CN103265509A - 一种真空度调控辅助提取穿心莲活性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真空度调控辅助提取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的方法：将穿心莲置于封闭的提取容器中，以含水的乙醇为提取溶剂，调控体系真空度为0.2-0.6，提取溶剂与穿心莲的重量比为5-20:1，提取1次，提取时间10-40min，趁热过滤，滤液浓缩。与常规回流提取比较，本发明所述提取方法能显著提高穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的提取率，同时极大地缩短提取时间、减少电能和溶剂消耗。且本发明所述的真空范围，企业现有的生产条件都能满足，无需对设备进行大规模的改造，且不涉及制备方法的差异，本发明提取方法，工艺简单、成本低廉，对保护环境具有积极意义，可大规模应用生产。

Description

一种真空度调控辅助提取穿心莲活性成分的方法

技术领域

 本发明属于植物化学领域，具体涉及新的一种穿心莲活性成分的提取方法。

背景技术

穿心莲（Andrographis paniculata），又名一见喜，为爵床科穿心莲属植物穿心莲的地上部分，性味苦寒，归心、肺、大肠、膀胱经；具有清热解毒、凉血、消肿等功效。临床主要用于感冒发热，咽喉肿痛等证，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物。

穿心莲的活性成分主要是穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯，结构式分别如1和2所示。药理实验显示其具有祛热解毒、消炎抗菌、抗病毒、抗癌等功效。以穿心莲内酯或脱水穿心莲内酯及其衍生物制成的药物，如穿心莲内酯片、穿琥宁注射液、炎琥宁注射液等已在临床上得到广泛应用。

穿心莲内酯类成分属二萜内酯类化合物：内酯环在偏酸或偏碱条件下不稳定，易水解开环，异构化，影响稳定性。而且，内酯类成分均难溶于水，根据相似相溶原理，目前对穿心莲内酯类成分的传统提取方法主要是乙醇回流提取法，比如中国药典（2010版，一部，P964-965）收载的热回流方法。但文献报道药典提取方法因长时间加热，穿心莲内酯极易损失，可见避免热处理和缩短热处理时间是减少有效成分损失的关键因素（《穿心莲片生产过程中脱水穿心莲内酯的含量变化》,黄晓丹,苏子仁,赖小平等；中国中药杂志, 2002, 27(12):911-913）。

此外，中国专利申请（公开号CN1042077）公开了一种碱水提取法，依据内酯的开环-环合反应针对性地提取内酯类成分。此提取方法对提取过程PH值的控制要求较高，不易操作。

一些新型的提取技术，如酶辅助提取、超声辅助提取、微波辅助提取等技术对穿心莲提取工艺优化也有见报道；但普遍存在仪器设备费用高昂，需报批变更生产工艺、安全性能不佳等因素限制，并没有在实际生产中得到大规模的推广运用。

因此，有必要开发出一种适合工业生产的、提高穿心莲提取效率、尽可能避免穿心莲有效成分被分解破坏的提取方法。本发明立足于对体系真空度进行调控，具有简便、灵敏，对提取设备没有特殊要求，适合工业生产等优点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种适合工业生产的真空度调控辅助提取穿心莲活性成分的方法。本发明所述方法克服了传统乙醇回流加热时间长、穿心莲内酯类成分长时间受热易分解的缺点。因为在真空状态下，可加速植物细胞壁的破裂，使细胞内有效成分得以快速溶出，促进提取传质过程的运行，提高提取效率，实现快速提取，即保护了药效成分，避免其降解损失，又缩短提取时间，节约能源。另一方面本发明所述方法对温度没有特殊要求，只要在所述真空度下保持提取溶剂沸腾即可，不需对现有的提取设备进行大规模改造，适合工业生产。

为解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

一种真空度调控辅助提取穿心莲活性成分的方法，将穿心莲置于封闭的提取容器中，以含水的乙醇为提取溶剂，提取溶剂与穿心莲的重量比为5-20:1，调控体系的真空度为0.2-0.6，加热，保持所述提取溶剂沸腾，提取1次，提取时间10-40 min，趁热过滤，滤液浓缩。

