CN103266149A - 双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，以蔗糖溶液为底物，往底物中同时加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，构成双酶与蔗糖的反应体系；反应产物经过由超滤膜与纳滤膜组成的多级膜系统分离后，直接在超滤膜分离阶段获得药用右旋糖酐，并在末级纳滤膜分离中获得高纯度果糖溶液，第一级超滤膜的截留液中所含的酶和大分子右旋糖酐则返回双酶与蔗糖的反应体系，重新参与反应，实现酶的循环利用。本发明成本较低、绿色环保、安全高效、操作简单，实现了定向调控生产高质量的目标分子量药用右旋糖酐，同时获得高纯度、高附加值的果糖副产物。

Description

双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法

技术领域

本发明涉及生物制药与生物质分离领域，尤其涉及一种双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法。

背景技术

右旋糖酐是由细菌(如肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))产生的胞外多糖，其主链是由D-葡萄糖单元以α(1→6)糖苷键连接而成。不同分子量的右旋糖酐在临床上有多种用途，如作为血浆代用品、疏通微血管、防治血栓等。《中国药典》（2010版）收录了包括Dex-70（平均分子量约7万）、Dex-40（平均分子量约4万）、Dex-20（平均分子量约2万）三种右旋糖酐及其衍生药物共12种。目前国内制备右旋糖酐大多采用“菌种发酵—乙醇沉淀—盐酸水解—乙醇分级沉淀”的工艺，产品含有氯化物等杂质，且分子量分布较广，导致临床使用时发生过敏反应，给患者带来较大风险，限制了右旋糖酐的推广使用。

果糖是最甜的天然糖，对糖尿病人而言，果糖又是一种安全系数更高的糖，其产生的血糖指数约为葡萄糖的20%，而且果糖具有保湿性等适用于食品工业生产的诸多优点，因而在医药、食品领域被广泛使用。果糖溶解度非常大，且在103～105℃即发生分解，采用传统的热加工法获得结晶果糖的技术难度很大，生产工艺复杂，成本自然也高，这是果糖价格远远高于葡萄糖和蔗糖的主要原因之一。

右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，简称DSase，酶的系统分类号为E.C.2.4.1.5）来源于肠膜明串珠菌等细菌，可作用于底物蔗糖合成右旋糖酐。国内外研究表明，肠膜明串珠菌产生的右旋糖酐蔗糖酶其分子量范围为160～180kDa。右旋糖酐酶（Dextranase，简称Dase，酶的系统分类号为E.C.3.2.1.11）是一种专一性、随机地内切右旋糖酐链中的α(1→6)糖苷键的酶，应用该酶可显著降低右旋糖酐的分子量。国外研究表明，由细丽毛壳菌属所产的右旋糖酐酶其分子量范围为70～90kDa。

膜分离技术是生物质分离领域中的绿色生产过程，可在不引入外源性有害物质的前提下实现目标产物的有效分离。发明人在多级膜分离右旋糖酐方面深入研究表明，膜分离技术可以按分子量的大小对右旋糖酐进行较好的分离和富集，但由于右旋糖酐分子在溶液中成链状或线性展开，较大的分子可以穿透较小的滤膜，所以简单采用滤膜的截留分子量来标定产物分子量分布范围存在一定的误差。而对于酶分子等蛋白质类的非线性分子，膜分离则不存在这一缺点，可直接由滤膜的截留分子量来标定产物分子量分布范围。

菌种发酵法和酶法合成同属于生物法，其反应条件温和，耗能少，特别是酶法合成被广泛誉为高端生物制品工业化生产的首选技术。目前国内已有利用菌种或右旋糖酐蔗糖酶发酵蔗糖先行制备右旋糖酐，然后再加入含右旋糖酶的发酵清液或右旋糖酐酶的方法，以制备不同分子量的右旋糖酐，但其后续产物分离都较复杂，并且使用纱布过滤、乙醇分级沉淀等传统分离方法来精制产品，可能影响药用右旋糖酐的安全使用，制备方法有较大的改进空间。另外，右旋糖酐蔗糖酶与蔗糖的反应在短时间内会迅速生成分子量大于100万的右旋糖酐，尽管该法在蔗糖转化率方面表现突出，但由于右旋糖酐酶的酶解作用是随机的，所以目标产物得率并不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本较低、绿色环保、安全高效、操作简单的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，以实现定向调控生产高质量的目标分子量药用右旋糖酐，同时获得高纯度、高附加值的果糖副产物。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，以蔗糖溶液为底物，往底物中同时加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，构成双酶与蔗糖的反应体系；反应产物经过由超滤膜与纳滤膜组成的多级膜系统分离后，直接在超滤膜分离阶段获得药用右旋糖酐，并在末级纳滤膜分离中获得高纯度果糖溶液，第一级超滤膜的截留液中所含的酶和大分子右旋糖酐则返回双酶与蔗糖的反应体系，重新参与反应。

