
“TALE DNA结合域”或“TALE”是含有一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。所述重复结构域参与TALE和其关联靶DNA序列的结合。单个“重复单元”（也称为“重复”）通常为33-35个氨基酸长度，并显示至少与天然所产生TALE蛋白内其他TALE重复序列的一些序列同源性。
锌指和TALE结合域能“改造”成结合预定核苷酸序列，例如通过工程改造（改变一个或多个氨基酸）天然产生的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区。因此，改造的DNA结合域（锌指或TALE）是非天然产生的蛋白。工程改造DNA结合域的方法的非限制性示例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是天然不产生的蛋白，其设计/组成主要来自合理标准。设计的合理标准包括应用取代规则和在保存现有ZFP和/或TALE设计及结合数据的数据库中加工信息的计算机算法。参见例如美国专利6,140,081;6,453,242;和6,534,261；还参见WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO02/016536和WO03/016496以及美国申请第13/068,735号。
“选定”锌指蛋白或TALE是天然未发现的蛋白，其生成主要来自经验方法如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交体选择。参见例如US5,789,538;US5,925,523;US6,007,988;US6,013,453;US6,200,759;WO95/19431;WO96/06166;WO98/53057;WO98/54311;WO00/27878;WO01/60970WO01/88197和WO02/099084。
“重组”指在2种多核苷酸间交换遗传信息的方法，包括但不限于通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组的供体捕获。为了本公开目的，“同源重组(HR)”指特定形式的交换，所述交换在例如细胞双链断裂修复中通过同源定向修复机制发生。此方法需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子作为模板修复“靶”分子（即发生双链断裂的分子），被不同地称为“非交叉基因转换”或“短道基因转换（shorttract gene conversion）”，因为其引起遗传信息从供体转移到靶标。不希望受任何具体理论约束，所述转移能包括错配校正断裂靶标与供体间形成的异源双链DNA、和/或“合成依赖性链退火”，其中供体用于重新合成会成为靶标一部分的遗传信息、和/或相关过程。所述特定HR通常引起靶分子的序列改变，从而部分或所有供体多核苷酸序列纳入靶多核苷酸中。
在本公开的方法中，一种或多种本文所述靶核酸酶在靶序列（如细胞染色质）的预定位点产生双链断裂，与断裂区中核苷酸序列有同源性的“供体”多核苷酸能引入细胞中。存在双链断裂显示促进供体序列的整合。所述供体序列可物理整合，或所述供体多核苷酸用作模板经同源重组修复断裂，从而随着供体将所有或部分核苷酸序列引入细胞染色质。因此，细胞染色质的第一序列可改变，且在某些实施方式中，可转变成供体多核苷酸中出现的序列。因此，使用术语“取代”或“替代”可理解为表示一个核苷酸被另一个取代（即在信息意义上取代序列），且不必定要求一个多核苷酸被另一个物理或化学取代。
在本文所述的任何方法中，其他锌指蛋白或TALEN对能用于细胞内其他靶位点的额外双链切割。
在靶向重组和/或取代和/或改变细胞染色质中感兴趣区域序列的方法的某些实施方式中，染色体序列通过与外源“供体”核苷酸序列同源重组来改变。如果存在与断裂区同源的序列，所述同源重组通过细胞染色质中出现双链断裂来刺激。
在本文所述的任何方法中，第一核苷酸序列（“供体序列”）能包含与感兴趣区域的基因组序列同源但不相同的序列，从而刺激同源重组以在感兴趣区域中插入不同序列。因此，在某些实施方式中，与感兴趣区域序列同源的供体序列部分显示与所取代基因组序列约80-99%（或其间任何整数）的序列相同性。在其他实施方式中，例如若在100个连续碱基对上供体与基因组序列之间仅差异1个核苷酸，供体和基因组序列间的同源性高于99%。某些情况下，供体序列的非同源部分能包含感兴趣区域中不存在的序列，从而将新序列引入感兴趣区域。这些情况下，所述非同源序列一般侧接有50-1,000个碱基对（或其间任何整数）或大于1,000的任何碱基对数目的序列，所述序列与感兴趣区域的序列同源或相同。在其他实施方式中，供体序列与第一序列不同源，并通过非同源重组机制插入基因组。
通过破坏感兴趣基因表达的靶向整合供体序列，本文所述的任何方法能用于部分或完全灭活细胞中的一种或多种靶序列。还提供有部分或完全失活基因的细胞系。
此外，本文所述的靶向整合方法还能用于整合一种或多种外源序列。所述外源核酸序列可包含例如一个或多个基因或cDNA分子，或任何类型的编码或非编码序列，以及一个或多个控制元件（如启动子）。另外，所述外源核酸序列可生成一个或多个RNA分子（如小发夹RNA(shRNA)、抑制RNA(RNAi)、微小RNA(miRNA)等）。
“切割”指DNA分子的共价主链断裂。切割能通过多种方法起始，所述方法包括但不限于酶或化学水解a磷酸二酯键。单链切割和双链切割都有可能，双链切割可由2个不同单链切割事件引起。DNA切割能产生钝末端或交错末端。在某些实施方式中，融合多肽用于靶向双链DNA切割。
“切割半结构域”是某一多肽序列，所述多肽序列连接第二多肽形成有切割活性（优选双链切割活性）的复合物。术语“第一和第二切割半结构域”、“+和–切割半结构域”和“右和左切割半结构域”可互换使用，指二聚化的切割半结构域对。
“改造的切割半结构域”是经修饰以和另一切割半结构域（如另一改造的切割半结构域）形成专性异二聚体的切割半结构域。还参见美国专利公开号2005/0064474、20070218528和2008/0131962，所述专利通过引用全文纳入本文。
术语“序列”指任何长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线形、环形或分支且可以是单链或双链。术语“供体序列”指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度，例如2-10,000个核苷酸长度（或者其间或之上的任何整数值），优选约100-1,000个核苷酸长度（或其间的任何整数），更优选约200-500个核苷酸长度。
“染色质”是含有细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸和蛋白，所述核酸主要是DNA，所述蛋白包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大部分真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体的核包含约150个DNA碱基对，所述DNA与含2种各组蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚体相连；且接头DNA（根据生物体具有不同长度）在核小体的核之间延伸。组蛋白H1的分子一般与接头DNA相连。为了本公开目的，术语“染色质”意在涵盖所有类型的细胞核蛋白，包括原核和真核。细胞染色质包括染色体和附加型染色质。
“染色体”是含有所有或部分细胞基因组的染色质复合物。细胞基因组通常以其核型为特征，核型是包含细胞基因组的所有染色体集合。细胞基因组能包含一种或多种染色体。
“附加体”是复制核酸、核蛋白复合物或所含核酸不是细胞染色体核型一部分的其他结构。附加体示例包括质粒和某些病毒基因组。
“靶位点”或“靶序列”是某一核酸序列，只要存在充足的结合条件，其定义会与结合分子结合的核酸部分。
“外源”分子是通常不存在于细胞中，但能通过一种或多种遗传、生化或其他方法引入细胞的分子。“通常存在于细胞中”根据特定发育阶段和细胞环境条件确定。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子是相对于成体肌肉细胞的外源分子。类似地，由热激诱导的分子是相对于非热激细胞的外源分子。例如，外源分子能包含不正常内源分子的功能形式或正常功能内源分子的不正常形式。
外源分子可以是小分子如通过组合化学方法产生，或大分子如蛋白、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物、含有一个或多个上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是线形、分支或环形；可具有任何长度。核酸包括能形成双链体的那些以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰基转移酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。
外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，如外源蛋白或核酸。例如，外源核酸能包含引入细胞的感染病毒基因组、质粒或附加体，或通常不存在于细胞的染色体。将外源分子引入细胞的方法为本领域技术人员已知，包括但不限于脂质介导的转移（即脂质体，包括中性和阳离子脂质）、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转移和病毒载体介导的转移。外源分子还可以是与内源分子相同类型的分子，但源自与细胞衍生不同的种类。例如，人核酸序列可引入初始源自小鼠或仓鼠的细胞系。
相反，“内源”分子是在特定环境条件下通常存在于特定发育阶段的特定细胞中的分子。例如，内源核酸能包含染色体，线粒体、叶绿体或其他器官的基因组，或天然产生的附加型核酸。其他内源分子可包括蛋白，例如转录因子和酶。
“融合”分子是某一分子，其中2个或更多亚基分子相连，优选共价连接。所述亚基分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一类融合分子的示例包括但不限于融合蛋白（如ZFP或TALE DNA结合域与一个或多个激活结构域间的融合）和融合核酸（如编码上述融合蛋白的核酸）。第二类融合分子的示例包括但不限于形成三链体的核酸与多肽间的融合，小沟结合物与核酸间的融合。
融合蛋白在细胞中的表达可由融合蛋白递送至细胞产生或通过向细胞递送融合蛋白编码多核苷酸，其中转录所述多核苷酸，翻译转录本以产生融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接还可参与细胞中的蛋白表达。将多核苷酸和多肽递送到细胞的方法示于本公开他处。
为了本公开目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域（见下），以及调节基因产物生成的DNA区域，无论所述调节序列是否毗邻编码和/或转录序列。因此，基因包括但不必定限于启动子序列、终止子、翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质结合位点和基因座控制区。
“基因表达”指将基因所含信息转变成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物（如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA）或通过翻译mRNA生成的蛋白。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等方法修饰的RNA，和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化修饰的蛋白。
基因表达的“调节”指基因活性变化。表达调节可包括但不限于基因活化和基因抑制。基因组编辑（如切割、改变、灭活、随机突变）能用于调节表达。基因灭活指与不包括本文所述ZFP的细胞相比，任何基因表达的减少。因此，基因灭活可以是部分或完全。
“感兴趣区域”是任何细胞染色质区域，例如基因或者基因内或与之毗邻的非编码序列，其中需要结合外源分子。结合可用于靶向DNA切割和/或靶向重组目的。感兴趣区域可存在于染色体、附加体、细胞器基因组（如线粒体、叶绿体）、或感染病毒基因组。感兴趣区域可在基因编码区内，在转录的非编码区内，例如前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区上游或下游的非转录区内。感兴趣区域可以和单一核苷酸对一样小或多至2,000个核苷酸对长度，或任何整数值的核苷酸对。
“真核”细胞包括但不限于真菌细胞（如酵母）、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞（如T细胞）。