优选的，所述提取体系的真空度为0.2-0.4。

优选的，所述提取溶剂中乙醇的体积百分比为50%-90%，更优选的，所述提取溶剂中乙醇的体积百分比为50%-70%。

优选的，所述提取时间为10-25min。

优选的，所述提取溶剂与穿心莲的重量比为10-15:1。

优选的，穿心莲药材不粉碎。

本发明提供的一个优选实施例，其中，穿心莲药材不粉碎，置于封闭的提取容器中，以含水的乙醇为提取溶剂，所述提取溶剂中乙醇体积百分比为55%，所述提取溶剂与穿心莲的重量比为12:1，真空度0.2，加热，保持所述提取溶剂沸腾，提取1次，提取时间16 min，趁热过滤，滤液浓缩。

为了使提取更加充分，尽可能多地转移活性成分，优选的，本发明所述方法，还包括提取结束，过滤后，再用2-8倍药材重量的所述提取溶剂清洗药渣，洗液与所述滤液合并。

本发明以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为指标成分，利用响应面法优化穿心莲真空度调控提取工艺，具体研究过程如下：

1.      仪器与材料：

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），KDM型调温电热套（山东城华鲁电热仪器厂），TG328A型十万分之一电子天平（德国Startorius公司），Vacuum controller V850型减压提取设备（瑞士BUCHI公司），PD862-4型单相电能表（精益集团百德尔电表有限公司）。

穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品均为中国药品生物制品检定所购置，水为双蒸水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2.      方法与结果：

（1）穿心莲的提取：

a. 真空度调控提取方法：

准确称取穿心莲药材10 g，放入减压提取的三口瓶中，按实验方案设置好体系的真空度、提取时间，水浴温度，加入定量的提取溶剂后提取。趁热过滤，以提取溶剂洗涤药渣，合并提取液，冷却至室温，容量瓶中定容。

b. 常规回流提取方法

记载于2010版中国药典，穿心莲片的提取制备工艺：85%乙醇热浸提2次，每次2 h，合并提取液，滤过后冷却至室温，容量瓶中定容。

（2）穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量测定

取定容后的穿心莲提取液各3 ml， 8000转/min离心10 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，待测。

采用HPLC测定穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的含量。

色谱条件：

色谱柱：Agilent C¹⁸柱，4.6 mm × 250 mm，5 μm；

流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）梯度洗脱：0-20min，25%-50%A；20-25min，50%-100%A；

流速：1 mL·min^-1；

柱温：30℃；

进样量10 μL；

检测波长：254 nm。

在上述色谱条件下，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯色谱峰与其他色谱峰实现基线分离；阴性试验结果表明阴性无干扰，HPLC色谱图见图1。方法学考察结果显示此条件适用于穿心莲中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量测定。

利用如下公式，计算穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯真空度调控提取相对常规回流提取的相对提取率。

相对提取率=(C_测× n × V_样)/(M_药材× M_回流) × 100% 

浸膏收率=（提取物总重量/原药材总重量）× 100%

C_测为测定样品中穿心莲内酯或脱水穿心莲内酯的浓度，n 为稀释倍数，V_样为提取液浓缩定容体积，M_药材为药材称取量，M_回流为所述常规回流提取方法所得穿心莲内酯或脱水穿心莲内酯的含量。

（3）Box-Behnken效应面试验

Box-Behnken试验方法既能考察各个因素对响应值（穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的相对提取率和浸膏收率）的影响及各影响因素间交互作用，也能进行各个因素的最优化，建立数学模型并作出相应的三维应变量曲面图，对因素与指标的关系进行直观的量化分析。