右旋糖酐蔗糖酶（由肠膜明串珠菌发酵蔗糖产生）和右旋糖酐酶按（商品化酶）酶活力比100:1～10:1混合后共同进行酶的固定化；蔗糖溶液终摩尔浓度为0.01M～0.8M；多级膜系统包括截留分子量逐级递减的第一级超滤膜、第二级超滤膜、第三级超滤膜和末级纳滤膜。

蔗糖溶液终摩尔浓度为0.01M～0.4M（酶可重复利用3次）或0.5～0.8M（酶可重复利用2次）。

第一级超滤膜截留分子量为7万、5万或3万，第二级超滤膜截留分子量为5万或3万，第三级超滤膜截留分子量为3万或1万，末级纳滤膜截留分子量为200。截留分子量5万、3万和1万的超滤膜分离获得的截留液中所含的药用右旋糖酐分别为Dex-70、Dex-40、Dex-20。

反应体系的反应液先经第一级超滤膜分离，一级截留液（含有两种酶和大分子右旋糖酐）返回反应体系，一级透过液经第二级超滤膜分离；二级截留液导出并浓缩干燥得药用右旋糖酐，二级透过液经第三级超滤膜分离；三级截留液导出并浓缩干燥得药用右旋糖酐，三级透过液经末级纳滤膜浓缩分离，末级浓缩液（第一级超滤膜的最终截留液也可并入）经干燥后作为副产物可用于食品、饲料等行业，末级透过液（含高纯度果糖）经减压浓缩成50～60%的果糖浆可用于食品、医药等行业。

反应体系中双酶和底物接触反应时间5～50h，反应温度20～30℃，pH范围5.5～6.8。

第一级超滤膜出口压力为0.03～0.15MPa，第二级超滤膜出口压力为0.05～0.25MPa，第三级超滤膜出口压力为0.05～0.30MPa，末级纳滤膜出口压力为1.5～3.5MPa。

当反应液剩余1/6体积时停止第一级超滤膜操作，当二级截留液达一级透过液的1/6体积时停止第二级超滤膜操作，当三级截留液达二级透过液的2/5体积时停止第三级超滤膜操作，当末级透过液达三级透过液的6/7体积时停止末级纳滤膜操作。

二级或三级截留液在50～80℃温度下进行减压浓缩，再经预冻后利用真空冷冻干燥获得干粉状最终产品，产品水溶性效果好，分子量大小、分子量分布符合药用右旋糖酐要求。

初始反应体系中右旋糖酐蔗糖酶酶量为0.15U/mL～1U/mL；右旋糖酐酶酶量根据双酶比例而定。

针对目前右旋糖酐制备存在的问题，发明人结合生物法（酶法合成）和膜分离两种技术的优势，建立了本发明双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法。该法整个工艺过程无需引入乙醇、盐酸等传统方法中可能导致药用右旋糖酐临床反应的物质，属于绿色生产技术；膜分离是生物质分离中的高新技术，通过改变反应底物浓度、酶量、酶活力比例等参数，以及更换膜组件、控制反应时间等，本发明可直接实现了目标分子量右旋糖酐的定向制备，底物转化率高，产品在分子量、分子量分布等方面都能够精确地进行定向调控，便于工业化推广应用；酶制剂占生产成本比重较大，本发明通过循环利用含酶截留液和调节底物浓度，使酶可重复利用多次以降低生产成本，并且同时加入双酶更利于产物中右旋糖酐分子量的调控；同时，本发明获得了高纯度、高附加值的果糖，使纳滤技术为高纯度果糖生产提供了新思路；而另一类副产物主要由分子量小于1万的低聚糖组成，也被当作一种潜在的生物质原料得以处理。

附图说明

图1是本发明双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

右旋糖酐蔗糖酶系经肠膜明串珠菌发酵，发酵液经12,000r/min、4℃条件下离心20min后，取上清液而得，酶活力由DNS法检测而得。右旋糖酐酶来源于阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司，根据天野公司提供的酶活力测定方法并结合本发明的实际情况而对测定条件略作修改，测定右旋糖酐酶的酶活力。经测定，右旋糖酐蔗糖酶酶活力为5U/mL，右旋糖酐酶的酶活力为22,000U/mL。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.6M、且酶的终浓度分别为0.5U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.05U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为10:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为28℃，pH为6.0。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为5万的超滤膜组件，以全回流方式运行23h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）、第三级截留分子量为1万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.30MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～3.0MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达90%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为39720，D值为1.21；第三级超滤膜所得产品分子量为17993，D值为1.17。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达96%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例2