术语“操作性连接”和“操作性相连”（或“可操作连接”）根据2种或更多组分（如序列元件）并置可互换使用，其中所述组分排列成2种组分功能正常并允许至少一种组分能调节施加于至少一种另外组分的功能。举例来说，如果转录调节序列响应存在或缺失一种或多种转录调节因子而控制编码序列的转录水平，转录调节序列如启动子操作性连接于编码序列。转录调节序列一般操作性顺式连接编码序列，但不需直接与其毗邻。例如，增强子是操作性连接编码序列的转录调节序列，即使它们不连续。
在融合多肽方面，术语“操作性连接”能指各组分连接其他组分时行使的功能与其未如此连接时相同。例如，在ZFP DNA结合域融合激活结构域的融合多肽方面，如果所述融合多肽中的ZFP DNA结合域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时激活结构域能上调基因表达，则所述ZFP DNA结合域和激活结构域是操作性连接。在ZFP DNA结合域融合切割结构域的融合多肽方面，如果所述融合多肽中的ZFP DNA结合域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，同时切割结构域能在靶位点附近切割DNA，则所述ZFP DNA结合域和切割结构域是操作性连接。
蛋白、多肽或核酸的“功能片段”是某一蛋白、多肽或核酸，其序列与全长蛋白、多肽或核酸不相同，但仍保持与全长蛋白、多肽或核酸相同的功能。功能片段可具有的残基数目多于、少于对应天然分子、或与之相同，和/或可包含一个或多个氨基酸或核苷酸取代。确定核酸功能（如编码功能，与另一核酸杂交的能力）的方法为本领域熟知。类似地，熟知确定蛋白功能的方法。例如，能通过诸如滤器-结合、电泳迁移率变动、或免疫沉淀试验来测定多肽的DNA结合功能。DNA切割可通过凝胶电泳测定。参见Ausubel等,同上。可通过例如共免疫沉淀、双杂交试验或互补（遗传和生化）测定蛋白与另一蛋白相互作用的能力。参见例如Fields等.(1989)Nature 340:245-246;美国专利号5,585,245和PCT WO 98/44350。
“载体”能转移基因序列到靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”、和“基因转移载体”指能指导感兴趣基因表达和能转移基因序列到靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆、和表达载剂，以及整合载体。
“报告基因”或“报告序列”指生成易检测蛋白产物的任何序列，这在常规试验中优选但不必须。合适报告基因包括但不限于调节抗生素抗性（如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性）的蛋白编码序列，有色或荧光或发光蛋白（如绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光酶）、和调节提高细胞生长和/或基因扩增的蛋白（如二氢叶酸还原酶）的编码序列。标为标签包括例如一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。“表达标签”包括编码报告子的序列，所述序列可操作连接所需基因序列以监控感兴趣基因的表达。
“安全港”基因座是基因组内的基因座，其中可插入基因而不对宿主细胞产生任何有害影响。最大益处是其中所插入基因序列的表达不受相邻基因通读表达所干扰的安全港基因座。哺乳动物中安全港基因座的非限制性示例是AAVS1基因（参见美国公开号20080299580）、CCR5基因（参见美国公开号20080159996）、和/或Rosa基因座（参见WO 2010/065123）。
核酸酶
本文描述用于将功能性FIX蛋白编码序列整合到患有B型血友病的对象细胞基因组中的组合物，特别是核酸酶。在某些实施方式中，所述核酸酶是天然产生的。在其他实施方式中，所述核酸酶非天然产生，即在DNA结合域和/或切割结构域中进行工程改造。例如，天然产生核酸酶的DNA结合域可改变成结合选定靶位点（如大范围核酸酶已改造成结合与关联结合位点不同的位点）。在其他实施方式中，所述核酸酶包含异源DNA结合和切割结构域（如锌指核酸酶；TAL-效应结构域DNA结合蛋白；有异源切割结构域的大范围核酸酶DNA结合域）。
A.DNA结合域
在某些实施方式中，所述核酸酶是大范围核酸酶（归巢核酸内切酶）。天然产生的大范围核酸酶识别15-40碱基对切割位点且通常分为4个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。其识别序列已知。还参见美国专利号5,420,032;美国专利号6,833,252;Belfort等.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388;Dujon等.(1989)Gene82:115–118;Perler等.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127;Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228;Gimble等.(1996)J.Mol.Biol.263:163–180;Argast等.(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NEB公司（New EnglandBiolabs）产品目录。
在某些实施方式中，所述核酸酶包含改造（非天然产生）的归巢核酸内切酶（大范围核酸酶）。已知归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列，如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。还参见美国专利号5,420,032;美国专利号6,833,252;Belfort等.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388;Dujon等.(1989)Gene82:115–118;Perler等.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127;Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228;Gimble等.(1996)J.Mol.Biol.263:163–180;Argast等.(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NEB公司产品目录。另外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性能改造成结合非天然靶位点。参见例如Chevalier等.(2002)Molec.Cell 10:895-905;Epinat等.(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962;Ashworth等.(2006)Nature 441:656-659;Paques等.(2007)Current Gene Therapy7:49-66;美国专利公开号20070117128。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合域可在作为整体的核酸酶背景下改变（即从而所述核酸酶包括关联切割结构域）或可融合异源切割结构域。
在其他实施方式中，DNA结合域包含天然产生或改造（非天然产生）的TAL效应DNA结合域。参见例如美国专利申请号13/068,735，其通过引用全文纳入本文。已知黄单胞菌属（Xanthomonas）的植物病原细菌在重要作物中引起多种疾病。黄单胞菌的致病性取决于保守的III型分泌（T3S）系统，所述系统将大于25种不同效应蛋白注入植物细胞。这些注射蛋白中有模拟植物转录激活子和操作植物转录组的转录激活子样(TAL)效应物（参见Kay等(2007)Science318:648-651）。这些蛋白包含DNA结合域和转录激活结构域。一种最充分鉴定的TAL效应物是来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种（Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria）的AvrBs3（参见Bonas等(1989)Mol Gen Genet218:127-136和WO2010079430）。TAL效应物包含串联重复区的集中结构域，各重复区含有约34个氨基酸，这对所述蛋白的DNA结合特异性关键。另外，其包含核定位序列和酸性转录激活结构域（综述参见Schornack S等(2006)J Plant Physiol163(3):256-272）。另外，在植物病原细菌青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）中，发现称为brg11和hpx17的2个基因与青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）生物变种1菌株GMI1000和生物变种4菌株RS1000中的黄单胞菌AvrBs3家族同源（参见Heuer等(2007)Appl and EnvirMicro 73(13):4379-4384）。这些基因的核苷酸序列彼此有98.9%相同性，但差异在于hpx17重复结构域的1,575bp缺失。然而，2种基因产物与黄单胞菌AvrBs3家族蛋白的序列相同性小于40%。参见例如美国专利申请号13/068,735，其通过引用全文纳入本文。
这些TAL效应物的特异性取决于串联重复区中发现的序列。重复序列包含约102bp且所述重复区通常彼此91-100%同源（Bonas等,同上）。重复区的多态性常位于12和13位，在12和13位处高变残基特性与TAL效应物靶序列的连续核苷酸特性之间似乎有一对一的对应性（参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science326:1501和Boch等(2009)Science 326:1509-1512）。通过实验测定用于这些TAL效应物的DNA识别的天然代码，从而12和13位的HD序列引起胞嘧啶(C)结合，NG结合T，NI结合A、C、G或T，NN结合A或G，和ING结合T。这些DNA结合重复区组装成有新重复组合和数目的蛋白，以制备能与新序列相互作用并激活植物细胞中非内源报告基因表达的人工转录因子（Boch等,同上）。改造的TAL蛋白连接FokI切割半结构域以产生在酵母报告子试验（基于质粒的靶标）中显示活性的TAL效应结构域核酸酶融合（TALEN）。参见例如美国专利申请号13/068,735;Christian等((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717)。
在某些实施方式中，所述DNA结合域包含锌指蛋白。所述锌指蛋白优选非天然产生，因为其工程改造成结合所选靶位点。参见例如Beerli等.(2002)NatureBiotechnol.20:135-141;Pabo等.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660;Segal等.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;美国专利号6,453,242;6,534,261;6,599,692;6,503,717;6,689,558;7,030,215;6,794,136;7,067,317;7,262,054;7,070,934;7,361,635;7,253,273;和美国专利公开号2005/0064474;2007/0218528;2005/0267061，其都通过引用全文纳入本文。
改造的锌指结合域相较天然产生的锌指蛋白可具有新型结合特异性。改造方法包括但不限于合理设计和多种选择类型。合理设计包括例如使用含三重（或四重）核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中各三重或四重核苷酸序列与结合特定三重或四重序列的一个或多个锌指氨基酸序列相关联。参见例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261，其通过引用全文纳入本文。
包括噬菌体展示和双杂交系统在内的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538;5,925,523;6,007,988;6,013,453;6,410,248;6,140,466;6,200,759;和6,242,568;以及WO 98/37186;WO 98/53057;WO 00/27878;WO 01/88197和GB2,338,237。另外，提高对锌指结合域的结合亲和性描述于例如共有的WO 02/077227。
另外，如这些和其他参考文献所公开，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可用任何合适接头序列连接在一起，包括例如5个或更多氨基酸长度的接头。还参见美国专利号6,479,626;6,903,185;和7,153,949中6个或更多氨基酸长度的示例性接头序列。本文所述蛋白可包括单独蛋白锌指间的任何合适接头组合。