①. Box-Behnken设计因子的水平范围的限定

选用真空度、提取溶剂中乙醇的体积百分比、提取时间为因素，以穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的相对提取率、浸膏收率为响应值，进行Box-Behnken设计-效应面优化实验，并采用Design expert 7.1软件对实验数据，进行拟合分析。每一自变量的低、中、高3种试验水平分别以-1，0，1进行编码，各自变量的编码见表1。

表1  穿心莲减压提取工艺Box-Behnken设计因素水平

②. Box-Behnken试验设计及结果

以穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯相对提取率和干浸膏得率为响应值，考察真空度（X1）、乙醇体积百分比（X2）、提取时间（X3）3个因素对其的影响，采用Box-Behnken设计，共17个试验点，其中12个为析因点；5个为零点（中心点重复实验），用于考察模型的误差。Box-Behnken实验设计及响应值如表2所示。

表2穿心莲减压提取工艺Box-Behnken设计实验安排

③. 二次响应面模型拟合

按照Box-Behnken实验设计的统计学要求，实验模型通过最小二乘法拟合二次多项式方程可以表达为：

Y＝b ₀ ＋

＋

＋

其中，Y为响应值，b ₀ 为常数项，b _i 为编码变量X _i 的斜率或线性效应，b _ii 为X _i 二次效应，b _ij 为X _i 和X _j 之间的交互效应。

多项式模型方程拟合的性质由确定系数R²表达，其统计学上的显著性由F值检验；采用Design expert 7.1软件分析。Box-Behnken实验所得回归方程见式1、2、3。

式1：

穿心莲内酯相对提取率（%）=86.44-44.03X1-24.48X2-1.89X3+7.95X1X2+6.59X1X3-0.61X2X3-12.8X1²+4.81X2²-2.56X3²  ，(R²=0.9650)

式2：

脱水穿心莲内酯相对提取率（%）=85.60-36.02X1-22.89X2+2.32X3+3.61X1X2+4.47X1X3-3.03X2X3-13.24X1²+1.72X2²-0.65X3²，(R²=0.9577)

式3：

浸膏收率（%）=6.78-1.72X1-2.53X2+0.51X3-0.32X1X2+0.11X1X3-0.062X2X3-0.5X1²-0.75X2²+0.44X3²，(R²=0.9975)

其中，X1为体系真空度、X2为乙醇体积百分比、X3为提取时间。

为了更好的预测实验结果的可靠性，分别对回归模型的显著性、各变量的模型拟合参数、以及失拟项进行测试。一般而言，F值或P值能够对各因素变量的显著性进行排序：F值幅度越大，则P值越小，该变量相应的系数就越显著。各响应值的二阶响应面模型方差分析结果见表3。

表3穿心莲减压提取工艺Box-Behnken模型回归方程的方差分析

表3实验结果表明，各响应值的二次响应面模型P值分别为0.0003，0.0005，0.0001，达到极显著水平。失拟项的F值分别为1.15、0.43、1.56均大于0.05，说明其相对于纯误差而言不显著。也就是说，失拟项的F值由于噪音偏离的可能性分别为43.16%、74.07%、33.11%；说明本回归模型建立成功。

④. 响应值优化与预测：

渴求函数的优点在于有效地解决了相互矛盾的优选指标的优化问题。本试验应用了Design-Expert 7软件中的Derringer渴求函数进行响应值优化。选择综合效果最佳的各因子水平作为最优化条件。在这种方法中，先将需优化的每一个响应值都赋予一定的权重系数(r_i)，r_i的值最小为1(+)，最大为5 ( + + + + + )。当不同的响应值赋予不同的权重系数时，渴求函数可用式4表达 :

式4：

其中，d_i为从每个实验的响应值转化而得的各个响应值的部分渴求函数，n是需要优化响应值的数目，r_i代表每个响应值的权重系数。

优化目的是使指标性成分提取率最大，保证药效成分的高转移率的同时，减少杂质组分的溶出，提高药效，所以干浸膏得率应尽可能小。在软件中设定的优化条件见表4。通过软件的处理，预测出这些因素的最佳水平为真空度0.2，乙醇体积百分比55%，提取时间16 min。此条件下，穿心莲内酯的预测相对提取率为148.37%，脱水内酯为128.96%，浸膏收率为9.12%。