右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的获得与酶活力测定同实施例1。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.4M、且酶的终浓度分别为0.5U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.05U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为10:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为24℃，pH为6.3。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为5万的超滤膜组件，以全回流方式运行38h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）、第三级截留分子量为1万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.30MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～3.2MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达93%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为38670，D值为1.23；第三级超滤膜所得产品分子量为18720，D值为1.21。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达95%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例3

右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的获得与酶活力测定同实施例1。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.2M、且酶的终浓度分别为0.5U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.05U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为10:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为25℃，pH为6.5。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为7万的超滤膜组件，以全回流方式运行18h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为5万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.20MPa）、第三级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～2.8MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达94%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为71063，D值为1.25；第三级超滤膜所得产品分子量为41460，D值为1.13。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达93%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例4

右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的获得与酶活力测定同实施例1。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.1M、且酶的终浓度分别为0.5U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.05U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为10:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为26℃，pH为6.4。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为5万的超滤膜组件，以全回流方式运行8h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）、第三级截留分子量为1万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.30MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～3.0MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达96%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为35590，D值为1.14；第三级超滤膜所得产品分子量为20190，D值为1.28。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达93%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例5

右旋糖酐蔗糖酶系经肠膜明串珠菌发酵，发酵液经12,000r/min、4℃条件下离心20min后，取上清液而得，酶活力由DNS法检测而得。右旋糖酐酶来源于阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司，根据天野公司提供的酶活力测定方法并结合本发明的实际情况而对测定条件略作修改，测定右旋糖酐酶的酶活力。经测定，右旋糖酐蔗糖酶酶活力为8.5U/mL，右旋糖酐酶的酶活力为22,000U/mL。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.8M、且酶的终浓度分别为1U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.1U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为10:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为20℃，pH为5.5。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为7万的超滤膜组件，以全回流方式运行16h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为5万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.20MPa）、第三级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～2.5MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达90%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为72610，D值为1.25；第三级超滤膜所得产品分子量为34570，D值为1.26。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达95%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例6

右旋糖酐蔗糖酶系经肠膜明串珠菌发酵，发酵液经12,000r/min、4℃条件下离心20min后，取上清液而得，酶活力由DNS法检测而得。右旋糖酐酶来源于阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司，根据天野公司提供的酶活力测定方法并结合本发明的实际情况而对测定条件略作修改，测定右旋糖酐酶的酶活力。经测定，右旋糖酐蔗糖酶酶活力为6.8U/mL，右旋糖酐酶的酶活力为22,000U/mL。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.2M、且酶的终浓度分别为0.3U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.006U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为50:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为28℃，pH为6.8。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为7万的超滤膜组件，以全回流方式运行42h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为5万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.20MPa）、第三级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～2.5MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达90%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为73720，D值为1.24；第三级超滤膜所得产品分子量为39330，D值为1.22。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达96%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例7

右旋糖酐蔗糖酶系经肠膜明串珠菌发酵，发酵液经12,000r/min、4℃条件下离心20min后，取上清液而得，酶活力由DNS法检测而得。右旋糖酐酶来源于阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司，根据天野公司提供的酶活力测定方法并结合本发明的实际情况而对测定条件略作修改，测定右旋糖酐酶的酶活力。经测定，右旋糖酐蔗糖酶酶活力为5.5U/mL，右旋糖酐酶的酶活力为22,000U/mL。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.2M、且酶的终浓度分别为0.5U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.005U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为100:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为20℃，pH为5.6。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为7万的超滤膜组件，以全回流方式运行24h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为5万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.20MPa）、第三级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～2.5MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达93%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为73370，D值为1.28；第三级超滤膜所得产品分子量为40190，D值为1.32。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达94%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

实施例8

右旋糖酐蔗糖酶系经肠膜明串珠菌发酵，发酵液经12,000r/min、4℃条件下离心20min后，取上清液而得，酶活力由DNS法检测而得。右旋糖酐酶来源于阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司，根据天野公司提供的酶活力测定方法并结合本发明的实际情况而对测定条件略作修改，测定右旋糖酐酶的酶活力。经测定，右旋糖酐蔗糖酶酶活力为5.5U/mL，右旋糖酐酶的酶活力为22,000U/mL。