选择靶位点;ZFP和设计及构建融合蛋白（和其编码多核苷酸）的方法为本领域技术人员已知并详细描述于美国专利号6,140,0815;789,538;6,453,242;6,534,261;5,925,523;6,007,988;6,013,453;6,200,759;WO 95/19431;WO 96/06166;WO 98/53057;WO 98/54311;WO 00/27878;WO 01/60970WO 01/88197;WO 02/099084;WO 98/53058;WO 98/53059;WO 98/53060;WO 02/016536和WO 03/016496。
另外，如这些和其他参考文献所公开，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可用任何合适接头序列连接在一起，包括例如5个或更多氨基酸长度的接头。还参见美国专利号6,479,626;6,903,185;和7,153,949中6个或更多氨基酸长度的示例性接头序列6。本文所述蛋白可包括单独蛋白锌指间的任何合适接头组合。
因此，所述核酸酶包含特异性结合任何基因中靶位点的DNA结合域，所述基因中需要插入编码FIX蛋白的序列。
B.切割结构域
任何合适的切割结构域可操作性连接DNA结合域以形成核酸酶。例如，ZFPDNA结合域融合核酸酶结构域以产生ZFN-能通过其经改造(ZFP)DNA结合域识别其预期核酸靶标并通过核酸酶活性引起DNA在ZFP结合位点附近切割的功能实体。参见例如Kim等.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160。最近，ZFN已用于多种生物的基因组修饰。参见例如美国专利公开20030232410;20050208489;20050026157;20050064474;20060188987;20060063231;和国际公开WO07/014275。同样，TALE DNA结合域融合核酸酶结构域以产生TALEN。参见例如美国申请号13/068,735。
如上所示，所述切割结构域可与DNA结合域异源，例如锌指DNA结合域和来自核酸酶的切割结构域或TALE DNA结合域和切割结构域、或大范围核酸酶DNA结合域和来自不同核酸酶的切割结构域。异源切割结构域可获自任何核酸内切酶或核酸外切酶。可获得切割结构域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如马萨诸塞州贝弗利的NEB公司2002-2003产品目录;和Belfort等.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。已知切割DNA的其它酶（如S1核酸酶;绿豆核酸酶;胰脱氧核糖核酸酶I;微球菌核酸酶;酵母HO核酸内切酶;还参见Linn等.(编)Nucleases（《核酸酶》）,冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）,1993）。这些酶（或其功能片段）中的一种或多种能用作切割结构域和切割半结构域来源。
类似地，切割半结构域可源自上述需要二聚化以用于切割活性的任何核酸酶或其部分。一般，如果融合蛋白包含切割半结构域，切割需要2种融合蛋白。或者，可使用含2个切割半结构域的单一蛋白。所述2个切割半结构域可源自相同核酸内切酶（或其功能片段），或各切割半结构域可源自不同核酸内切酶（或其功能片段）。另外，2种融合蛋白的靶位点优选相对于彼此配置，从而2种融合蛋白与其各靶位点的结合将切割半结构域以某一相互空间定向放置，使得所述切割半结构域能通过例如二聚化形成功能性切割结构域。因此，在某些实施方式中，靶位点附近边缘由5-8个核苷酸或15-18个核苷酸分开。然而，任何整数数目的核苷酸或核苷酸对能插入2个靶位点间（如2-50个核苷酸对或更多）。一般，切割位点位于靶位点之间。
限制性核酸内切酶（限制性酶）在许多物种中存在且能序列特异性结合DNA（在识别位点处）、和在结合位点处或附近切割DNA。某些限制性酶（如IIS型）在从识别位点移出的位点处切割DNA且具有可分开的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I催化DNA的双链切割，一条链上离其识别位点9个核苷酸且另一条链上离其识别位点13个核苷酸。参见例如美国专利5,356,802;5,436,150和5,487,994;以及Li等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Li等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768;Kim等.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887;Kim等.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方式中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域（或切割半结构域）和一个或多个锌指结合域，其可经或未经改造。
示例性IIS型限制性酶是Fok I，其切割结构域与结合域可分开。所述特定酶作为二聚体有活性。Bitinaite等.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因此，为了本公开目的，所公开融合蛋白使用的Fok I酶部分视作切割半结构域。因此，对于用锌指-Fok I融合的靶向双链切割和/或靶向细胞序列取代，各含FokI切割半结构域的2种融合蛋白能用于重建具有催化活性的切割结构域。或者，还能使用含锌指结合域和2个FokI切割半结构域的单一多肽。本公开他处提供了使用锌指-Fok I融合的靶向切割和靶向序列改变的参数。
切割结构域或切割半结构域可以是保持切割活性或保持多聚化（如二聚化）形成功能性切割结构域能力的任何蛋白部分。
示例性IIS型限制性酶描述于国际公开WO 07/014275，其通过引用全文纳入本文。其他限制性酶还包含可分开的结合和切割结构域，且这些由本公开考虑。参见例如Roberts等.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
在某些实施方式中，所述切割结构域包含一个或多个改造的切割半结构域（也称为二聚化结构域突变体），所述切割半结构域尽可能减少或防止同二聚化，描述于例如美国专利公开号20050064474;20060188987;20070305346和20080131962，所有专利的公开内容通过引用全文纳入本文。Fok I位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、和538处的氨基酸残基是影响Fok I切割半结构域的所有靶标。
形成专性异二聚体的示例性经改造Fok I切割半结构域包括某一对，其中第一切割半结构域包括Fok I位置490和538处氨基酸残基的突变且第二切割半结构域包括氨基酸残基486和499处的突变。
因此，在一个实施方式中，490处突变用Lys(K)取代Glu(E)；538处突变用Lys(K)取代Iso(I)；486处突变用Glu(E)取代Gln(Q)；499处突变用Lys(K)取代Iso(I)。特定地，制备本文所述改造的切割半结构域是通过突变切割半结构域中位置490(E→K)和538(I→K)产生称为“E490K:I538K”的经改造切割半结构域和突变另一切割半结构域中位置486(Q→E)和499(I→L)产生称为“Q486E:I499L”的经改造切割半结构域。本文所述改造的切割半结构域是专性异二聚体突变体，其中尽可能减少或消除异常切割。参见例如美国专利公开号2008/0131962，其公开内容通过引用全文纳入以用于所有目的。在某些实施方式中，改造的切割半结构域包含位置486、499和496（相对于野生型FokI编号）的突变，例如在486位用Glu(E)残基取代野生型Gln(Q)残基、499位用Leu(L)残基取代野生型Iso(I)残基和496位用Asp(D)或Glu(E)残基（也分别称为“ELD”和“ELE”结构域）取代野生型Asn(N)残基的突变。在其他实施方式中，改造的切割半结构域包含位置490、538和537（相对于野生型FokI编号）的突变，例如在490位用Lys(K)残基取代野生型Glu(E)残基，538位用Lys(K)残基取代野生型Iso(I)残基，537位用Lys(K)或Arg(R)残基（也分别称为“KKK”和“KKR”结构域）取代野生型His(H)残基的突变。在其他实施方式中，改造的切割半结构域包含位置490和537（相对于野生型FokI编号）的突变，例如在490位用Lys(K)残基取代野生型Glu(E)残基和537位用Lys(K)或Arg(R)残基（也分别称为“KIK”和“KIR”结构域）取代野生型His(H)残基的突变。（参见美国专利公开号20110201055）。在其他实施方式中，改造的切割半结构域包含“Sharkey”和/或“Sharkey’”突变（参见Guo等,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107）。
本文所述改造的切割半结构域能用任何合适方法制备，例如通过定点诱变野生型切割半结构域（Fok I），如美国专利公开号20050064474;20080131962;和20110201055所述。
或者，核酸酶可用所谓“分裂酶”技术在核酸靶位点体内组装（参见例如美国专利公开号20090068164）。所述分裂酶的组分可在单独表达构建体上表达，或能在一个开放阅读框中连接，其中单独组分通过例如自切割2A肽或IRES序列被分开。组分可以是单独锌指结合域或大范围核酸酶核酸结合域的结构域。
核酸酶能在使用前筛选活性，例如WO 2009/042163和20090068164所述基于酵母的染色体系统。核酸酶表达构建体能用本领域已知方法方便设计。参见例如美国专利公开20030232410;20050208489;20050026157;20050064474;20060188987;20060063231;和国际公开WO 07/014275。核酸酶表达可在组成型启动子或诱导型启动子控制下，例如在棉子糖和/或半乳糖存在下激活（去抑制）和葡萄糖存在下受抑制的半乳糖激酶启动子。
靶位点
如上所详述，DNA结构域能改造成结合任何所选序列，例如在内源FIX基因或内源或插入的安全港基因中。改造的DNA结合域相较天然产生的DNA结合域可具有新型结合特异性。改造方法包括但不限于合理设计和多种选择类型。合理设计包括例如使用含三重（或四重）核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中各三重或四重核苷酸序列与结合特定三重或四重序列的一个或多个锌指氨基酸序列相关联。参见例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261，其通过引用全文纳入本文。还可实施TAL效应结构域的合理设计。参见例如分别于2010年5月17日和2010年8月21日提交的美国临时申请号61/395,836和61/401,429。
应用于DNA结合域的示例性选择方法包括噬菌体展示和双杂交体系，所述方法公开于美国专利5,789,538;5,925,523;6,007,988;6,013,453;6,410,248;6,140,466;6,200,759;和6,242,568;以及WO 98/37186;WO 98/53057;WO 00/27878;WO 01/88197和GB 2,338,237。另外，提高对锌指结合域的结合亲和性描述于例如共有的WO 02/077227。
选择靶位点;核酸酶和设计及构建融合蛋白（和其编码多核苷酸）的方法为本领域技术人员已知并详细描述于美国专利申请公开号20050064474和20060188987，所述专利申请通过引用全文纳入本文。
另外，如这些和其他参考文献所公开，DNA结合域（如多指锌指蛋白）可用任何合适接头序列连接在一起，包括例如5个或更多氨基酸长度的接头。还参见美国专利号6,479,626;6,903,185;和7,153,949中6个或更多氨基酸长度的示例性接头序列。本文所述蛋白可包括蛋白单独DNA结合域间的任何合适接头组合。还参见美国申请号13/066,735。
为了通过靶向插入功能性FIX蛋白编码序列来治疗B型血友病，对象基因组内任何所需位点插入用核酸酶切割，其刺激靶向插入载有FIX编码序列的供体多核苷酸。所述核酸酶的DNA结合域可靶向任何基因组所需位点。
在某些实施方式中，所述核酸酶的DNA结合域靶向内源FIX(F9)基因，如美国专利申请号12/798,749所述。靶位点可以是编码序列中或者编码序列上游或下游的任何地方。在某些实施方式中，所述一个或多个靶位点在编码序列3’末端附近。
在其它实施方式中，所述核酸酶（DNA结合域组分）靶向“安全港”基因座，所述基因座包括例如AAVS1基因（参见美国公开号20080299580）、CCR5基因（参见美国公开号20080159996）、和/或Rosa基因（参见WO 2010/065123）。