表4   优化时设定响应值及因素水平

指标	目标	下限	上限	权重系数
					穿心莲内酯相对提取率（%）	最大值	59.85	148.37	5
脱水穿心莲内酯相对提取率（%）	最大值	56.39	132.37	5
					浸膏收率	最小值	2.87	9.94	3

⑤. 响应面分析

由权重系数优化后的响应面数据进行分析，得知：真空度对总评值影响最大，且总评值随真空度的减小而增大。根据模型预测在真空度0.2，乙醇体积百分比55%，提取时间16 min条件下，总评值最高。

⑥. 工艺验证

根据优化试验的结果，按照软件预测的最佳提取工艺条件进行了3次平行实验，结果穿心莲内酯的相对提取率平均为148.4%，脱水穿心莲内酯的相对提取率平均为127.1%，浸膏得率为9.0%，与预测值无显著性差异。

表5    3次平行验证试验数据

基于上述研究，本发明所述真空度调控提取穿心莲的最佳工艺条件是：

穿心莲药材不粉碎，以含水的乙醇为提取溶剂，所述提取溶剂中乙醇体积百分比为55%，所述提取溶剂与穿心莲的重量比为12:1，真空度0.2，加热，保持所述提取溶剂沸腾，提取1次，提取时间16 min。

本发明比较优选的工艺条件是：

穿心莲药材不粉碎，以含水的乙醇为提取溶剂，所述提取溶剂中乙醇体积百分比为50-70%，所述提取溶剂与穿心莲的重量比为10-15:1，真空度0.2-0.4，加热，保持所述提取溶剂沸腾，提取1次，提取时间10-25 min。

在上述范围内，真空调控提取穿心莲药材具有与常规提取相似或更好的提取效果，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的转移率显著提高，且显著缩短提取时间，大大降低能源消耗。

 

 (二) 真空度调控提取与传统提取工艺比较

1. 样品制备

1）真空度调控提取（本发明最优选的提取方法）：准确称取穿心莲药材10 g，置于圆底烧瓶中，搭建好回流装置，12倍量55%乙醇，调节体系真空度为0.2，回流提取16 min，趁热过滤，滤液冷却至室温，定容于250 ml容量瓶中。

2）常规回流提取：准确称取穿心莲10 g，置于圆底烧瓶中，搭建好回流装置，12倍量85%乙醇，回流提取2次，每次2 h，趁热过滤，滤液冷却至室温，定容于500 ml容量瓶中。

    上述提取液分别按照本发明所述的含量测定方法测定其中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量。以常规回流提取液中穿心莲和脱水穿心莲的含量为基准（100%），计算真空度调控提取和改良常压回流提取的提取液中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的相对含量率，结果见表6。

表6 几种提取方式对穿心莲有效成分转移率的影响比较

由表6可知，真空度调控提取工艺与常规回流提取相比，能提高穿心莲活性成分转移率的同时，缩短提取时间，降低活性成分的降解，提高产能。试验结果表明，适当的提高体系的真空度能明显促进穿心莲药材活性成分的传质，强化溶质的溶出。从能量消耗方面比较本发明所述真空度调控提取和常规提取，结果见表7。

表7 真空度调控提取与常规回流提取能耗量比较

真空度调控提取比常规提取缩短提取时间15倍，电能消耗仅为常规提取的7.2 %，节约乙醇3.1倍。且本发明所述的真空范围，企业现有的生产条件都能满足，无需对设备进行大规模的改造，且不涉及制备方法的差异。本发明提取方法，工艺简单、成本低廉，对保护环境具有积极意义，可大规模应用生产。因此，相较常规提取方法，本发明所述真空度调控提取方法大大节约能源，对降低成本和保护环境具有积极意义，大规模应用于生产，将带来巨大的社会和经济效益。