用无菌水配制1M的蔗糖溶液作为底物母液，然后按底物终浓度为0.1M、且酶的终浓度分别为0.15U/mL（右旋糖酐蔗糖酶）、0.015U/mL（右旋糖酐酶）的量加入两种酶液（即保持反应体系中右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活力之比为10:1），反应液的配制采用无菌水稀释法，一次反应液配制4L。反应温度为25℃，pH为6.6。反应液置于膜分离前端的料筒，启动第一级截留分子量为5万的超滤膜组件，以全回流方式运行26h后调节出口压力为0.03～0.15MPa（约5～15psi，或使膜分离以回流比为0.6的模式运行），并依次开启第二级截留分子量为3万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.20MPa）、第三级截留分子量为1万的超滤膜组件（出口压力为0.05～0.25MPa）以及截留分子量为200的纳滤膜组件（出口压力为1.5～2.5MPa），开始收集目标产物。待料筒溶液约为初始体积的1/6时停止第一级膜的操作；待第二级膜分离截留液体积达到第一级透过液的1/6时停止第二级超滤膜的操作；当第三级膜分离截留液体积达到第二级透过液的2/5时，停止第三级超滤膜的操作；当纳滤膜分离的透过液体积达到第三级超滤膜透过液体积的6/7时停止纳滤操作。对料筒剩余反应液用HPGPC测定并分析，显示蔗糖转化率达88%以上。把第二级、第三级超滤膜分离所得的截留液经减压浓缩后预冻至－30℃以下，在对其进行真空冷冻干燥获得干粉状右旋糖酐，对该产品进行高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，结果显示，从第二级超滤膜分离的截留液而得的右旋糖酐重均分子量为35640，D值为1.38；第三级超滤膜所得产品分子量为16990，D值为1.26。纳滤膜分离所得的透过液经减压浓缩成50～60%的糖浆后，利用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度，结果显示，果糖纯度达90%以上。纳滤膜所得浓缩液经干燥、粉碎后装袋存放。

Claims (10)

1.一种双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：以蔗糖溶液为底物，往底物中同时加入右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶，构成双酶与蔗糖的反应体系；反应产物经过由超滤膜与纳滤膜组成的多级膜系统分离后，直接在超滤膜分离阶段获得药用右旋糖酐，并在末级纳滤膜分离中获得高纯度果糖溶液，第一级超滤膜的截留液中所含的酶和大分子右旋糖酐则返回双酶与蔗糖的反应体系，重新参与反应。

2.根据权利要求1所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶按酶活力比100:1～10:1混合后共同进行酶的固定化；所述蔗糖溶液终摩尔浓度为0.01M～0.8M；所述多级膜系统包括截留分子量逐级递减的第一级超滤膜、第二级超滤膜、第三级超滤膜和末级纳滤膜。

3.根据权利要求2所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述蔗糖溶液终摩尔浓度为0.01M～0.4M或0.5～0.8M。

4.根据权利要求3所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述第一级超滤膜截留分子量为7万、5万或3万，第二级超滤膜截留分子量为5万或3万，第三级超滤膜截留分子量为3万或1万，末级纳滤膜截留分子量为200。

5.根据权利要求4所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述反应体系的反应液先经第一级超滤膜分离，一级截留液返回反应体系，一级透过液经第二级超滤膜分离；二级截留液导出并浓缩干燥得药用右旋糖酐，二级透过液经第三级超滤膜分离；三级截留液导出并浓缩干燥得药用右旋糖酐，三级透过液经末级纳滤膜浓缩分离，末级浓缩液经干燥后作为副产物，末级透过液经减压浓缩成50～60%的果糖浆。

6.根据权利要求5所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述反应体系中双酶和底物接触反应时间5～50h，反应温度20～30℃，pH范围5.5～6.8。

7.根据权利要求6所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述第一级超滤膜出口压力为0.03～0.15MPa，第二级超滤膜出口压力为0.05～0.25MPa，第三级超滤膜出口压力为0.05～0.30MPa，末级纳滤膜出口压力为1.5～3.5MPa。

8.根据权利要求7所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：当反应液剩余1/6体积时停止第一级超滤膜操作，当二级截留液达一级透过液的1/6体积时停止第二级超滤膜操作，当三级截留液达二级透过液的2/5体积时停止第三级超滤膜操作，当末级透过液达三级透过液的6/7体积时停止末级纳滤膜操作。

9.根据权利要求8所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述二级或三级截留液在50～80℃温度下进行减压浓缩，再经预冻后利用真空冷冻干燥获得干粉状最终产品。

10.根据权利要求9所述的双酶耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，其特征在于：所述反应体系中右旋糖酐蔗糖酶酶量为0.15U/mL～1U/mL。

Images