供体序列
为了治疗血友病，供体序列包含功能性FIX蛋白编码序列或其部分以产生在供体整合后编码和表达功能性FIX蛋白的序列。所述供体分子可插入内源基因，从而所有、一些或没有内源基因被表达。例如，如本文所述含功能FIX序列的转基因可插入内源FIX基因座，从而一些或没有内源FIX用FIX转基因表达（例如，供体可校正野生型内源序列表达的突变）。在其它实施方式中，FIX转基因整合到任何内源基因座中，例如安全港基因座（内源或插入）。参见例如美国专利公开20080299580;20080159996和201000218264。
FIX供体序列能在融合蛋白表达之前、同时、或之后引入细胞。FIX供体多核苷酸通常包含与基因组序列足够的同源性以支持其与带有同源性的基因组序列之间同源重组（或同源定向修复）。参见例如美国专利公开号2005/0064474;2007/0134796和2009/0263900。显然所述供体序列通常与其取代的基因组序列不相同。例如，所述供体多核苷酸序列可包含一个或多个相对于基因组序列的单一碱基变化、插入、删除、倒位或重排，只要与染色体序列存在足够同源性。或者，供体序列可包含侧接有2个同源性区域的非同源序列。另外，供体序列可包括含有与细胞染色质中感兴趣区域不同源序列的载体分子。供体分子可包含与细胞染色质同源的数个不连续区域。例如，对于靶向插入通常不存在于感兴趣区域的序列，所述序列能在供体核酸分子中出现且侧接有与感兴趣区域序列同源的区域。
FIX供体多核苷酸可以是DNA或RNA，单链或双链并能以线形或环形形式引入细胞。如果以线形形式引入，所述供体序列末端可通过本领域技术人员已知的方法加以保护（如免于核酸外切降解）。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基加入线形分子的3’末端和/或自补寡核苷酸连接一个或两个末端。参见例如Chang等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963;Nehls等.(1996)Science272:886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于添加末端氨基基团和使用经修饰核苷酸间连键，例如硫代磷酸、磷酰胺、和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。多核苷酸能作为载体分子一部分引入细胞，所述载体分子具有额外序列如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体多核苷酸能作为裸核酸、与试剂如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸引入，或能通过病毒递送（如腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒）。
一般插入FIX供体，从而其表达由内源启动子在整合位点驱动（例如，当供体整合到患者缺陷型FIX(F9)基因座时的内源FIX启动子）。然而，显然所述供体可包含启动子和/或增强子，例如整合后驱动功能性FIX蛋白表达的组成型启动子或诱导型或组织特异性（如肝特异性）启动子。
FIX供体序列可特异性整合到所选靶位点，从而消除与传统基因治疗中随机整合相关的问题。在某些实施方式中，所述供体序列整合到内源FIX基因座以校正B型血友病患者的缺陷。在其他实施方式中，FIX供体序列整合到安全港基因座，例如CCR5基因座、AAVS1基因座等。
此外，尽管表达不需要，外源序列还可包含转录或翻译调节序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽的序列和/或多聚腺苷酸化信号。
递送
所述核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和含有蛋白和/或本文所述多核苷酸的组合物可通过任何合适方式体内或离体递送。
递送本文所述核酸酶的方法描述于例如美国专利号6,453,242;6,503,717;6,534,261;6,599,692;6,607,882;6,689,558;6,824,978;6,933,113;6,979,539;7,013,219;和7,163,824，其公开内容都通过引用全文纳入本文。
本文所述核酸酶和/或供体构建体还可用含一种或多种锌指蛋白编码序列的载体递送。可使用的任何载体系统包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。还参见美国专利号6,534,261;6,607,882;6,824,978;6,933,113;6,979,539;7,013,219;和7,163,824，所述专利通过引用全文纳入本文。此外，显然任何这些载体可包含一种或多种治疗所需序列。因此，当一种或多种核酸酶和供体构建体引入细胞时，相同载体或不同载体上可携带所述核酸酶和/或供体多核苷酸。使用多种载体时，各载体可包含编码一种或多种核酸酶和/或供体构建体的序列。
基于病毒和非病毒的常规基因转移方法能用于将编码核酸酶和供体构建体的核酸引入细胞（如哺乳动物细胞）和靶组织。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸核酸、和与递送载剂如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送到细胞后有附加型或整合型基因组。体内递送经改造DNA结合蛋白和含有这些结合蛋白的融合蛋白的综述参见例如Rebar(2004)Expert Opinion Invest.Drugs13(7):829-839;Rossi等.(2007)Nature Biotech.25(12):1444-1454以及一般基因递送参考文献如Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel和Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani和Caskey,TIBTECH11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology6(10):1149-1154(1988);Vigne,RestorativeNeurology and Neuroscience8:35-36(1995);Kremer和Perricaudet,British MedicalBulletin51(1):31-44(1995);Haddada等.,收录于Current Topics in Microbiology andImmunology（《微生物学和免疫学热点》）Doerfler和
Figure BDA00003339536400261
(编)(1995);和Yu等.,Gene Therapy1:13-26(1994)。
非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质转染、微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒子、和试剂提高的DNA摄入。声孔效应还能用于核酸递送，使用例如Sonitron2000系统（Rich-Mar）。
其他示例性核酸递送系统包括Amaxa生物系统公司（Amaxa Biosystems）（德国科隆）、Maxcyte公司（Maxcyte,Inc.）（马里兰州罗克维尔）、BTX分子递送系统公司（BTX Molecular Delivery Systems）（马萨诸塞州霍利斯顿）和哥白尼治疗公司（Copernicus Therapeutics Inc）提供的那些（参见例如US6008336）。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386;4,946,787;和4,897,355)且脂质转染试剂市售可得（如TransfectamTM和LipofectinTM）。适合有效-受体识别脂质转染多核苷酸的阳离子和中性脂质包括Felgner,WO 91/17424,WO 91/16024的那些。
制备包括靶脂质体如免疫脂质复合物在内的脂质:核酸复合物的方法为本领域技术人员熟知（参见例如Crystal,Science 270:404-410(1995);Blaese等.,CancerGene Ther.2:291-297(1995);Behr等.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy等.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao等.,Gene Therapy2:710-722(1995);Ahmad等.,Cancer Res.52:4817-4820(1992);美国专利号4,186,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975,4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028,和4,946,787）。
其他递送方法包括包装待递送核酸到EnGeneIC递送载剂（EDV）的应用。这些EDV用双特异性抗体特定递送到靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织有特异性且另一个对EDV有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，然后通过内吞作用将EDV带到细胞。一旦在细胞中，释放内容物（参见MacDiarmid等(2009)NatureBiotechnology27(7):643）。
使用基于RNA或DNA病毒载体以递送编码改造ZFP的核酸，利用将病毒靶向体内特定细胞和将病毒有效负荷转运至核的高度演化方法。病毒载体能直接给予患者（体内）或其能用于体外治疗细胞和将修饰细胞给予患者（离体）。用于递送ZFP的基于病毒的常规系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒载体。能用逆转录病毒、慢病毒、和腺相关病毒基因转移方法在宿主基因组中整合，通常引起所插入转基因的长期表达。另外，在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
逆转录病毒的趋向性可通过纳入外来包膜蛋白、扩增靶细胞的潜在靶标群来改变。慢病毒载体是能转导或感染非分裂细胞的逆转录病毒载体且通常生成高病毒效价。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由顺式激活的长末端重复构成，包装容量多至6-10kb外来序列。最小量的顺式激活LTR足以复制和包装载体，所述载体然后用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病毒(MuLV)、長臂猿白血病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、和其组合的那些（参见例如Buchscher等.,J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann等.,J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommerfelt等.,Virol.176:58-59(1990);Wilson等.,J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller等.,J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700）。
在优选瞬时表达的应用中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的系统能在许多细胞类型中具有极高转导效率且不需要细胞分裂。用所述载体，获得高效价和高水平的表达。此载体能在相对简单系统中大量生成。还采用腺相关病毒（“AAV”）载体以在例如体外生成核酸和肽中用靶核酸转导细胞，和用于体内和离体基因治疗方法（参见例如West等.,Virology 160:38-47(1987);美国专利号4,797,368;WO 93/24641;Kotin,Human Gene Therapy5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)）。重组AAV载体的构建描述于多个出版物，包括美国专利号5,173,414;Tratschin等.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,等.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat和Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984);和Samulski等.,J.Virol.63:03822-3828(1989)。