本发明具有如下优点：

1.        保护热敏性有效成分。通过精确调控体系真空度，显著缩短提取时间，防止穿心莲内酯类成分长时间煎煮散失。本发明通过一套实验方案，选取适宜的提取工艺，真空度调控，提高穿心莲内酯类成分的转移率的同时避免药效成分长时间煎煮而热解。

2.        快速提取，大大提高提取效率。依据扩散机理，提取实质是溶质从药材内部（固相）扩散到外部溶剂（液相）的传质过程。通过对体系真空度调控：一方面挟带溶质的内部渗透液与溶剂主体呈对流扩散，强化提取传质过程（内扩散），提高内扩散速率，缩短溶质浸出时间；另一方面降低体系压力，提高体系真空度，在气压和温度的同时作用下，溶剂内部分子不断汽化，气泡迅速膨胀、破裂，借助溶剂沸腾上升的助力不断向四周稀溶液主体扩散，从而扩大浓度梯度，加速传质过程，强化药材外扩散，内外结合，使细胞内有效成分得以快速溶出，促进提取传质过程的运行，提高提取效率，实现快速提取。与常规提取相比，本发明所述真空度调控提取，使穿心莲内酯的提取率提高了48.4%，脱水穿心莲内酯提取率提高了28.1%。

3.        操作简化，大大节约能耗量。本发明的最优提取方案为：12倍料液重量比，55%乙醇，提取1次，真空度0.2，提取时间16 min，与常规提取相比，缩短提取时间15倍，仅为常规提取时间的6.6%，耗电量仅为常规提取的7.2%，相较常规提取节约乙醇用量3.1倍。

4.        生产设备简单，不需要特殊的设备，在不改变原有生产工艺的条件下仅增加一个压力控制装置，具有改装方便，可实现大批量工业化生产的优点。

附图说明

图1是本发明所述真空度调控提取法得到的穿心莲提取液的HPLC图谱，其中1号吸收峰为穿心莲内酯，2号吸收峰为脱水穿心莲内酯。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作详细说明。但是，本发明并不限于下述实施例。

实施例中所用的原料、试剂等，都是市售商品。

 实施例1  真空度调节提取穿心莲

准确称取穿心莲药材10 g，穿心莲药材不粉碎，置于圆底烧瓶中，加入120ml含水的乙醇为提取溶剂，所述提取溶剂中乙醇体积百分比为55%，真空度0.2，其对应的压力为800 mbar，加热回流提取16 min。趁热过滤，5倍药材量溶剂清洗药渣，洗液与所述滤液合并，即得真空度调节穿心莲提取液。

所述提取液冷却至室温，定容于250 ml容量瓶中。量取25 ml提取液于烘干至恒重的蒸发皿中，蒸发皿于100℃水浴上挥干溶剂后，置于烘箱中，105℃干燥至恒重，放置于干燥器中冷却至室温后，称重，计算浸膏收率。另取滤液5 ml用8000转/min离心10 min，取上清液，0.45 um微孔滤膜滤过，采用HPLC方法测定提取液中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量。

本实施例得到浸膏0.9g，其中含穿心莲内酯62.6mg，脱水穿心莲内酯19.3mg。经计算得到穿心莲内酯的相对提取率为148.4%，脱水穿心莲内酯的相对提取率为127.1%，浸膏收率为9%。

 实施例2  真空度调节提取穿心莲

准确称取穿心莲药材10 g，置于圆底烧瓶中，加入15倍量70%乙醇，搭建好回流装置，调节体系的真空度为0.2，其对应的压力为800 mbar，回流提取10 min，趁热过滤，5倍药材量溶剂清洗药渣，洗液与所述滤液合并，即得真空度调节穿心莲提取液。