目前有至少6个病毒载体方法用于临床试验的基因转移，其采用的方法涉及通过基因插入辅助细胞系产生转导剂来互补缺陷载体。
pLASN和MFG-S是用于临床试验的逆转录病毒载体示例（Dunbar等.,Blood85:3048-305(1995);Kohn等.,Nat.Med.1:1017-102(1995);Malech等.,PNAS 94:2212133-12138(1997)）。PA317/pLASN是用于基因治疗试验的第一治疗载体。（Blaese等.,Science270:475-480(1995)）。就MFG-S包装载体观察到50%或更高的转导效率。（Ellem等.,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997);Dranoff等.,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)）。
重组的腺相关病毒载体（rAAV）是有希望的替代性基因递送系统，所述系统基于缺陷和非致病细小病毒腺相关2型病毒。所有载体源自仅保持AAV 145bp反向末端重复序列的质粒，所述重复侧接有转基因表达盒。由整合到转导细胞基因组引起的有效基因转移和稳定转基因递送是载体系统的关键特征（Wagner等.,Lancet351:91171702-3(1998),Kearns等.,Gene Ther.9:748-55(1996)）。包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10在内的其他AAV血清型和任何新型AAV血清型还可根据本发明使用。
复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可以高效价生成且易感染许多不同细胞类型。大部分腺病毒载体工程改造成转基因取代Ad E1a、E1b、和/或E3基因；随后复制缺陷型载体在人293细胞中增殖，反式提供被删除的基因功能。Ad载体能体内转导多种组织，包括非分裂、分化细胞，如肝、肾和肌肉中发现的那些。常规Ad载体具有大承载能力。Ad载体在临床试验中应用的示例包括用肌肉内注射抗肿瘤免疫的多核苷酸治疗（Stierman等.,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998)）。腺病毒载体在临床试验基因转移中应用的其他示例包括Rosenecker等.,Infection24:15-10(1996);Sterman等.,Hum.Gene Ther.9:71083-1089(1998);Welsh等.,Hum.GeneTher.2:205-18(1995);Alvarez等.,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997);Topf等.,Gene Ther.5:507-513(1998);Sterman等.,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。
包装细胞用于形成能感染宿主细胞的病毒颗粒。所述细胞包括包装腺病毒的293细胞，和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因治疗的病毒载体通常由生产细胞系产生，所述细胞系将核酸载体包装入病毒颗粒。所述载体通常包含包装和随后整合入宿主（若适用）所需的最小病毒序列，其他病毒序列由编码待表达蛋白的表达盒取代。缺失的病毒功能通过包装细胞系反式提供。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的反向末端重复（ITR）序列，其为包装和整合入宿主基因组所需。病毒DNA在细胞系中包装，所述细胞系包含编码其他AAV基因即rep和cap的辅助质粒，但缺乏ITR序列。所述细胞系用腺病毒作为辅助物感染。所述辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因表达。由于缺乏ITR序列，所述辅助质粒不以显著量包装。腺病毒污染可通过例如热处理（腺病毒对之的敏感性高于AAV）减少。
在许多基因治疗应用中，需要递送基因治疗载体，其对特定细胞类型有高度特异性。因此，病毒载体能修饰成对给定细胞类型有特异性，这是通过表达配体作为有病毒外表面上病毒外壳蛋白的融合蛋白。配体选择成对已知感兴趣细胞类型上所存在受体有亲和性。例如，Han等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道了莫洛尼鼠白血病病毒能修饰成表达融合gp70的人调蛋白，所述重组病毒感染某些表达人表皮生长因子受体的人乳腺癌细胞。此原理能延伸到其他病毒-靶细胞对，其中所述靶细胞表达受体且所述病毒表达含有细胞表面受体配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体能改造成展示抗体片段（如FAB或Fv），所述片段对几乎任何选定细胞受体有特异结合亲和性。尽管上面的描述主要应用于病毒载体，可将相同原理应用于非病毒载体。所述载体能改造成包含倾向于由特定靶细胞摄入的特异吸收序列。
基因治疗载体能通过体内给予个体患者来递送，一般通过如下所述的全身给予（如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内灌注）或局部应用。或者，载体能离体递送到细胞，如从个体患者移植的细胞（如淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检）或通用供体造血干细胞，然后将细胞再植入患者，通常在选择纳入载体的细胞后。
含有核酸酶和/或供体构建体的载体（如逆转录病毒、腺病毒、脂质体等）还可直接给予生物体以体内转导细胞。或者，能给予裸DNA。给予是常用于将分子引入最终接触血液或组织细胞的任何途径，包括但不限于注射、灌注、局部应用和电穿孔。给予所述核酸的合适方法可用且为本领域技术人员熟知，尽管能采用一种以上途径给予特定组合物，特定途径通常提供比另一途径更直接和更有效的反应。
适于引入本文所述多核苷酸（如编码核酸酶和/或编码FIX）的载体包括非整合慢病毒载体（IDLV）。参见例如Ory等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388;Dull等.(1998)J.Virol.72:8463-8471;Zuffery等.(1998)J.Virol.72:9873-9880;Follenzi等.(2000)Nature Genetics25:217-222;美国专利公开号2009/054985。
药学上可接受运载体部分通过给予的特定组合物以及用于给予所述组合物的特定方法来确定。因此，有多种可用药物组合物的合适制剂，如下所述（参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences（《雷明顿药物科学》）,第17版,1989）。
显然核酸酶编码序列和供体构建体能用相同或不同系统递送。例如，供体多核苷酸可由质粒携带，而一种或多种核酸酶可由AAV载体携带。此外，不同载体能用相同或不同途径给予（肌肉内注射、尾静脉注射、其他静脉内注射、腹膜内给予和/或肌肉内注射）。载体可同时或以任何顺序递送。
因此，本公开包括通过FIX编码序列的核酸酶介导的整合来体内或离体治疗B型血友病。所述组合物以有效获得血清、肝或靶细胞中所需治疗FIX多肽浓度的量给予人患者。所述给予可通过任何方式，其中所述多核苷酸递送到所需靶细胞。例如，考虑体内和离体方法。静脉内注射到门静脉是优选的给予方法。其他体内给予模式包括例如直接注射到肝叶或胆管和静脉内注射肝远端（包括通过肝动脉），直接注射到肝实质，经肝动脉注射，和/或经胆管树逆行注射。离体给予模式包括体外转导切除的肝细胞或其他肝脏细胞，然后将经转导、切除的肝细胞灌注回人患者的门脉管系统、肝实质或胆管树，参见例如Grossman等.,(1994)Nature Genetics,6:335-341。
待给予的有效量核酸酶和FIX供体根据感兴趣的治疗多肽在患者间不同。因此，有效量可通过医师给予组合物最佳测定且合适剂量能由本领域普通技术人员容易确定。有充足时间用于整合和表达（例如通常4-15天）后，分析血清或其他组织水平的治疗多肽以及与给予前初始水平作比较会确定给予量是否过低、在正确范围内或过高。初始和后续给予的合适方案也可变化，但通常是初始给予然后后续给予（若必需）。后续给予可以不同间隔给予，范围从每日到每年到每隔数年。本领域技术人员应理解可推荐合适免疫抑制技术以避免通过免疫抑制递送载体而抑制、阻断转导，参见例如Vilquin等.,(1995)Human Gene Ther.,6:1391-1401。
离体和体内给予的制剂包括液体或乳化液体中的悬液。活性成分通常与药学上可接受且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适赋形剂包括例如水、盐水、葡聚糖、甘油、乙醇等、和其组合。另外，所述组合物可包含少量辅助物质，如湿润或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或提高药物组合物有效性的其他试剂。
下列实施例涉及核酸酶包含锌指核酸酶（ZFN）的本公开示例性实施方式。应理解这仅用于举例目的且可使用其他核酸酶，例如归巢核酸内切酶（大范围核酸酶），所述归巢核酸内切酶具有改造的DNA结合域和/或天然产生的经改造的归巢核酸内切酶（大范围核酸酶）DNA结合域和异源切割结构域的融合物或TALEN。
实施例
实施例1：FIX特异性ZFN和其用于靶向整合的应用
作为治疗遗传病策略的基因转移已在多种疾病动物模型中成功完成，最近是在人应用中（参见例如Aiuti等,(2009)N.Engl.J.Med.360:447-458;Maguire等,(2009)N.Engl.J.Med.358:2240-2248;Cartier等,(2009)Science326:818-823）。基因靶向用于校正离体培养的ES样诱导多能干细胞（Hanna等,(2007)Science 318:1920-1923），但大部分遗传病影响器官系统，其中离体操作目前不可行。一种所述器官是肝，即血浆蛋白合成的主要位点，包括凝血因子。一种肝基因治疗的模型遗传病是B型血友病，由缺乏F9基因编码的凝血因子IX（FIX）引起。靶向整合（TI）野生型外显子2-8到F9内含子1会使得野生型编码序列与外显子1剪接（图1A），引起野生型FIX表达和拯救大部分F9突变导致的缺陷。因此，尝试研究联合靶向载体的ZFN是否能诱导体内基因靶向以原位校正肝细胞基因组内的突变F9基因，所述载体携带野生型F9外显子2-8。
靶向人F9内含子1的ZFN对用于测试这些ZFN在特定靶位点诱导DSB的能力。使用Cel-I试验（SurveyorTM,环球基因公司.Perez等,(2008)Nat.Biotechnol.26:808-816和Guschin等,(2010)Methods Mol Biol.649:247-56），其中PCR扩增靶位点，然后用错配检测酶Cel-I定量插入和缺失（indel）（Yang等,(2000)Biochemistry39,3533-3541），Cel-I提供DSB频率的下限估计。转染ZFN表达载体后3天，用DNeasy试剂盒（凯杰公司（Qiagen））从K562细胞分离基因组DNA。用于Cel-I分析hF9内含子1的引物是N2For(TCGGTGAGTGATTTGCTGAG,SEQ ID NO:1)和N2Rev(AACCTCTCACCTGGCCTCAT,SEQ ID NO:2)。称为N2的最高活性ZFN对靶向hF9基因内含子1，如下表1所示（还参见美国公开号20110027235）：
表1:hFactor9特异性ZFN对N2
Figure BDA00003339536400311
用于细胞培养转染的N2ZFN表达质粒如下构建：在2种ZFN编码序列间插入来自一点褐翅蛾（Thosea asigna）病毒的2A接头，将此盒插入CMV启动子下游。N2 ZFN对转染到人K562细胞后，发现30% N2靶位点被切割（图1C）。为测试N2 ZFN通过诱导DSB刺激同源重组的能力，将N2 ZFN与插入NheI限制性位点的靶载体共转染到K562细胞中（图1D）。通过PCR从K562基因组DNA扩增具有同源性的左和右臂来构建NheI供体质粒。含有NheI限制性位点的短序列随后在具有同源性的左和右臂间引入。发现在转染后第3和10天，分别有14%和12%等位基因对NheI消化敏感（图1E），指示通过同源重组的有效靶向整合（TI）速度。
实施例2：人血友病的体内鼠模型
N2靶位点存在于hF9内含子1，但在鼠F9基因中缺失。因此，为体内测试N2ZFN，生成B型血友病（HB）的人源化小鼠模型。构建肝特异启动子控制下的hF9小基因（图2A）（Shen等,(1989)DNA 8:101-108和Miao等,(2000)Mol.Ther.1:522-532）。hF9内含子1的TI的引物是N2 TI For(ggccttatttacacaaaaagtctg,SEQID NO:14)和N2TI Rev(tttgctctaactcctgttatccatc,SEQ ID NO:15)。
此构建体的内含子1包含人N2靶位点（起降场，LP）。LP构建体中剩余的F9序列模拟先前鉴定的无义突变（Y155stop）（Thompson等,(1989)Hum.Genet.94:299-302），其中编码FIX催化结构域的外显子前的提前终止密码子导致没有循环FIX蛋白。LP构建体通过基因合成（金斯瑞（Genscript））和连入pUC57质粒来构建。然后，LP构建体通过SwaI消化切割并在FLP重组酶位点间专有质粒的SwaI位点连入，兼容重组酶介导的盒式交换（RCME）（泰康利-阿蒂米斯公司（Taconic-Artemis））以建立LP KI质粒。将LP KI质粒和FLP重组酶表达质粒（泰康利-阿蒂米斯公司）转染入B6S6F1胚胎干（ES）细胞，所述细胞含有兼容ROSA26基因座处RCME的FLP重组酶位点（Zambrowicz等,(1997)Proc Natl Acad Sci 94:3789-3794）。正确靶向的B6S6F1-LP ES细胞克隆通过Southern印迹鉴定并注入B6D2F1囊胚。纯ES细胞源性B6S6F1-LP小鼠（G0）通过自然分娩递送，嵌合幼畜与野生型C57BL/6J小鼠（杰克逊实验室（Jackson Laboratories））回交持续5代（体内切割实验）或7-10代（体内TI实验）。
LP小鼠用引物LP Oligo 1(ACTGTCCTCTCATGCGTTGG,SEQ ID NO:16)、LP Oligo 2(GATGTTGGAGGTGGCATGG,SEQ ID NO:17)、wtROSA Oligo 1(CATGTCTTTAATCTACCTCGATGG,SEQ ID NO:18)、和wtROSA Oligo2(CTCCCTCGTGATCTGCAACTCC,SEQ ID NO:19)(图2B)进行基因分型。还将LP小鼠与缺失鼠F9基因的现有小鼠模型杂交（Lin等,(1997)Blood 90,3962-3966），以产生能体内测试N2ZFN活性的LP/HB小鼠。
HB小鼠与C57BL/6J小鼠回交（杰克逊实验室）持续>10代。C57BL/6J小鼠（杰克逊实验室）用于LP阴性TI实验。如所预期，LP小鼠没有可检测的循环hFIX（图2c）。用hFIX ELISA试剂盒（亲和生物公司（Affinity Biologicals））定量血浆hFIX，标准曲线来自收集的正常人血浆（三一生物科技公司（Trinity Biotech））。所有低于标准曲线最后值（15ng/mL）的值任意给定15ng/mL的值，这是检测极限。用于hFIX ELISA的血浆通过眼球后出血进入肝素化毛细管来获得。
实施例3：FIX特异性ZFN的体内靶向递送
为将N2 ZFN递送至肝即FIX生成的正常位点，制备嗜肝性腺相关病毒载体,血清型8（AAV8-N2），所述载体从肝特异增强子和启动子表达N2 ZFN（Shen等,同上和Miao等,同上）（图2D）。
为体内测试N2 ZFN的切割活性，注射后第7天用1e11v.g.AAV8-N2表达载体和经分离肝DNA在LP小鼠中实施尾静脉注射。PCR扩增LP和Cel-I试验显示34-47%的LP等位基因被切割（图2E）。LP构建体的Cel-I的引物是LP N2 For(CTAGTAGCTGACAGTACC,SEQ ID NO:20)和LP N2 Rev(gaagaacagaagcctaattatg,SEQ ID NO:21)。
实施例4：供体核酸和FIX特异性ZFN的体内共递送
将前面有剪接受体（SA）的野生型外显子2-8插入LP构建体的内含子1能剪接野生型编码序列与外显子1（图3A）。为原位校正LP小鼠中的突变F9基因，生成AAV供体模板载体（AAV-供体）用于基因靶向，具有同源性臂，侧接“SA–野生型hF9外显子2-8”盒（图3A）。通过PCR从LP小鼠基因组DNA扩增具有同源性的左和右臂，构建供体载体生成质粒。通过从pAAV-hFIX16质粒（Manno等,(2006)Nat.Med.12:342-347）PCR扩增并在具有同源性的左和右臂间连接，获得“剪接受体-外显子2-8编码序列-牛生长激素polyA信号”盒。由于细胞周期的S/G2期有利于HR，将N2和供体载体递送到新生小鼠，其中迅速增殖的肝细胞在细胞周期进程中进入S/G2。
在LP/HB小鼠生命第二天注射单独AAV-N2(5e10v.g)(n=1)、AAV-N2(5e10v.g)+AAV-供体(2.5e11v.g)(n=5)、或AAV-Mock(5e10v.g)+AAV-供体(2.5e11v.g)(n=5)。Mock载体中，N2ZFN由海肾荧光素酶取代。
在生命的第10周，处死小鼠并分离肝DNA用于供体TI的试验，使用2种单独PCR策略。第一策略使用就靶向LP等位基因产生较小扩增子和就未靶向LP等位基因产生较大扩增子的引物（图3a,引物P1/P2）。第二策略涉及使用就靶向LP等位基因产生较大扩增子和就未靶向LP等位基因产生较小扩增子的引物（图3A,引物P1/P3）。LP构建体的TI的引物是P1(acggtatcgataagcttgatatcgaattctag,SEQ IDNO:22)、P2(cactgatctccatcaacatactgc,SEQ ID NO:23)、和P3(gaataattctttagttttagcaa,SEQ ID NO:24)。
进行2种PCR分析时，发现证据显示TI仅在接受N2+供体的小鼠中（图3B）。带强度定量表明1-7%TI频率（图3B）。
为测定基因组校正是否引起循环hFIX生成，在LP小鼠生命第二天注射用单独AAV-N2(n=7)、AAV-Mock+AAV-供体(n=6)、或AAV-N2+AAV-供体(n=7)（与上述相同的载体剂量）。接受单独N2或Mock+供体的小鼠的血浆hFIX水平平均小于15ng/mL（试验检测下限），而接受N2+供体的小鼠平均为116-121ng/mL（对应于2-3%的正常标准）（图4A），显著大于接受单独N2和Mock+供体的小鼠（所有时间点下p≤0.006，双尾T检验）。
为确认稳定基因组校正，进行部分肝切除术（PHx），随着肝细胞在肝再生期间增殖，引起染色体外附加体稀释并丧失（Nakai等,(2001),J.Virol.75:6969-6976）（图4A,B）。部分肝切除术如前所述实施（Mitchell和Willenbring,(2008)Nat.Prot.3:1167-1170），所有动物方法由费城儿童医院IACUC批准。N2+供体处理小鼠中的hFIX水平测量在肝切除术后肝再生之后没有变化，表明稳定校正。接受单独N2或Mock+供体的对照小鼠在肝切除术后继续平均值小于15ng/mL（图4A），显著低于接受N2+供体的小鼠（所有时间点下p≤0.004，双尾T检验）。为确保hFIX表达是LP特异性且不由随机供体整合入基因组引起，在小鼠生命第2天用单独AAV-N2(n=8)、AAV-Mock+AAV-供体(n=6)、或AAV-N2+AAV-供体(n=9)(与上述相同的载体剂量)注射缺乏LP转基因的野生型小鼠。接受单独N2、Mock+供体、和N2+供体的小鼠的血浆hFIX水平分别平均小于15、19和27ng/mL，表明接受N2+供体的LP小鼠中大部分hFIX表达来自LP特异性校正（图4C）。
为测定hFIX水平是否足以校正HB表型，在LP/HB小鼠生命第2天注射单独AAV-N2(n=10)、AAV-Mock+AAV-供体(n=9)、或AAV-N2+AAV-供体(n=9)(与上述相同的载体剂量)。接受单独N2的小鼠的血浆hFIX水平再次平均小于15ng/mL。接受Mock+供体的小鼠平均小于25ng/mL，接受N2+供体的小鼠具有显著更高的hFIX水平（相较Mock+供体在所有时间点下p≤0.004，双尾T检验），平均为166-354ng/mL（3-7%的正常循环水平）（图4D）。通过RT-PCR就hFIX mRNA确认肝特异性hFIX表达（图4E）。用RNeasy试剂盒（凯杰公司）和RNase-free DNase（无RNA酶的DNA酶）试剂盒（凯杰公司）从冷冻小鼠组织分离RNA。用iSCRIPT试剂盒（伯乐公司（Bio-Rad））进行cDNA合成。就hFIX转录本进行RT-PCR，使用引物hFIX Gen1 For(ACCAGCAGTGCCATTTCCA,SEQ ID NO:25)和hFIX Gen1Rev(GAATTGACCTGGTTTGGCATCT,SEQ ID NO:26)。
为测试HB表型是否校正，测量活化部分凝血活酶时间（aPTT），这是血友病中显著延长的纤维蛋白凝块形成的动力学量度。通过1:1:1混合样品血浆与收集的HB人血浆和aPTT试剂来进行aPTT。凝块形成通过加入25mM氯化钙来起始。通过尾出血9:1到柠檬酸钠中来获得aPTT的血浆。野生型小鼠(n=5)和HB小鼠(n=12)的平均aPTT分别是36秒和67秒（图4F）。接受Mock+供体(n=3)的小鼠平均为60秒，而接受N2+供体(n=5)的小鼠具有显著缩短的aPTT，平均为44秒（相较Mock+供体p=0.0014，双尾T检验）（图4F）。
实施例5：改造的核酸酶和供体在成年动物中的体内共递送
然后，成年动物在人F.IX LP处接受基因组编辑，如上就新生儿所述。成年LP小鼠通过在6周时I.V.注射1e11v.g./小鼠的单独AAV-N2(‘单独ZFN’)、1e11v.g./小鼠的AAV-N2和5.5e11v.g./小鼠的AAV-供体(‘ZFN+供体’)、或1e11v.g./小鼠的AAV-Mock和5.5e11v.g.AAV-供体(‘Mock+供体’)来处理。图5A所示数据代表每组约20只小鼠的3次实验。这些实验中，野生型hF.IX水平约为1000ng/mL。类似地，图5B显示成年LP小鼠在6周龄I.V.注射1e11v.g./小鼠的单独AAV-N2(‘ZFN单独’)、1e11v.g./小鼠的AAV-N2和5.5e11v.g./小鼠的AAV-供体(‘ZFN+供体’)、或1e11v.g./小鼠的AAV-Mock和5.5e11v.g.AAV-供体(‘Mock+供体’)后的血浆hFIX水平。注射后2天，对图5B中的组给予部分肝切除术。所示数据代表每组约20只小鼠的3次实验。这些实验中，野生型hF.IX水平约为1000ng/mL。数据显示在有或没有后继部分肝切除术情况下给予成年小鼠时，hF.IX表达稳定，以及能在成年动物中进行基因组编辑。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物在此通过引用全文纳入本文。
尽管通过说明和举例方式相当详细地提供了本公开以用于清晰理解目的，本领域技术人员清楚了解可实施多种改变和修改而不偏离本公开精神或范围。因此，上面的描述和实施例不应构成限制。

Claims (15)

1.一种含有经改造的锌指蛋白DNA结合域的蛋白，其中所述DNA结合域包含4或5个锌指识别区，所述锌指识别区从N末端到C末端排序为F1-F4或F1-F5，且其中
(i)当所述DNA结合域包含5个锌指识别区时，F1-F5包含下列氨基酸序列：
F1:QSGDLTR(SEQ ID NO:4)
F2:RSDVLSE(SEQ ID NO:5)
F3:DRSNRIK(SEQ ID NO:6)
F4:RSDNLSE(SEQ ID NO:7)
F5:QNATRIN(SEQ ID NO:8);
(ii)当所述DNA结合域包含4个锌指识别区时，F1-F4包含下列氨基酸序列：
F1:RSDSLSV(SEQ ID NO:10)
F2:TSGHLSR(SEQ ID NO:11)
F3:RSDHLSQ(SEQ ID NO:12)
F4:HASTRHC(SEQ ID NO:13)。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白还包含野生型或改造的切割结构域或切割半结构域。
3.一种编码权利要求1或2所述蛋白的多核苷酸。
4.一种包含权利要求1或2所述蛋白或者权利要求3所述多核苷酸的分离细胞。
5.一种治疗对象中B型血友病的方法，所述方法包含
使用至少一种锌指核酸酶将编码功能性IX因子（FIX）蛋白的序列整合入细胞基因组，其中所述对象包含所述细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述序列整合入内源基因。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述内源基因选自下组：FIX基因和安全港基因。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是肝细胞且所述序列通过静脉内给予正常动物肝脏、腹膜内给予、直接注入肝实质、注入肝动脉、或经胆管树逆行注射来递送给细胞。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含对对象实施部分肝切除术的步骤和/或还包含用至少一种第二试剂处理所述对象的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二试剂选自伽马辐照、紫外辐照、氚化核苷酸、顺铂、依托泊苷、羟基脲、阿非迪霉素、泼尼松龙、腺病毒和其组合。