所述提取液冷却至室温，定容于250 ml容量瓶中。量取25 ml提取液于烘干至恒重的蒸发皿中，蒸发皿于100℃水浴上挥干溶剂后，置于烘箱中，105℃干燥至恒重，放置于干燥器中冷却至室温后，称重，计算浸膏收率。另取滤液5 ml用8000转/min离心10 min，取上清液，0.45 um微孔滤膜滤过，采用HPLC方法测定提取液中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量。

本实施例得到浸膏0.814g，其中含穿心莲内酯53.1 mg，脱水穿心莲内酯16.9mg。经计算得到穿心莲内酯的相对提取率为125.8%，脱水穿心莲内酯的相对提取率为111.1%，浸膏收率为8.14%。

 实施例3  真空度调节提取穿心莲

准确称取穿心莲药材10 g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量50%乙醇，搭建好回流装置，调节体系的真空度为0.4，回流提取40 min，趁热过滤，3倍药材量溶剂清洗药渣，洗液与所述滤液合并，即得真空度调节穿心莲提取液。

所述提取液冷却至室温，定容于250 ml容量瓶中。量取25 ml提取液于烘干至恒重的蒸发皿中，蒸发皿于100℃水浴上挥干溶剂后，置于烘箱中，105℃干燥至恒重，放置于干燥器中冷却至室温后，称重，计算浸膏收率。另取滤液5 ml用8000转/min离心10 min，取上清液，0.45 um微孔滤膜滤过，采用HPLC方法测定提取液中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量。

本实施例得到浸膏0.994g，其中含穿心莲内酯54.73 mg，脱水穿心莲内酯19.45 mg。经计算，穿心莲内酯的相对提取率为129.69%，脱水穿心莲内酯的相对提取率为127.99%，浸膏收率为9.94% 。

 实施例4    真空度调节提取穿心莲

准确称取穿心莲药材10 g，置于圆底烧瓶中，加入12倍量50%乙醇，搭建好回流装置，调节体系的真空度为0.2，回流提取25 min，趁热过滤，5倍药材量溶剂清洗药渣，洗液与所述滤液合并，即得真空度调节穿心莲提取液。

所述提取液冷却至室温，定容于250 ml容量瓶中。量取25 ml提取液于烘干至恒重的蒸发皿中，蒸发皿于100℃水浴上挥干溶剂后，置于烘箱中，105℃干燥至恒重，放置于干燥器中冷却至室温后，称重，计算浸膏收率。另取滤液5 ml用8000转/min离心10 min，取上清液，0.45 um微孔滤膜滤过，采用HPLC方法测定提取液中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量。

本实施例得到浸膏0.934g，其中含穿心莲内酯62.61 mg，脱水穿心莲内酯20.12 mg；经计算穿心莲内酯的相对提取率为148.37%，脱水穿心莲内酯相对提取率为132.37%，浸膏收率为9.34% 。

Claims (9)

1.一种真空度调控辅助提取穿心莲活性成分的方法，其特征在于，将穿心莲置于封闭的提取容器中，以含水的乙醇为提取溶剂，提取溶剂与穿心莲的重量比为5-20:1，调控体系的真空度为0.2-0.6，加热，保持所述提取溶剂沸腾，提取1次，提取时间10-40 min，趁热过滤，滤液浓缩。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取体系的真空度为0.2-0.4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂中乙醇的体积百分比为50%-90%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂中乙醇的体积百分比为50%-70%。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述提取时间为10-25 min。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂与穿心莲的重量比为10-15:1。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，穿心莲药材不粉碎。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，穿心莲药材不粉碎，置于封闭的提取容器中，以含水的乙醇为提取溶剂，所述提取溶剂中乙醇体积百分比为55%，所述提取溶剂与穿心莲的重量比为12:1，真空度0.2，加热，保持所述提取溶剂沸腾，提取1次，提取时间16 min，趁热过滤，滤液浓缩。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，提取结束，过滤后，再用2-8倍药材重量的所述提取溶剂清洗药渣，洗液与所述滤液合并。

Images