11.如权利要求5-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是分离细胞且所述方法还包含将所述分离细胞给予所述对象。
12.如权利要求5-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象选自下组：胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、青少年或成年。
13.如权利要求5-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含将所述序列、锌指核酸酶、编码锌指核酸酶的多核苷酸或其组合与特异性结合细胞表面受体的归巢剂相连。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述归巢剂包含半乳糖或AAV外壳蛋白与半乳糖的杂合物。
15.如权利要求8-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自下组：人细胞、非人灵长类细胞、啮齿类细胞、兔类细胞、食肉类细胞和偶蹄类细胞、和干细胞如胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、肝细胞或肝干细胞。
CN201180059911.6A 2010-10-12 2011-10-12 治疗b型血友病的方法和组合物 Active CN103270046B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39233310P 2010-10-12 2010-10-12
US61/392,333 2010-10-12
PCT/US2011/056020 WO2012051343A1 (en) 2010-10-12 2011-10-12 Methods and compositions for treating hemophilia b

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103270046A true CN103270046A (zh) 2013-08-28
CN103270046B CN103270046B (zh) 2016-05-11

Family

ID=45938707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180059911.6A Active CN103270046B (zh) 2010-10-12 2011-10-12 治疗b型血友病的方法和组合物

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9175280B2 (zh)
EP (1) EP2627665B1 (zh)
JP (1) JP6018069B2 (zh)
KR (1) KR101930711B1 (zh)
CN (1) CN103270046B (zh)
AU (1) AU2011316575B2 (zh)
BR (1) BR112013008881B1 (zh)
CA (1) CA2814143C (zh)
ES (1) ES2562421T3 (zh)
HK (1) HK1185623A1 (zh)
RU (1) RU2608643C2 (zh)
WO (1) WO2012051343A1 (zh)
ZA (1) ZA201302625B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105506106A (zh) * 2015-12-30 2016-04-20 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测fix基因全外显子的方法和引物
CN109385425A (zh) * 2018-11-13 2019-02-26 中山大学 一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在β血红蛋白病中的应用
CN110997924A (zh) * 2017-06-15 2020-04-10 株式会社图尔金 用于在肝中表达感兴趣的蛋白的平台
CN111330021A (zh) * 2013-12-09 2020-06-26 桑格摩生物科学股份有限公司 基因组工程化的方法和组合物
CN111526720A (zh) * 2017-10-24 2020-08-11 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗罕见病的方法和组合物

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100256062A1 (en) 2004-12-06 2010-10-07 Howard Tommy E Allelic Variants of Human Factor VIII
CN108117586A (zh) 2010-08-10 2018-06-05 洛桑聚合联合学院 红细胞结合性治疗剂
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
CN103917644A (zh) 2011-09-21 2014-07-09 桑格摩生物科学股份有限公司 调控转基因表达的方法和组合物
CA2864879C (en) * 2012-02-17 2021-07-20 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
HUE041553T2 (hu) 2012-07-11 2019-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Lizoszomális tárolási betegségek (LSD) kezelése és génterápia
US9255250B2 (en) 2012-12-05 2016-02-09 Sangamo Bioscience, Inc. Isolated mouse or human cell having an exogenous transgene in an endogenous albumin gene
WO2014089541A2 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Haplomics, Inc. Factor viii mutation repair and tolerance induction
US20160045575A1 (en) * 2012-12-07 2016-02-18 Tom E. HOWARD FACTOR VIII MUTATION REPAIR AND TOLERANCE INDUCTION AND RELATED cDNAs, COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
EP2931892B1 (en) 2012-12-12 2018-09-12 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
ES2658401T3 (es) 2012-12-12 2018-03-09 The Broad Institute, Inc. Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
ES2777217T3 (es) 2013-06-17 2020-08-04 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias
KR20160030187A (ko) 2013-06-17 2016-03-16 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 간의 표적화 및 치료를 위한 ＣＲＩＳＰＲ­Ｃａｓ 시스템, 벡터 및 조성물의 전달 및 용도
WO2014204725A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011034B1 (en) 2013-06-17 2019-08-07 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105899665B (zh) * 2013-10-17 2019-10-22 桑格摩生物科学股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物
KR20160089527A (ko) * 2013-12-12 2016-07-27 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 게놈 편집을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료적 응용
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
WO2015089354A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
JP6744227B2 (ja) 2014-02-21 2020-08-19 エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） 糖標的化治療剤
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
JP6606088B2 (ja) 2014-02-24 2019-11-13 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物
US9624498B2 (en) 2014-03-18 2017-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
AU2015231231B2 (en) 2014-03-21 2021-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing without nucleases
CA2951882A1 (en) * 2014-06-11 2015-12-17 Tom E. HOWARD Factor viii mutation repair and tolerance induction and related cdnas, compositions, methods and systems
ES2856090T3 (es) 2014-09-24 2021-09-27 Hope City Variantes de vectores de virus adenoasociados para la edición genómica de alta eficacia y sus métodos
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
CN108064280B (zh) 2015-01-06 2021-10-29 延世大学校产学协力团 利用以凝血因子viii基因为靶的核酸内切酶的a型血友病治疗用组合物
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
AU2016280893B2 (en) 2015-06-18 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR enzyme mutations reducing off-target effects
BR112018008519A2 (pt) 2015-10-28 2018-11-06 Sangamo Therapeutics Inc construtos específicos de fígado, cassetes de expressão de fator viii e métodos de uso dos mesmos
CA3004349A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
WO2018049009A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US11046969B2 (en) * 2017-05-24 2021-06-29 Epiplanta Biotech Ltd. Transgenic plant and the method for producing the same
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
WO2018232176A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
US20220192163A1 (en) * 2019-03-26 2022-06-23 Toolgen Incorporated Hemophilia b rat model

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998041240A1 (en) * 1997-03-14 1998-09-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for use in gene therapy for treatment of hemophilia
WO2005100392A2 (en) * 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
WO2006094106A2 (en) * 2005-02-28 2006-09-08 Sangamo Biosciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789538A (en) 1904-11-11 1905-05-09 Colin E Ham Dumb-bell.
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
CA2181548C (en) 1994-01-18 2009-11-03 Carlos F. Barbas, Iii Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
USRE45795E1 (en) 1994-08-20 2015-11-10 Gendaq, Ltd. Binding proteins for recognition of DNA
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
WO1998009524A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Chiron Corporation Methods and compositions for liver specific delivery of therapeutic molecules using recombinant aav vectors
WO1998024479A1 (en) 1996-12-02 1998-06-11 Cell Genesys, Inc. Adeno-associated viral vector-mediated delivery of dna to cells of the liver
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
ATE309536T1 (de) 1999-12-06 2005-11-15 Sangamo Biosciences Inc Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
DE10005183A1 (de) 2000-02-05 2001-08-09 Bosch Gmbh Robert Gleichrichteranordnung
WO2001059450A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US20030044787A1 (en) 2000-05-16 2003-03-06 Joung J. Keith Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
CA2436807A1 (en) * 2001-02-05 2002-08-15 Novo Nordisk Health Care Ag Combined use of factor vii polypeptides and factor viii polypeptides
GB0108491D0 (en) * 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
CA2474486C (en) 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
EP3222715A1 (en) 2003-08-08 2017-09-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CA2561714A1 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating neuropathic and neurodegenerative conditions
CA2579677A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
CA2607104A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences
KR101419729B1 (ko) 2005-07-26 2014-07-17 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현
WO2007139898A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
WO2007139982A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
PL2049663T3 (pl) 2006-08-11 2015-08-31 Dow Agrosciences Llc Homologiczna rekombinacja za pośrednictwem nukleazy z palcami cynkowymi
CN101679977B (zh) 2007-04-26 2013-05-01 桑格摩生物科学股份有限公司 向ppp1r12c基因座的靶向整合
KR101510778B1 (ko) * 2007-07-12 2015-04-10 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물
CA2700231C (en) 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
EP2281050B1 (en) 2008-04-14 2014-04-02 Sangamo BioSciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
KR101803737B1 (ko) 2008-12-04 2017-12-01 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 랫트의 유전체 편집
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
CA2756833C (en) 2009-04-09 2019-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
US20120192298A1 (en) * 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
CA2788560A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
EP2571512B1 (en) 2010-05-17 2017-08-23 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998041240A1 (en) * 1997-03-14 1998-09-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for use in gene therapy for treatment of hemophilia
WO2005100392A2 (en) * 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
WO2006094106A2 (en) * 2005-02-28 2006-09-08 Sangamo Biosciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K.A. HIGH: "Update on Progress and Hurdles in Novel Genetic Therapies for Hemophila", 《HEMATOLOGY》, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 466 - 472, XP055082918, DOI: 10.1182/asheducation-2007.1.466 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111330021A (zh) * 2013-12-09 2020-06-26 桑格摩生物科学股份有限公司 基因组工程化的方法和组合物
CN105506106A (zh) * 2015-12-30 2016-04-20 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测fix基因全外显子的方法和引物
CN110997924A (zh) * 2017-06-15 2020-04-10 株式会社图尔金 用于在肝中表达感兴趣的蛋白的平台
CN111526720A (zh) * 2017-10-24 2020-08-11 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗罕见病的方法和组合物
CN109385425A (zh) * 2018-11-13 2019-02-26 中山大学 一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在β血红蛋白病中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012051343A1 (en) 2012-04-19
EP2627665A1 (en) 2013-08-21
ZA201302625B (en) 2014-05-28
US9175280B2 (en) 2015-11-03
US9629930B2 (en) 2017-04-25
BR112013008881A2 (pt) 2016-06-28
JP2013544077A (ja) 2013-12-12
CA2814143A1 (en) 2012-04-19
CN103270046B (zh) 2016-05-11
AU2011316575B2 (en) 2015-10-29
AU2011316575A1 (en) 2013-05-02
HK1185623A1 (zh) 2014-02-21
KR20140042764A (ko) 2014-04-07
RU2013120986A (ru) 2014-11-20
JP6018069B2 (ja) 2016-11-02
ES2562421T3 (es) 2016-03-04
CA2814143C (en) 2020-09-08
RU2608643C2 (ru) 2017-01-23
US20120128635A1 (en) 2012-05-24
EP2627665A4 (en) 2014-02-26
KR101930711B1 (ko) 2018-12-19
EP2627665B1 (en) 2015-12-16
US20160022838A1 (en) 2016-01-28
BR112013008881B1 (pt) 2021-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103270046B (zh) 治疗b型血友病的方法和组合物
US11634463B2 (en) Methods and compositions for treating hemophilia
JP6587666B2 (ja) リソソーム貯蔵疾患の処置のための方法および組成物
JP6606088B2 (ja) ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物
JP6188703B2 (ja) Ｈｐｒｔ遺伝子座を修飾するための方法および組成物
CN103917644A (zh) 调控转基因表达的方法和组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant